反向pcr操作要点

操作中的注意事项及解释 1. 为提高分子间连接的效率,连接反应中 cDNA 的浓度要低,因为高浓度的 cDNA 可能会提高非同源连接水平,从而产生非特异扩增. 2. 成环的双链 cDNA 进行裂解和变性比较重要,因为环状双链 DNA 分子易于形 成超螺旋而不利于 PCR 反应,它只可以扩增出较短的 DNA 片段. 3. 现认为下列方法可在成环的 DNA 分子中引入切割: 3.1 最常用的简便办法是煮沸,但因为某些环状双链 DNA 分子不时形成不太普 遍的二级结构,使得该方法在使环状双链 DNA 分子变性和引入切刻时并不很奏 效. 3.2 第二种办法是选用核酸内切酶进行消化,理想的限制位点应位于已知序列内, 但在多数情况下,由于 cDNA 未知已域内酶的限制图谱并不清楚,所以很难选择 用何种限制酶. 3.3 如果没有合适的限制性酶可用,也可以尝试使用 EDTA-寡核苷酸-介导的特异 裂解办法.T 处连有 EDTA-Fe 的寡核苷酸通过与双链 DNA 形成三股螺旋而特异 地结合于双链 DNA 某一区段,这样就可以在结合位点裂解双链 DNA. 4. 碱变性法已成功地用于制备 PCR 和测序用质粒 DNA,该方法也可以有效地使 环化的双链 cDNA 实现变性. 5. 加入 T4 RNA 连接酶或氯化六氨合高钴可以提高 T4 DNA 连接酶催化的双链 DNA 平齐末端连接的效率. 6. IPCR 法可以有效地用于快速扩增任何已知片段 cDNA 或基因组 DNA 两侧的 未知序列,它不需要构建或筛选 DNA 文库来获得未知序列信息.有些重组的噬菌 体或质粒在细菌内部不稳定,所以扩增后的文库可能会丢失这些部分,然而 PCR 法不存在这个问题. 详细资料 一,DNA 的酶切 已知序列和两侧未知序列的酶切图及环化的 DNA 大小是影响 IPCR 限制性内切 酶选择的关键.多数情况下,可以通过对已知序列的分析或用 DNA 印迹杂交法确 定限制性酶切位点和片段长度来决定选择哪种内切酶.为了获得已知序列上下游 的未知序列可用一种或多种在已知序列内没有切点的限制性内切酶消化样品 DNA,这时,如果产生的切段末端不互补,可以用 Klenow 或 T4 聚合酶填平末端后 再行连接.因为 PCR 扩增长度所限,所以要求酶切到的目的片段长度不得超过核 心区的 2-3kb. 选择好合适的内切酶后,用常规酶切法消化染色体,消化产生可直接用于下述连接 反应.但某些情况下,如已知序列拷贝数很高,而且预计扩增未知序列大小不明时, 应先将已知序列分离出来. 二,酶切片段的环化 用 1g 的酶切 DNA 进行连接环化就可用于分析,环化前先用酚-氯仿抽提,乙醇沉 淀纯化酶切片段,晾干沉淀的 DNA 片段,用连接缓冲液(50mmol/L Tris-HCl, pH7.4; 10mmol/L MgCl2; 10mmol/L DTT 和 1mmol/L ATP)溶解.浓度应小于 2g/ml.然 后加入 T4 DNA 连接酶 0.02U/mL (Weiss 单位),15放置 16 小时. 另外,酶切片段也可以不用酚-氯仿法来灭活内切酶而用连接缓冲液稀释 5 倍以上 的方法进行,再加入连接酶进行环化反应,但这时,酶切体积要小. 三,PCR 向环化 DNA 混合液加入盐后用乙醇沉淀,并溶于 10l 去离子水.环化 DNA 分子 在标准 PCR 应体系中可用与已知序列两侧互补的反向引物来扩增未知序列.环 化分子扩增时也可以不用酶切线性化,因为数个循环后就可以产生线性模板分子. 用于 IPCR 的引物也可在 5端修饰后进行不同目的的扩增. 四,IPCR 的应用 最初 IPCR 法是用来快速扩增任何一个已知基因片段两侧未知序列,比较适于扩 增中度重复 DNA 序列.也可以用 YAC 载体的一个臂中的已知序列来扩增插入片 段的特异末端,得到的定向特异 DNA 片段可用作杂交探针来筛选 YAC 文库中的 重叠和紧邻克隆片段. 五,IPCR 技术的局限性 由于 IPCR 的侧翼序列未知 ,因此需选择合适的内切酶 ,但许多常用的内切酶在插 入序列上有切点而且在载体上不合适位置也有切点,因此给酶的选择带来许多困 难. 参考文献 Bruce A. White. et al. PCR CLONING PROTOCOLS, 289294. 林万明,PCR 技术操作和应用指南,1993 年第一版,6870. 