自身抗体课件张

自身抗体检测及临床应用价值 张虹 自身抗体是诊断自身免疫性疾病的重要依 据 自身免疫泛指机体免疫系统受某些内因、 外因或遗传等因素作用产生针对自身正常或变 性的组织、器官、细胞、蛋白质或酶类等自身 抗原发生的免疫应答反应，出现自身抗体或自 身致敏淋巴细胞的现象。 因自身免疫招致组织器官损伤或功能障碍 所致疾病称自身免疫性疾病(AID)。 自身抗体是自身免疫性疾病的重要标志。 自身免疫性疾病的共同特征 1.可以有诱因，也可以无诱因，但多数病因不清 。 2.患者以女性居多，随年龄增加发病率有所增加 。 3.有遗传趋向。 4.血清中有自身抗体或体内有针对自身组织细胞 的致敏淋巴细胞。自身抗体在不同的自身免疫 病中有交叉和重叠现象。 5.疾病的重叠现象,即一个病人可同时患一种以上 自身免疫病。 6.自身免疫病一般病程较长,病情发展和缓解呈反 复交替现象,易成为终生痼疾。免疫抑制剂治疗 可取得一定疗效。 自身抗体的意义 n1.可帮助临床诊断，评价疗效，估计预 后。 n2.自身抗体是自身免疫性疾病特征 n -称标志抗体， n*标志抗体检出有助于临床医生确诊疾病 n*自身抗体的检测有助于临床医生更早发 现疾病 自身抗体可以在AID临床发病前检测 到 nPBC患者任何临床症状前10年可检测到 AMA（抗线粒体抗体） nRA患者在临床症状前4-5年检测到抗 CCP抗体 自身抗体的分类 抗细胞内抗原的抗体: 抗细胞核成分的抗体(ANA) 抗细胞浆成分的抗体(ANCA) 抗细胞膜成分的抗体: 抗磷脂成分抗体 抗细胞表面抗原抗体: 抗红细胞Rh抗原 抗细胞外抗原的抗体: RF、凝血因子 n抗核抗体谱 n抗DNA抗体 n抗核糖体P抗体 n抗组蛋白抗体 n抗ENA抗体 n抗Sm抗体 n抗U1RNP抗体 n抗Ro/抗SSA抗体 n抗La/抗SSB抗体 n肌炎特异性抗体（MSA） 抗合成酶抗体 抗SRP抗体 抗Mi2抗体 n与系统性硬化相关的抗体 抗拓扑异构酶1抗体 抗着丝点抗体 抗核仁抗原的抗体 n抗中性粒细胞胞浆抗体 nC-ANCA nP-ANCA n抗磷脂抗体 n狼疮抗凝物 n抗心磷脂抗体 n2糖蛋白 n抗内皮细胞抗体 n类风湿关节炎相关抗体 类风湿因子（RF） 抗CCP抗体 抗核周因子抗体 n自身免疫性肝病相关抗体 SMA，LKM，SLA， AMA， Sp100,gp210等 抗核抗体（ANA) 抗核抗体 （antinuclear antibody，ANA ） n传统定义：将针对细胞核内成分的抗体称为 ANA。 现在对ANA靶抗原的理解已从细胞核扩大到整 个细胞。是指抗核酸（nucleic acid）和核蛋 白（nucleoprotein）抗体的总称。 ANA的检测方法 n间接免疫荧光法（IIF）:现多以Hep-2细胞 （人喉癌上皮细胞）为底物（Ag），抗原 抗体结合，加入荧光标记的二抗体。 n用荧光显微镜观察ANA荧光着染强度和免 疫荧光图形（核型）。 n稀释待检血清可检测ANA效价 ANA常见核型 核型 对应抗原 相关疾病 均质型 组蛋白和DNA 所有的CTD及药物性狼疮 斑点型 ENA SLE、SSc、pSS、MCTD 周边型 n-DNA SLE、也见于SSc 核仁型 RNA多聚 酶 SSc、也见于SLE、pSS SCL-70 着丝点型 染色体 CREST syn（局限性系统硬化症 ） ANA的检测方法 n酶免疫测定试验（ELISA-ANA) n商品化的试剂盒，包括吸附有抗原的固 相（微孔板）、酶标记的检测抗体、洗 液、底物、终止液及阴阳性质控物。 n通过酶标仪读取OD值，跟cutoff值比较 来界定阴性和阳性。 抗核抗体的分类 （1）抗ENA抗体 可提取性核抗原（extractable nuclear antigens，ENA ） （2）抗组蛋白抗体 （3）抗DNA抗体 抗双链DNA抗体（抗dsDNA） 抗单链DNA抗体（抗ssDNA）。 （4）抗着丝点抗体 （5）抗核小体抗体 ENA 不同的自身免疫病可产生不同的抗ENA抗体。 通过检测抗ENA抗体的类型及其组合，可综合 诊断自身免疫病的类型。 n抗Sm抗体 n抗U1RNP抗体 n抗Ro/抗SSA抗体 n抗La/抗SSB抗体 n肌炎特异性抗体 JO-1 n与系统性硬化相关的抗体SCL-70 ENA检测方法 n双向免疫扩散 n对流免疫电泳 n斑点酶免疫技术 n免疫印迹技术 免疫印迹技术（最常用） n欧蒙印迹法试剂盒用于体外定性检测 血清或血浆中的人抗nRNP、Sm、SS-A （天然SS-A和Ro-52）、SS-B、Scl-70 、Jo-1、CENP B、dsDNA、核小体、 组蛋白和核糖体P蛋白等14种不同抗原 lgG类抗体。 免疫印迹技术(IBT) 1.将提取的抗原,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳, 然 后将各抗原区带转印至硝酸纤维膜上制成膜条 。 2.将待测血清加在已切成细条的硝酸纤维膜上, 3. 当再加入酶标记抗人IgG抗体, 4. 再加入酶的底物,出现显色反应。 凡有抗体与膜上抗原结合的位置,均会因酶促反 应而显色。 参照此时抗原区带的分子量及各区带的相应 位置,可辨读出各特异性抗体. 抗ENA抗体的主要类型及临床意义 n抗Sm抗体 抗Sm是SLE的特异性标志之一，对SLE高度特异（超过 90%），约5%-40%患者阳性，同时伴抗DS-DNA抗体和U1- RNP抗体阳性。 抗u1-nRNP抗体 n抗nRNP(nuclear RNP)：以抗核内的核糖核蛋白而得名 。临床上应用较多的是u1RNP抗体 。 n抗u1RNP抗体在混合性结缔组织病（MCTD）中几乎均为 阳性，且其滴度很高；是区分结缔组织病和非结缔组织 病的有力指标。2530的SLE患者存在该抗体，一般 与抗Sm抗体一同出现。 n抗u1RNP抗体阳性的病人，常有双手肿胀、雷诺现象、 肌炎和指（趾）端硬化。 抗SSA抗体 抗SSA/Ro 抗体 与各类自身免疫性疾病相关，最常见于干燥综 合征（40-80%）。SLE（20-60%）与狼疮肾病 的发生相关。 抗天然SS-A（60kDa）抗体对SS和SLE的特异 性高。 抗Ro-52抗体 不具有疾病特异性，而且还可与抗Jo-1和RNP 抗体发生交叉反应。 既往认为抗SS-A靶抗原为分子量52KD和60KD，RO- 52和RO-60是同一大分子复合体，现在认为RO-52和RO- 60抗体并不属于同一抗体系统，两者是独立的抗体系统 ，而且具有不同的临床意义。 抗SSB/La抗体 n在原发性SS病人中，抗SSA/Ro和抗SSB/La阳 性率分别为60%和40%，它们是诊断干燥综合 征的血清学标志。 n抗SSB抗体较抗SSA抗体诊断干燥综合征更为 特异。 n另：SSA和抗SSB抗体阳性可造成新生儿狼疮 及婴儿心脏传导阻滞等先天性心脏病。 n抗SSA和抗SSB抗体常与血管炎、淋巴结肿大 、白细胞减少、光过敏、皮损、紫癜等临床症 状相关。 抗Jo-1抗体 n几乎仅见于或最常见于多发性肌炎/皮肌炎（ PM/DM）或PM/DM重叠综合征。 n存在于35至40的肌炎患者中。 n临床表现为：肌炎、间质性肺疾病、关节炎以 及常出现雷诺现象的一组临床表现的特征性； n患者的手指侧面常出现角化过度，并伴有脱屑 、裂纹和色素沉着，从而形成许多肮脏的横纹 。即“技工手”. n50至70发生间质性肺疾病 。 n肌炎常常难以通过治疗达到完全缓解。 SCL-70抗体 n抗拓扑异构酶1抗体（抗scl 70抗体）：存在于25 至75的患者；主要见于患有弥漫型硬皮病以及 存在系统性损害（特别是肺间质变）的患者。 n抗体滴度与疾病活动性无关。 