知名厂家五分类血细胞分析仪课件

知名厂家五分类血细胞分析仪 仪器原理和散点图特点 BeckmanCoulter公司 体积、电导和激光散射原理 这是BeckmanCoulter公司生产的血细胞分析仪所 采用的经典分析方法，他集三种物理学检测技术于 一体，在细胞处于自然原始的状态下对其进行多参 数分析。该方法也称为体积、电导、激光散射血细 胞分析法。此技术采用在标本中首先加入红细胞溶 血剂溶解掉红细胞，然后加入稳定剂来中和红细胞 溶解剂的作用，使白细胞表面、胞浆和细胞体积保 持稳定不变。然后应用鞘流技术将细胞推进到流动 细胞计数池（Flowcell）中，接受仪器VCS三种技术 的检测。 V代表体积（Volume）测量法，是采用经典的库 尔特专利技术，用低频电流准确分析细胞体积。 体积是区分白细胞亚群的一个重要的参数，它可 有效区分体积大小差异显著的淋巴细胞和单核细 胞。C代表高频电导性（Conductivity），采用高频 电磁探针原理测量细胞内部结构间的差异，也是 该公司的专利技术。细胞膜对高频电流具有传导 性，当电流通过细胞时，细胞核的化学组份可使 电流的传导性产生变化，其变化量可以反映出细 胞内含物的信息。该参数可用来区分体积相近而 内部性质不同的细胞群体，如淋巴细胞和嗜碱性 粒细胞，由于它们的细胞核特性不同而在传导性 参数上有所区别。 S代表激光散射（Scatter）测量技术，采用氦 氖激光源发出的单色激光扫描每个细胞，收 集细胞在1070角度内出现的散射光 (MALS)信号。该激光束可穿透细胞，探测细 胞内核分叶状况和胞浆中的颗粒情况，提供 有关细胞颗粒性的信息，可以区分出颗粒特 性不同的细胞群体。例如细胞内颗粒粗的要 比颗粒细的散射光更强，因此可以用于区分 粒细胞中的嗜中性、嗜酸性和嗜碱性三种细 胞。 VCS法的测定原理 仪器将分析每个细胞在V、C、S 三种检测技 术上的测量结果，因为不同类别的细胞会在体 积、表面特征、内部结构等方面呈现明显的不 同。将这些特征性信息被定义到以VCS为三维 坐标(分辨率为256256256=16,777,216)所形 成的立体散点图中，这五类细胞可在三维空间 中形成特定的细胞群。通过计算某群细胞数量 占白细胞总数的百分比，即可得到五项白细胞 分类结果。仪器不仅仅做出对正常白细胞的五 项分类结果，给出典型的散点图型，还可以提 示许多异常细胞区域的报警。 VCS技术可通过DF1、DF2、DF3三个散点图 将五种类型白细胞明显区分开。三个散点 图的纵坐标均定义为细胞体积。DF1为细胞 体积和激光散射的直方图，DF2和DF3为细 胞体积和高频电导性的直方图，DF3为除去 粒细胞群体后显示出淋巴细胞后面的嗜碱 性粒细胞图像。 各类白细胞在VCS三维空间中的分 布特点 VCS技术是BeckmanCoulter公司开发研制的经典专有 方法，到目前为止的各种高档血细胞分析仪均采用该方 法对白细胞进行分析。该方法在白细胞分析上尚有特殊 能力，例如可以测定和分析中性粒细胞的体积、核浆比 例、细胞颗粒特性等参数，也就是将中性粒细胞的VCS 三个参数分别给出，用于了解细菌感性疾病与其它疾病 的区别。也可对淋巴细胞、单核细胞等均作出其细胞群 体的三个技术参数值，是比较有前景的研究内容。 仪器在RBC、PLT、WBC计数上依然采用电阻抗法，血 红蛋白仍然采用比色法测定。该公司的五分类法血细胞 分析仪先后推出多种类型，如MAXM、STKS、GENS、 HmX、LH755和最新的LH780等型号，在某些机型还具有 网织红细胞分析功能和T淋巴细胞亚群分析功能。 日本希森美康 电阻抗、射频和细胞化学技术 日本Sysmex公司系列血细胞分析仪是在国 内应用非常广泛的仪器，从三分类法到五 分类法的各种型号仪器都有大量用户。