细菌的简单染色和革兰氏染色.ppt

实验一 细菌的染色 尹会方 2012.3.12 球菌 杆菌 弧菌 实验二 细菌的简单染色和革兰氏染色 n一、实验目的 n1. 学习掌握简单染色的操作技术和无菌操 作技术。 n2. 理解革兰氏染色机理，并掌握其操作技 术。 n3.了解芽孢染色机理，掌握芽孢染色的方 法。 二、实验原理-简单染色 n细菌的细胞小而透明，在普通的光学显微镜下不易识别 ，必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色 ，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差，从而能更 清楚地观察到其形态和结构。此法操作简便，适用于菌 体一般形状和细菌排列的观察。 n常用碱性染料进行简单染色，这是因为在中性、碱性或 弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，而碱性染料在 电离时，其分子的染色部分带正电荷，因此碱性染料的 染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细 菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别 。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等 。当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正 电荷增加，此时可用伊红、酸性复红或刚果红等酸性染 料染色。 二、实验原理-简单染色 n染色前必须固定细菌。其目的有二：一是 杀死细菌并使菌体粘附于玻片上；二是增 加其对染料的亲和力。常用的有加热和化 学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原 有的形。 二、实验原理-革兰氏染色 n革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家 ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可 将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+） 和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染 色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。 n革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳 性和革兰氏阴性，是由这两类细菌细胞壁 的结构和组成不同决定的。 二、实验原理-革兰氏染色 n革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂 结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用 乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红 )复染。经此方法染色后，细胞保留初染剂 蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌；如果细胞 中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染 剂的颜色(红色)，该菌属于革兰氏阴性菌 。 二、革兰氏染色机理 n当用结晶紫初染后，像简单染色法一样，所有细 菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为媒染剂，它 能与结晶紫结合成结晶紫一碘的复合物，从而增 强了染料与细菌的结合力。当用脱色剂处理时， 两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌 的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁 厚、类脂质含量低，用乙醇(或丙酮)脱色时细胞 壁脱水、使肽聚糖层的网状结构孔径缩小，透性 降低，从而使结晶紫-碘的复合物不易被洗脱而 保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的 蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同，由于其细胞壁肽 聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时， 类脂质被乙醇(或丙酮)溶解，细胞壁透性增大， 使结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用 复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。 三、实验器材 n1、菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌菌 种。 n2、显微镜、载玻片、擦镜纸、酒精灯、 接种环、吸水纸、盖玻片、试管、水浴锅 。 n3、草酸铵结晶紫染色液、卢戈氏碘液、 95%乙醇、0.5%番红色液、蒸馏水、双层 瓶（香柏油和二甲苯）。 四、实验方法和步骤 细菌的简单染色 n1、涂片：用1%盐酸清洁玻片后，在玻片中央滴上一小滴蒸 馏水，再用无菌操作的方法挑菌少许于玻片的水中，并充 分混匀涂成薄膜。 n2、干燥：将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥。 n3、固定：涂面朝上，通过微火2-3次。 n4、染色：待玻片泠却后加结晶紫1-2滴于涂片上，覆盖涂 面染色1-2分钟。 n5、水洗：倾去染色液，用水自玻片一端轻轻冲洗至流下的 水变无色为止（注：勿冲去菌体）。 n6、干燥：自然干燥，或用吸水纸吸干。 n7、镜检：油镜观察并绘图。 四、实验步骤 1、菌落形态观察： 2、细菌简单染色： 3、细菌革兰氏染色。 注意：菌落颜色、湿度、形状、大小、透明度 、颜色、边缘是否规则等特征。 染色过程： 涂片干燥固定染色（1min）水洗 干燥镜检 注意事项： 涂片：取菌量不能太大 干燥：自然干燥 水洗：水流不能直接冲在涂菌处 滴加少量水 挑取菌体涂片干燥 固定染色 水洗 干燥 2. 革兰氏染色 n1）、涂片：取清洁玻片一块，在玻片两端 1/4处下面用记号笔分别标明S和E（见图示） ，并滴一滴蒸馏水，分别将金黄色葡萄球菌 和大肠杆菌涂布在相应的区域内。 2. 革兰氏染色 n2、干燥与固定：方法同（一）中2， 3步骤 n3、染色： 结晶紫染色1-2分钟-水洗-碘液 媒染1-2分钟-水洗-酒精脱色 15-20秒-水洗-番红复染色2-3 分钟-水洗-干燥-镜检记录。 注意事项： n酒精脱色是革兰氏染色中的重要环节，如 脱色过度，则革兰氏阳性菌可能被误染为革 兰氏阴性菌，如脱色不够，则革兰氏阴性菌 可能被误染为革兰氏阳性菌，所以脱色时间 要很好掌握。脱色时间的长短还受涂片厚薄 的影响，一般涂片时取菌要少，涂片薄而均 匀为好。被检菌的培养条件、培养基成分 、菌龄的不同等原因会影响染色结果，如革 兰氏阳性菌的陈旧培养物也有出现革兰氏阴 性的几率，所以被检菌的菌龄一般最好在 1824h之内。 染色结果 金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果 染色结果 大肠杆菌革兰氏染色结果 染色结果 金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果 四、实验结果 n绘图记录观察结果 显微镜放大倍数物镜放大倍数目镜放大倍数 附：油镜的使用 双目显微镜 单目显微镜 2.油镜的原理 n油镜的透镜很小，从载玻片透过的光线通过空气时，因 介质折光率不同，光线将发生散射现象，使射入镜筒的 光线很少，物象不清。若在油镜与玻璃片之间加入与玻 璃折射率相近的香柏油，则使通过的光线不至因折射而 减弱，因此能清楚地看到物象。 芽孢染色原理 n用着色力强的染色剂孔雀绿或石炭酸复红 ，在加热条件下染色，使染料不仅进入菌 体也可进入芽孢内，进入菌体的染料经水 洗后被脱色，而芽孢一经着色难以被水洗 脱，当用对比度大的复染剂染色后，芽孢 仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被 染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体更易于 区分。 芽孢染色步骤 （1）将培养24小时左右的枯草芽孢杆菌或其他芽孢 杆菌，作涂片、干燥、固定。 （2）滴加35滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。 （3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸 汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许 染液。加热时间从染液冒蒸汽时开始计算约45分 钟。 （4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪 色为止。 （5）用番红水溶液复染1分钟，水洗至水为无色。 （6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈 红色。 注意事项： （1）选用适当菌龄的菌种，幼龄菌尚未形成 芽孢，而老龄菌芽孢囊已经破裂。 （2）加热染色时必须维持在染液冒蒸汽的状 态，加热沸腾会导致菌体或芽孢囊破裂，加 热不够则芽孢难以着色。 附：革兰染色液配方 n1草酸铵结晶紫染液 A液：结晶紫(crystal violet)2g 95%酒精 20ml B液：草酸铵(ammonium oxalate)0.8g 蒸馏水 80m 混合A、B 二液，静置48小时后使用。 n2卢戈氏(Lugol)碘液 碘片 10g 碘化钾 20g 蒸馏水 300ml 先将碘化钾溶解在少量水