抗DNA抗体 n已确认出两大类抗体特异性： 天然的双链DNA（dsDNA）： SLE患者的特征性标志 变性的单链DNA（ssDNA） 抗dsDNA抗体在SLE的发病机制中起重要作用，SLE并发 的狼疮性肾炎是由该抗体介导的免疫复合物病，抗 dsDNA抗体可形成多种冷沉淀而致血管炎，SLE肾炎 及典型的蝶形红斑均与该抗体有关。 抗dsDNA抗体诊断SLE的特异性可达95%100%，但其 敏感性仅为30%50%，因此抗dsDNA抗体阴性不能 排除SLE的诊断。 n抗体水平与疾病活动度相关，随着疾病活动的控制， 抗dsDNA抗体滴度可以下降或消失。 抗组蛋白抗体 （Anti-Histone Antibody，AHA） n组蛋白是染色质基本结构-核小体的重要组 成部分； n在药物性狼疮的患者中出现率很高（78- 95%）； n在多种结缔组织病中出现。 n服用异烟肼的病人中最高，但临床上并没 有出现狼疮的临床症状。 抗组蛋白抗体 组蛋白有H1,H2A,H2B,H3,H4亚型 抗H1 H2A H2B H3 H4 系统性红斑狼疮 + + + + + 长期服异烟肼 + + + + + 类风湿关节炎 + + + + + 抗核小体抗体（antinucleosome antibodies, AnuA） n核小体是染色体的功能亚单位，是DNA与组蛋白形成 的复合体，存在于细胞核中，核小体是SLE主要的自 身抗原； nAnuA对SLE诊断的敏感性和特异性分别为56.0%- 64.2%和97.0%-98.8%，敏感性优于抗dsDNA，是 SLE的标记抗体之一。 nAnuA可出现于SLE疾病进程的各个时期，并且是狼疮 肾炎的标记性抗体 。 nAnuA与抗dsDNA抗体可不同时出现，AnuA出现早于 抗dsDNA抗体，这对SLE的早期诊断更为有利。 核糖体P蛋白 抗核糖体P蛋白为SLE特异性自身抗体，检出 不高，通常为10%，该抗体与疾病的活动度 不相关。 抗着丝粒抗体 90的局限性系统性硬化症CREST综合征患 者存在该抗体；见于患有原发性或继发性雷 诺病的患者。 系统性红斑狼疮(SLE) 靶抗原阳性率(%) dsDNA标志性抗体 30-90 Sm标志性抗体 5-30 核糖体P蛋白标志性抗体 5-15 核小体标志性抗体 50-95 组蛋白 40-80 U1-nRNP 15-40 SS-A 20-60 SS-B 10-20 新生儿红斑狼疮（NEL） 靶抗原阳性率(%) SS-A 100 药物诱导的红斑狼疮（DIL） 靶抗原阳性率(%) 组蛋白 95 原发性干燥综合征（SS） 靶抗原阳性率(%) SS-A 40-95 SS-B 40-95 混合性结缔组织病（MCDT） 靶抗原阳性率(%) RNP 95-100 弥漫型进行性系统性硬化症 靶抗原阳性率(%) Scl-70标志性抗体 25-75 局限型进行性系统性硬化症 靶抗原阳性率(%) 着丝点 80-95 多发性肌炎和皮肌炎（PM/DM） 靶抗原阳性率(%) Jo-1 25-35 自身免疫性肝病相关抗体 是与自身免疫密切相关的特殊类型的肝病， 其诊断和治疗完全不同于一般的慢性病毒性肝炎 n自身免疫性肝炎 (AIH) n原发性胆汁性肝硬化 (PBC) n原发性硬化性胆管炎 (PSC) n自身免疫性胆管炎（AIC） n重叠综合征 每种自身免疫性肝病都具有特征性自身抗体谱， 自身抗体检测对自身免疫性肝病的诊断及鉴别具有 重要意义。 原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis, PBC） n女性； n 胆酶升高（ALP,r-GT）为主，碱性磷酸酶（ ALP）/AST3； n IgM明显升高,胆汁酸,血脂及胆固醇升高; n 肝内小胆管的非化脓性炎症和梗阻，淤胆；肝 内阻塞性胆汁性肝硬化； n 常合并其他自身免疫病如SS、桥本氏甲状腺 炎等。 抗AMA-M2（抗线粒体抗体） 该抗体为原发性胆汁肝硬化（PBC)的特异性指标，对 PBC特异性最强(95%),敏感性最高(95%)。可早于发 病10年查出抗体。 