产esbls肺炎克雷伯菌基因型分析

产 ESBLs 肺炎克雷伯菌基因型分析 韦洁宏，黄烈，林广城，刘键，杨来智，陆学东* （广东医学院附属深圳市福田人民医院检验医学部，深圳 518033） 摘 要：目的 分析肺炎克雷伯菌临床分离株产超广谱-内酰胺酶(ESBLs)的主要基因 型。方法 用表型确定的临床分离产ESBLs的肺炎克雷伯菌34株，分别用 TEM、SHV 、CTX-M-1、CTX-M-2和CTX-M-9扩增引物进行聚合酶链反应 (PCR)扩增， 并对PCR产物进行序列分析。结果 PCR扩增结果显示TEM、SHV、CTX-M-1、CTX- M-2和CTX-M-9的阳性率分别为47.06、85.29、26.47、32.35和52.94，CTX-M 型总阳性率为88.24%，序列分析证实扩增为目的产物。结论 34株ESBLs肺炎克雷伯菌 的主要基因型是CTX-M型和SHV型，且同时携带2种以上基因的菌株占所测菌株的82.35%， 需引起临床的高度重视。 关键词：肺炎克雷伯菌；超广谱 -内酰胺酶；基因分型 Genotype analysis of extended-spectrum -lactamases(ESBLs) producing Klebsiella pneumoniae isolated from clinic WEI Jie-hong, HUANG Lie, LIN Guang-cheng, LIU Jian, YANG Lai-zhi and LU Xue-dong (Laboratory Department of The Affiliated shenzhen Futian Hospital of the Medical College of Guangdong ,Shenzhen 518033, Guangdong, China) Abstract:Objective To investigate the genotypical characteristics of extended-spectrum - lactamases(ESBLs) producing clinical isolates of Klebsiella pneumoniae. Methods 34 strains of ESBLs producing isolates of Klebsiella pneumoniae with confirmed phenotype were used. PCR were performed to them by using primers specific for TEM,SHV,CTX-M-1,CTX-M-2 and CTX-M-9 respectively，and the PCR products were confirmed to be objective products by DNA sequencing. Results The PCR positive rate was 47.06% for TEM, 85.29% for SHV, 26.47% for CTX-M-1, 32.35% for CTX-M-2, and 52.94% for CTX-M-9 respectively. Among them, the CTX-M-type was 88.24% totally. Conclusions CTX-M and SHV were the prevalent genotype of 34 ESBLs producing isolates of Klebsiella pneumoniae. Among all strains, 82.35% carry more than 2 ESBLs genes. Key wolds:Klebsiella pneumoniae;Extended-spectrum beta-lactamases(ESBLs);Gene typing 基金项目：深圳市科技计划重大项目（编号：JH200505260279A） 作者简介：韦洁宏（1983-）,男，本科，检验技师，从事病原微生物分子生物学检验工作。 *通讯作者：陆学东，男，研究员，广东医学院硕士生导师，长期从事病原微生物分子生物学研究工 作。 联系方式E-mail 地址： 超广谱-内酰胺酶 (Extended-Spectrum Beta-Lactamases ESBLs)是由质粒介 导的能赋予细菌对多种- 内酰胺类抗生素耐药的一类酶，它主要由革兰阴性杆 菌产生 1。它的产生及播散给临床抗感染治疗带来极大挑战，是新一代-内酰 胺类抗生素耐药的主要原因。其中肺炎克雷伯菌是临床最常见的产ESBLs菌。 为此，我们以我院分离的阳性菌株为对象，对其进行基因分型，为临床治疗、 预防产ESBLs 细菌引起的感染提供一定的参考依据。 1 材料和方法 1.1 菌株来源：取自我院微生物实验室2005年4月至2006年6月期间的临床分离 株，所有菌株均经法国生物梅里埃ATB Expression细菌分析系统鉴定。采用美 国国家临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐的纸片扩散表型确证方法 2，筛 选出34株产ESBLs 菌株。 1.2 主要化学试剂：DNAfast200小量基因组DNA快速抽提试剂 (飞捷生物产品)； TaqDNA聚合酶、dNTPs及PCR Mix 缓冲体系(Fermentas 2X PCR Master Mix)； 引物（上海生工合成）；DNA marker (天为时代产品 )；琼脂糖(英国OXOID 产品);SYBR Green 1(美国Molecular Probes产品) 1.3 细菌质粒DNA的提取：所有产酶菌株细菌质粒DNA 采用飞捷生物 DNAfast200试剂，严格按照说明书操作提取。 1.4 PCR扩增：PCR引物及反应条件见表1。PCR 体积为 50L：含2X PCR Master Mix 25L，DNA模板1L，上、下游引物各1L，H 2O 23L。 1.5 PCR产物电泳及测序：PCR 产物在1的琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系 统下观察结果并照相，然后将扩增产物送上海生工公司测序，结果与Gene Bank 颁布的序列进行比较分析。 