其 仪器型号种类丰富，功能和测定参数各异 ，其各种仪器间均有近似的检测原理，但 在结合特定的功能以达到不同的分析目的 方面，其原理和所用试剂又有不完全相同 之处。 Sysmex XE-2100 Sysmex XE-2100在白细胞分类上采用半导体激 光流式细胞技术结合核酸荧光染色技术进行白 细胞计数和分类。半导体激光照射在通过鞘流 技术处理的细胞上，可根据每个细胞所产生的 三种信号来鉴别细胞类别。前向散射光（FSC ）信号可反应细胞体积大小；侧向散射光（ SSC）信号可反应细胞的颗粒和细胞核等内含 物的信息；侧向荧光（SFL）强度信号则用于 分析细胞内脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸 （RNA）的含量。 在白细胞分析上主要采用两个通道进行细胞计数和分类 ，两个通道均采用激光和鞘流进样的方式测定。DIFF通 道： STROMATOLYSER-4DL试剂中的表面活性剂可以溶解 掉标本中的红细胞和血小板，并在白细胞膜上打出小孔 ；然后第二种试剂 STROMATOLYSER-4DS中的聚次甲基染 料通过这个小孔进入白细胞中，与细胞核的核酸和细胞 器结合，在经过波长633nm的激光照射，产生的荧光强 度与细胞的核酸含量成正比。STROMATOLYSER -4DL试剂 还具有与嗜酸性颗粒特异性结合的能力，可根据侧向散 射光信号强度，将嗜酸性粒细胞从中性粒细胞中分离出 来。这样可以将中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细 胞、淋巴细胞清楚的分离开。在DIFF散射图当中可以得 到白细胞的四个分群（LMNE）。 WBC/BASO通道是专用作检测嗜碱性粒细胞的 通道，因为嗜碱性粒细胞数量非常少，因此必 须采用特殊技术处理。STROMATOLYSER FB是 一种酸性试剂，可将红细胞和血小板形成淡影 化，将除嗜碱性粒细胞以外的白细胞处理成裸 核形态，然后采用前向散射光（FSC）信号和 侧向散射光（SSC）信号使嗜碱性粒细胞从其 它细胞中分离出来。前向散射光与细胞体积测 定相关，侧向散射光与裸核后的细胞结构复杂 性有关。在这个通道中可以获得白细胞总数和 嗜碱性粒细胞的数量。 图4 Sysmex XE-2100白细胞分类散点图 该仪器在红细胞和血小板的计数和分析上 仍然沿用了经典的电阻抗方法，在血红蛋 白测定上采用了无剧毒物质的SLS溶血剂比 色法。 法国ABX 双鞘流技术和细胞化学染色法 ABX是法国生成血细胞分析仪器的著名厂家，其生 产的全自动血细胞分析仪Pentra 120型为其高端产 品。在白细胞分类上采用该公司特有的专利技术-双 鞘流（DHSS）分析法。双鞘流是专利技术，而测定 本身是通过电阻抗和光吸收法双重原理。标本首先 在第一鞘流液中经过电阻抗测定分析，得到细胞体 积测定结果，然后通过第二鞘流引导再行光吸收率 分析，对细胞内容物进行测定，最终将细胞测定信 息在散射图相应的位置表现出来。双鞘流技术的核 心部件是含有红宝石小孔的复杂的鞘流池，在双鞘 流系统的上下两端分别加上恒定电流，是保证电阻 法的测量要素。 为了保证被检测的细胞能够正确通过计数 孔和鞘流通道，需要利用外来鞘流来进行 矫正，因此通过左侧鞘流泵注入稀释液形 成第一鞘流液，其作用是保护溶液能够直 接通过计数小孔，并且保证其中携带的细 胞处于中心部位，液流不发生偏移和扭曲 ；溶液通过计数小孔后，再通过中间鞘流 泵注入稀释液形成第二股鞘流，用以保证 吸光度测量。这样的过程被称为双鞘流分 析技术。 双鞘流技术示意图 仪器通过两个通道来完成白细胞的五项分类。