PBC诊断不及时危害大 nPBC早期隐匿，晚期疗效甚微。晚期确诊PBC患者死亡 率很高。 nPBC误诊率可高达90%。 最常见误诊为：慢性病毒性肝炎。 某传染病医院数据（2001-2010年)显示：近半数PBC 患者伴有乙肝病毒感染，疾病还同时伴发各种类型肝炎 （乙肝最常见）。 自身免疫性肝炎 autoimmune hepatitis, AIH AIH临床特点： n大多隐匿起病,女性多见（女：男=4-6：1） n 类似病毒性肝炎的症状和体征：疲乏无力、右上腹不 适、肝肿大、黄疸、腹水 n肝功能异常：肝酶（ALT、AST）升高为主，明显高于 胆酶，AST/ALP3； n血清IgG升高，1.5倍, r-球蛋白2倍； n各种病毒学指标 检查均为阴性;（自免肝禁忌用干扰素 ，诊断自免肝必须排除病毒性肝炎）。 AIH（自免肝）相关的自身抗体 是AIH诊断和分型的重要依据和必备条件 n抗核抗体（ANA） n抗平滑肌抗体（SMA） n抗肝肾微粒体抗体（LKM） n抗肝细胞溶质蛋白1抗体（LC-1） n抗可溶性肝抗原抗体（SLA） n抗肝胰抗体（LP） 自身免疫性肝炎的分型 I型: 最常见，约占80% 抗平滑肌抗体（SMA）， ANA ： 常同时出现 （85%-90%）， ANA及SMA被公认是 诊断I型AIH的特异性抗体; II型: LKM-1(肝肾微粒体抗原）； LC-1 (肝细胞胞质抗原) 少见，儿童多见 III型: SLA (可溶性肝抗原) LP (肝胰抗原) 原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis,PSC n病变特征为胆管广泛炎症纤维化、梗阻、狭窄，进 而发生胆汁性肝硬化，临床特点为阻塞性黄疸。 nPSC血清免疫球蛋白常增高,以IgM多见。 nANCA阳性在PSC高达87%。 n血清中可发现ANA和SMA，但滴度都比较低，一 般没有抗线粒体抗体，这一点与PBC相反。 n胆管造影(ERCP)显示有硬化性胆管炎的典型改变 ，肝内外胆管狭窄与扩张相间而呈串珠状改变（决 定性）。 ANCA-抗中性粒细胞胞浆抗体 nANCA代表一组抗中性粒细胞胞浆特定的成分为靶抗原 的抗体谱。 n其靶抗原成分包括：丝氨酸蛋白酶3（PR-3）、髓过氧 化物酶（MPO）、通透性杀菌蛋白（BPI）、丝氨酸蛋 白酶、人白细胞弹性蛋白酶（HLE）、乳铁蛋白（LF） 、组织蛋白酶G（CG）、葡萄糖醛酸酶、溶菌酶等。 n在显微镜下观察，常见到两种结合类型： nC-ANCA：胞浆中细颗粒类型，主要靶抗原为PR-3 ； nP-ANCA：核周染色。其靶抗原主要为MPO； nA-ANCA或X-ANCA：前两者的混合物，非典型 ANCA ANCA的测定 1 间接免疫荧光法 (IIF) 最常用 胞浆型 c-ANCA 核周型 p-ANCA 不典型 a-ANCA 2 免疫印迹法 细胞质呈弥漫性颗 粒样染色（不均匀 ） 环绕细胞核周围的细胞 质亮染 ANCA两种荧光染色型 核周型ANCA（pANCA） 胞浆型ANC（cANCA ） C-ANCA/ PR3 -ANCA n丝氨酸蛋白酶3（PR3） 为C-ANCA的主要靶抗原，约占 C-ANCA的80%90%。 nC-ANCA诊断WG的特异性大于90%，外加PR3-ANCA 可超过95%。 n敏感性取决于疾病的活动性和病期阶段，在初发不活动 的韦格纳肉牙肿（WG）中，阳性率只有50%，而活动 性典型的WG，几乎100%阳性。总体敏感性为6070 。 nC-ANCA滴度与病情活动一致，强烈的致病作用。常被 作为WG，判断疗效、估计复发的指标。 n在HIV感染和阿米巴肝脓肿的患者中也可能检测到该抗体。 nPR3-ANCA在其他原发性血管炎中也可被检测到，如 MPA(显微镜下多动脉炎）、坏死性新月体型肾小球肾 炎（NCGN）、PAN（结节性多动脉炎）等。 