原 理 反 向 PCR 可 用 于 研 究 与 已 知 DNA 区 段 相 连 接 的 未 知 染 色 体 序 列 ， 因 此 又 可 称 为 染 色 体 缓 移 或 染 色 体 步 移 。 这 时 选 择 的 引 物 虽 然 与 核 心 DNA 区 两 末 端 序 列 互 补 ， 但 两 引 物 3端 是 相 互 反 向 的 。 扩 增 前 先 用 限 制 性 内 切 酶 酶 切 样 品 DNA， 然 后 用 DNA 连 接 酶 连 接 成 一 个 环 状 DNA 分 子 ， 通 过 反 向 PCR 扩 增 引 物 的 上 游 片 段 和 下 游 片 段 ； 现 已 制 备 了 酵 母 人 工 染 色 体 （ YAC） 大 的 线 状 DNA 片 段 的 杂 交 探 针 ， 这 对 于 转 座 子 插 入 序 列 的 确 定 和 基 因 库 染 色 体 上 DNA 片 段 序 列 的 识 别 十 分 重 要 。 反 向 PCR 原 理 图 编 辑 本 段 不 足 之 处 该 方 法 的 不 足 是 ： 需 要 从 许 多 酶 中 选 择 限 制 酶 ， 或 者 说 必 须 选 择 一 种 合 适 的 酶 进 行 酶 切 才 能 得 到 合 理 大 小 的 DNA 片 段 。 这 种 选 择 不 能 在 非 酶 切 位 点 切 断 靶 DNA。 大 多 数 有 核 基 因 组 含 有 大 量 中 度 和 高 度 重 复 序 列 ， 而 在 YAC 或 Cosmid 中 的 未 知 功 能 序 列 中 有 时 也 会 有 这 些 序 列 ， 这 样 ， 通 过 反 向 PCR 得 到 的 探 针 就 有 可 能 与 多 个 基 因 序 列 杂 交 。 编 辑 本 段 其 他 用 途 利 用 反 向 PCR 可 对 未 知 序 列 扩 增 后 进 行 分 析 ， 探 索 邻 接 已 知 DNA 片 段 的 序 列 ， 并 可 将 仅 知 部 分 序 列 的 全 长 cDNA 进 行 分 子 克 隆 ， 建 立 全 长 的 DNA 探 针 。 适 用 于 基 因 游 走 、 转 位 因 子 和 已 知 序 列 DNA 旁 侧 病 毒 整 合 位 点 分 析 等 研 究 。 用 传 统 的 缓 冲 液 和 其 他 提 供 者 推 荐 的 条 件 裂 解 DNA。 反 向 PCR 所 扩 增 的 片 段 的 大 小 由 PCR 扩 增 片 段 的 大 小 决 定 ， 目 前 ， PCR 扩 增 的 实 际 上 限 为 3-4kb。 在 许 多 情 况 下 ， 首 先 需 要 进 行 Southern 杂 交 来 确 定 内 切 酶 用 以 产 生 大 小 适 于 环 化 及 反 向 PCR 的 片 段 的 末 端 片 段 。 能 裂 解 核 心 区 的 内 切 酶 使 反 向 PCR 只 能 扩 增 引 物 所 定 模 板 (依 赖 于 引 物 )的 上 游 或 上 游 区 ， 而 不 裂 解 核 心 区 的 酶 则 使 两 上 边 侧 序 列 都 扩 增 ， 并 带 有 由 内 切 酶 和 环 化 类 型 决 定 的 接 点 (例 如 ， 互 补 突 头 连 接 与 钝 头 连 接 )。 对 于 扩 增 左 翼 或 右 翼 序 列 ， 初 试 时 最 好 靠 近 识 别 上 个 碱 基 位 位 的 酶 ， 并 已 知 在 核 心 区 有 其 方 便 的 裂 解 位 点 。 如 果 用 反 向 PCR 从 含 有 大 量 不 同 的 克 隆 片 段 的 同 一 载 体 中 探 测 杂 交 探 针 ， 建 议 事 先 在 载 体 中 引 入 合 适 的 酶 切 位 点 。 用 T4 连 接 酶 在 稀 DNA 浓 度 下 环 化 更 容 易 形 成 单 环 。 在 一 些 实 验 中 ， 为 产 生 对 反 向 PCR 大 小 适 当 的 DNA 片 段 需 要 两 种 内 切 酶 ， 但 这 样 所 产 生 的 片 段 末 端 则 不 适 于 连 接 ， 环 化 前 需 用 Klenow 或 噬 菌 体 T4DNA 聚 合 酶 修 理 (钝 化 )。 连 接 前 ， 需 用 酚 或 热 变 性 使 内 切 酶 失 活 。 聚 合 酶 链 反 应 条 件 与 经 典 所 用 的 相 同 ， 例 如 ， 94 -30 秒 变 性 ， 58 - 30 秒 引 物 退 火 ， Taq 聚 合 酶 70 延