表1 PCR引物及反应条件 基因名称 引物序列 反应条件 扩增片段 TEM F:5ATAAAATTCTTGAAGAC 96 3min (94 1min-50 40s-72 1076bp R:5TTACCAATGCTTAATCA 1.5min) 40cycles 72 5min SHV F:5GGGTTATTCTTATTTGTCGC 同上 930bp R:5TTAGCGTTGCCAGTGCTC CTX-M-1 F:5CGGTGCTGAAGAAAAGTG 同上 354bp R:5TACCCAGCGTCAGATTAC CTX-M-2 F:5ACGCTACCCCTGCTATTT 同上 780bp R:5GCTTTCCGCCTTCTGCTC CTX-M-9 F:5GCAGATAATACGCAGGTG 同上 393bp R:5CGGCGTGGTGGTGTCTCT 2 结果 2.1 PCR扩增结果及产物分析：产ESBLs肺炎克雷伯菌 5种耐药基因PCR 扩增片 段凝胶分析见图1，扩增片段大小与设计一致。所有5种耐药基因PCR扩增片段 经核酸测序及GenBank库对比，与相应基因的同源性均大于97%。 图1 产ESBLs肺炎克雷伯菌TEM、SHV、CTX-M-1、CTX-M- 2、 CTX-M-9基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果 注 M： DNA marker ；l：CTX-M-9；2：CTX-M- 2；3：CTX-M-1； 4：SHV； 5：TEM。 2.2 ESBLs 基因型分析：34 株产 ESBLs 肺炎克雷伯菌中含耐药基因 TEM 型 16 株、SHV 型 29 株、CTX-M 型 30 株，含多种耐药基因菌株达 28 株（占 82.35%）。详细基因型分布见表 2。 表 2 34株肺炎克雷伯产ESBLs的基因型分布 基因型 菌株数 百分率(%) TEM+SHV+CTX-M 13 38.24 TEM+SHV 1 2.94 TEM+ CTX-M 2 5.88 SHV+CTX-M 12 35.29 SHV 3 8.82 CTX-M 3 8.82 总数 34 100 2.3 CTX-M 基因型分类：在所检出的 30 株含 CTX-M 型阳性菌株中，CTX-M-1 型 9 株(占 26.47) ，CTX-M-2 型 11 株( 占 32.35)，CTX-M-9 型 18 株( 占 52.94)，其中有 3 株共同带有 CTX-M-1 和 CTX-M-2 型基因，5 株共同带有 CTX-M-2 和 CTX-M-9 型基因，其余 22 株 CTX-M 型菌株均带有单个 CTX-M 型基因。 3 讨论 ESBLs 为 Bush 2be 型，Ambler A 类酶，其水解的底物包括青霉素类、第 一至三代头孢菌素(部分酶可水解第四代头孢菌素)、单环 -内酰胺类抗菌药物， 但不能水解 -内酰胺/- 内酰胺酶抑制剂复合药物、头霉素类及碳青酶烯类抗菌 药物 3。ESBLs 基因型有 TEM 型、SHV 型、非 TEM 非 SHV 型(包括 CTX-M 型和 OXA 型) 等，大多数为 TEM 型和 SHV 型，由广谱酶 TEM-1/TEM-2 和 SHV-1 的酶活性区经过 1-4 个关键氨基酸突变衍生而来是新型广谱抗生素选 择性压力的结果。CTX-M 型 ESBLs 自 20 世纪 90 年代初以来不断被发现，该 型 ESBLs 以水解头孢嚷肟、头孢曲松的活性显著高于头孢他啶、氨曲南为特征 4。产超广谱 -内酰胺酶的细菌呈世界性流行，但不同地区流行的 ESBLs 基因 型不同。其中 TEM 和 SHV 型是目前世界上大多数国家如美国、英国、法国等 欧美国家流行的主要基因型 5-6，CTX-M 型多见于南美、东欧和亚洲等国家， 而我国大陆则以 CTX-M 型为主并兼有 SHV 型报道 7-8。本项研究主要基因型 为 CTX-M 型（88.24% ），其次为 SHV 型(85.29)和 TEM 型(47.06)，其中 CTX-M 型分类有 CTX-M-9(52.94)、CTX-M-2( 32.35)和 CTX-M-1(26.47)， 实验结果与我国文献报道基本一致。ESBLs 株分离率有所差异，这种差异可能 与不同医院、地区使用第三代头孢菌素的种类、数量及时间不同而造成对 ESBLs 的筛选及诱导不同有关。另外现在已知绝大多数 ESBLs 基因定位于宿主 菌染色体外遗传物质-质粒的 DNA 序列中，质粒对于介导 ESBLs 基因在同种属 或不同种属革兰阴性菌的转移中发挥着主导作用，所以不同地区基因型的差异 也可能与不同的质粒参与介导 ESBLs 基因转移有关。由于我国使用第三代头孢 菌素主要为头孢噻肟而国外为头孢他定，也导致我国 ESBLs 基因分布主要为 CTX-M 的结果，并由本研究 34 株产 ESBLs 肺炎克雷伯菌原始药敏结果（头孢 噻肟耐药率 77.18%、头孢他定耐药率 54.29%）进一步证实。 从本研究基因型分布显示34株产ESBLs肺炎克雷伯菌中同时携带4种基因有 3株（8.82% ）， 同时携带3种基因有15株（44.12%），同时携带2种基因有10株 （29.41%），单独携带1种基因有6株（17.65%）。总之，同时携带2种基因以 上有28株占总数的82.35%，从基因水平显示了产ESBLs细菌耐药基因的复杂性。 鉴于ESBLs基因型流行的复杂和多样化且有区域性流行，不同地区有必要对本 地区进行监测，以为预防、控制和治疗提供依据。因此必须及时、准确的对 ESBLs介导的耐药性及其耐药基因进行检测，以指导临床合理使用抗生素，控 制耐药菌株的蔓延。 参考文献： 1 Pitout JD ，Thomson KS ，Hanson ND ，et al. beta - Lactamases responsible for resistance to expanded - spectrum cephalosporins in Klebsiella pneumoniae ，Escherichia coli ，and Proteus mirabilis isolates recovered in South Africa. Antimicrob Agents Chemother ，1998 ，42 (6) ：1350-1354 2 National Committee for Clinical Laboratory StandardPerformance standard for antimicrobial susceptibility testing；Twelfth informational supplement(M100- S12)NCCLS，2002，Wayne，Pennsylvania 3 Bradford PAExtended-spectrum -lactamases in the 21st Century：characterization，epidemiology ，and detection of this important resistance threatJClin Microbiol Rev，