P-ANCA/ MPO-ANCA n主要靶抗原为：抗髓过氧化物酶（MPO），弹性蛋白 酶、乳铁蛋白及其它尚未被确认的胞质成分为抗原。 n主要与50显微镜下多动脉炎（MPA）、坏死性新月 体型肾小球肾炎（NCGN）等相关。 nMPO-ANCA还可见于其它一些疾病，如PAN（结节性 多动脉炎）、抗肾小球基底膜疾病（抗GBM病）、WG 、SLE (10%15%）、RA伴关节外损害及血管炎、药 物性狼疮、Felty综合征(类风关合并WBC少）等。 nMPO-ANCA与原发性血管炎相关不及PR3-ANCA与WG 相关性那样紧密。但每一个怀疑血管炎或肾小球肾炎患 者，只要原因不明，就应查ANCA。 n体内、体外资料显示MPO-ANCA参与血管炎相关疾病 的致病机理。 nMPO-ANCA与病情活动相关，可用于判断疗效、估计 复发和指导治疗。 ANCA不仅与原发性小血管炎相关,也可 见于许多其它炎症性疾病,例如炎症性肠病,包 括溃疡性结肠炎和克隆氏病;自身免疫性肝胆 疾病,如原发性硬化性胆管炎;类风湿性关节炎; 和某些肺部非感染性炎症性疾病,如囊性纤维 化、肺间质纤维化等。但上述ANCA相关的疾 病并不识别PR3和MPO,其特异性ANCA靶抗原 为其它胞浆成分。 甲亢治疗监测 n血管炎病变不仅累及血管本身，还累及血管所 支配的组织和脏器，有些可以致命。 n甲亢：目前我国女性人群患病率达2%。甲亢 未经治疗，ANCA阳性率可达到3.5%，治疗甲 亢（血管炎）ANCA阳性率35%，ANCA阳性 必须停药。 类风湿关节炎相关抗体 n类风湿因子（Rheumatoid Factor, RF） n抗环瓜氨酸肽（Cyclic citrullinated peptide ， CCP）抗体 n抗核周因子（antiperinuclear factor，APF） n抗角蛋白抗体（antikeratin antibody，AKA） n抗钙蛋白酶抑制蛋白抗体(ACAST) n抗RA33抗体 类风湿因子（RF） n抗原：为变性的IgG Fc段 通常为IgM型 n是诊断RA的标准之一，不是唯一标准，更非RA特有, 作为类风湿关节炎（RA）的筛选试验有一定的价值， 至少75的患者RF（） n作为血清阴性脊柱关节病区分标准。 n正常人2%阳性，老年人可达5%阳性。 nRF与其他蛋白、半抗原有交叉反应。 n多种结缔组织病（SLE，SD，SS，PM/DM）感染疾病 （SBE，TB，hepatitis）,肝硬化，弥漫性肺纤维化，结 节病等均可阳性。 n病后半年才产生，有关节外表现者，滴度高。持续高滴 度RF预示疾病严重，预后差。 抗环瓜氨酸肽（Cyclic citrullinated peptide CCP）抗体 n抗CCP抗体所针对的靶抗原是APF、AKA的共同 抗原决定簇，是由19个氨基酸残基组成的瓜氨酸 多肽链，ELISA 法检测。 n抗CCP 抗体对RA诊断的特异性高（90. 4%98% ），敏感性约80%； n有助于RA的早期诊断：该抗体可先于RA临床表现 ，90%以上的血清抗CCP抗体阳性的未分类的关 节炎在年内进展为RA。 n与RA的活动性及预后相关, 浓度高往往提示预后 不佳，发生关节侵蚀的危险大。 n是RA最好的独立参数预测指标。 RA自身抗体谱及临床意义 nRF60RA中出现，量与RA活动性及严重 性呈正相关，亦在其它CTD出现 n抗CCP在50RA中出现 （聚角蛋白微丝蛋白） 特异性高，95 nAKA（抗角蛋白抗体） 在40RA阳性，特异性90% nAPF（抗核周因子） 在52RA阳性，特异性90% n抗RA33RA阳性率为35 n抗Sa 在部分RA阳性 以上抗体阳性有助于早期RA及不典型RA的诊断和早期 开展治疗，改善预后。 风湿病学中的自身抗体：结论 n单单出现自身抗体并不一定是风湿性疾病。 n试验结果阴性常常并不能除外某种风湿性疾 病。 n必须要根据临床才能作出风湿性疾病的最终 诊