其采用的 细胞化学染色技术（Cytochemistry）的原理是经典的细 胞分类技术，此染色剂中含有溶血素及氯唑黑活体染料 （Chlorazol Black E）。在仪器的LMNE检测池中，全血 样品与染色剂充分混匀，在35条件下进行孵育，此过 程的作用是： 溶解红细胞 对单核细胞的初级颗 粒、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的特异颗粒进行不同程 度的染色，同时对细胞的膜（细胞膜、核膜、颗粒膜） 也进行不同程度的着色 固定细胞的形态，使其保持 自然状态。由于淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜 酸性粒细胞对染色剂的着色程度不同、每种细胞特定的 细胞核形态和颗粒的结构造成光散射的强度不同，产生 了特定的吸光率。 染色后的标本被引导进入鞘流池进行双鞘流分析，首先 经过60mm红宝石小孔进行电阻法分析，用于判断细胞 体积大小，在LMNE散点图上的横坐标即可表示出细胞 大小的特性。然后样本迅速进入直径为42mm的第二鞘 流检测通道进行光吸收率测定，以判断细胞形态和内容 物等情况。根据每类细胞在这两个分析参数上所表现出 来的特性，形成二维分布的散点图。在此通道内可完成 白细胞中淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸细胞 群的分类。此通道内在分析的同时还能够检测两群异常 白细胞亚群：巨大未成熟细胞（LIC）百分比及绝对值， 异型淋巴细胞（ALY）百分比及绝对值，同时还可提供 多达82种提示和报警信息。 在LMNE散点图上，各类白细胞的特点是：淋巴细胞：典型 的淋巴细胞体积较小、形态规则、胞浆内没有颗粒，其吸光率 最低，所以定位在散点图的右下部矩阵中，正常淋巴细胞散点 图为正态体积分布。单核细胞：典型的单核细胞体积较大、 肾状核、胞浆内有初级颗粒（几乎不着色），细胞核大且不分 叶，光散射较少，所以位于吸光率轴的最下端，依据单核细胞 的体积，位于体积轴的最右端，而异常单核细胞及特大单核细 胞则可能出现在LIC的矩阵中。中性粒细胞：典型的中性粒细 胞具有嗜中性颗粒及分叶核的结构，中性颗粒部分着色，同时 由于颗粒及核的分叶等形态上的复杂性，而产生光散射。所以 中性粒细胞群散点图位于中部。核分叶越多的中性粒细胞，吸 光性越强，在散点图上的位置向右移。同时杆状细胞（Bands） 体积与中性粒细胞接近，但核的复杂程度低，吸光率低，散点 图位于中性粒细胞与单核细胞之间。 嗜酸性粒细胞：由于嗜酸性粒细胞含有特异性颗粒，与染色 液特异性着色，其着色强度最深，位于Y-轴的最上端，此方法 提高了嗜酸性粒细胞的分类的准确性。巨大未成熟细胞（ Large Immature Cell）：未成熟粒细胞因其体积较大，可含有颗 粒，光散射强，位于嗜中性粒细胞散点图的右侧，在LIC矩阵图 中从左到右依次排列晚幼粒、中幼粒、早幼粒细胞，另外各种 原始细胞位于单核细胞的右侧区域中。由于此散点图中可能有 大单核细胞，可引起LIC假性计数增加（LIC的计数结果被计算到 在嗜中性粒细胞中）。LIC包括：大单核细胞、高嗜碱性的单核 细胞、巨大中性粒细胞、早幼粒细胞、中幼粒细胞、晚幼粒细 胞、原始细胞。异型淋巴细胞(Atypical Lymphs)：在散点图中 位于淋巴细胞与单核细胞之间的一群细胞，包括：小原始粒细 胞、大淋巴细胞等。 在WBC/BASO检测池中，全血样品与BasolyseII （PH2.4）溶血素混合，在35C恒温下，溶解 红细胞，由于嗜碱性粒细胞具有抗酸性，能够 保持形态完整，而其他白细胞胞浆溢出，成为 裸核状态。细胞通过一个直径为80mm的鞘流 微孔时，根据电阻抗原理进行测定，以细胞体 积大小为横坐标绘制WBC/BASO直方图。依据 阈值设定区分裸核化的白细胞与嗜碱性粒细 胞。在直方图上可以看出在中心界标左侧的是 细胞体积变小的其它细胞群，界标右侧是体积 较大的嗜碱性粒细胞。因嗜碱性粒细胞数量极 少，因此在直方图上基本见不到明显分布曲线 和峰。 ABX血细胞分析仪LMNE散点图和 BASO直方图 红细胞和血小板仍然采用电阻抗原理测定，血 红蛋白采用比色法。此为在软件系统中采用了 浮动界标技术用于血小板计数及嗜碱细胞计数 ，直方图的界标会依据细胞群的变化做出相应 的自动调整。血小板计数上还采用了防返流装 置，目的为防止涡流现象对血小板计数产生影 响。在白细胞计数过程中还采用了白细胞平衡 检测原理（WBC Count Balance），使得白细胞 计数在WBC/HGB通道中与LMNE双鞘流池计数 结果相联系，如果出现较大差别则可进行报警 提示。 最近该厂推出新一代ABX Pentra DX120型血 细胞分析仪，其测定原理仍然采用双鞘流 技术。采用新技术扩展了散点图分布范围 ，形成可对血液中未成熟的粒细胞、单核 细胞和淋巴细胞共20个参数的分类或提示 性报告信息，这对异常血细胞的筛检提供 了很大帮助。 Pentra DX120型幼稚细胞散点图 美国雅培公司（ABBOTT） 多角度偏振光激光散射技术 美国雅培公司（ABBOTT）推出的血细胞分析 仪，在白细胞分类中采用独特的多角度偏振光 散射（MAPSS）技术，其所生产的血细胞计数 仪从CELL-DYN 3000，3200，3500，3700， 4000，以及Sapphire（蓝宝石），在白细胞分 类上均采用了MAPSS技术。该技术基本原理是 细胞在激光束的照射下，在多个角度都产生散 射光，仪器在四个角度的四个检测器将接收到 的相应的散射光信号，然后经过微处理器分析 处理，将各类细胞安置在散点图上的相应位置 ，并计算出白细胞分类结果。 多角度偏振光散射白细胞分类技术（MultiAngle Polatised Scatter Separation of white cell，MAPSS） 其原理是一定体积的全血标本用鞘流液按适当比例 稀释。其白细胞内部结构近似于自然状态，因嗜碱 性粒细胞颗粒具有吸湿的特性，所以嗜碱性粒细胞 的结构有轻微改变。红细胞内部的渗透压高于鞘液 渗透压而发生改变，红细胞内的血红蛋白从细胞内 游离出来，而鞘液内的水分进入红细胞中，细胞膜 的结构仍然完整，但此时的红细胞折光指数与鞘液 的相同，故红细胞不干扰白细胞检测。在鞘流系统 的作用下，样本被集中为一个直径30m的小股液流 ，该液流将稀释的血细胞单个排列，然后通过激光 束，激光照射于细胞上，在各个方向都有其散射光 出现。 0为前向角散射（13）光，可粗略地测定细胞 大小；10为狭角散射光（711），可测细胞 结构及其复杂性的相对特征；90为消偏振光散 射（70110），基于颗粒可以将垂直角度的偏 振激光消偏振的特性，将嗜酸细胞从中性粒细胞和 其它细胞中分离出来。90垂直光散射（70 110），主要对细胞内部颗粒和细胞成分进行测 量。这四个角度同时对单个白细胞进行测量和分析 后，即可将白细胞划分为嗜酸性粒细胞、中性粒细 胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞5种。 ABBOTT的五分类法定量很有意思，不用传统的体积 定量，而是采用数量定量，每次计数时完成10000 个细胞测定即停止。 MAPSS测定原理示意图 ABBOTT CELL-DYN五分类血细胞分析仪 各类白细胞在散射图上的分布图 该类型仪器除了基本的白细胞五分类外， 还提供了其它异常白细胞的信息和报警， 提供给检验者参考，以通过人工显微镜检 查复核这些结果，例如异常淋巴细胞、原 始细胞、未