高二生物基因工程的基本操作程序.ppt

12 基因工程的基本操作程序 课标领航 1阐阐述基因工程的原理。 2掌握并理解基因工程的基本操作程序。 3尝试设计尝试设计 某一转转基因生物的研制过过程。 【重点】 基因工程的原理及基本操作程序。 【难难点】 基因文库库；PCK扩扩增过过程；目的基因 的检测检测 。 看到这这幅图图，联联系基因工程，你 有何感想？让让植物和动动物合为为一 体可能不好实现实现 ，但我们们能不能 通过过基因工程技术术，让这让这 一愿望 实现实现 呢？实际实际 上，基因工程技术术 已经实现经实现 了人们们的许许多看似异想 天开的愿望或构想。 情景导导航 核心要点突破 基础自主梳理 知能过关演练 12 基 因 工 程 的 基 本 操 作 程 序 基础自主梳理 一、基因工程的基本操作程序 1目的基因的获获取。 2_的构建。 3将目的基因导导入_。 4目的基因的检测检测 与鉴鉴定。 基因表达载载体 受体细细胞 二、目的基因的获获取 1目的基因：主要是指编码编码 _的结结构基 因。 2获获取方法 (1)从基因文库库中获获取 基因文库库：将含有某种生物不同基因的许许多 _片段，导导入受体菌的群体中储储存，各个受 体菌分别别含有这这种生物的不同基因。 蛋白质质 DNA 所有 思考感悟 1怎样样从基因文库库中得到我们们需要的目的基因？ 【提示】 可以根据目的基因的有关信息，例如 ，根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在 染色体上的位置、基因的转录产转录产 物mRNA，以及 基因的翻译产译产 物蛋白质质等特性来获获取目的基因。 (2)利用PCR技术扩术扩 增目的基因 含义义 一项项在生物体外_的核酸合成 技术术 原理 DNA_ 前提 条件 有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这这 一序列合成_ 扩扩增 过过程 目的基因DNA受热热变变性解旋为为_引物与 单链单链 相应应互补补序列结结合在_作用 下延伸形成新的DNA分子循环环重复以指数形 式扩扩增 结结果 以指数形式扩扩增：2n 复制特定DNA片段 双链链复制 引物 单链单链 DNA聚合酶 (3)人工合成法：如果基因较较小，核苷酸序列又 已知，可以通过过DNA合成仪仪用化学方法直接人 工合成。 目的基因 目的基因 首端 RNA聚合酶 终终止子 2功能：(1)使目的基因在受体细细胞中稳稳定存在 ，并且可以遗传给遗传给 下一代。 (2)使目的基因_表达和发挥发挥 作用。能够够 思考感悟 2如何把导导入了目的基因的受体细细胞筛选筛选 出来？ 【提示】 以四环环素抗性基因为为例，程序如下： 四、将目的基因导导入受体细细胞 1转转化：_进进入受体细细胞内，并且在受 体细细胞内维维持稳稳定和_的过过程。 2导导入植物细细胞 (1)方法：_、基因枪枪法、花粉管通 道法。 (2)农农杆菌特点 易感染双子叶植物和祼子植物。 Ti质质粒上的_可转转移至受体细细胞，并且 整合到受体细细胞染色体DNA上。 目的基因 表达 农农杆菌转转化法 TDNA 3导导入动动物细细胞 (1)方法：_注射技术术。 (2)常用受体细细胞：受精卵。 4导导入微生物细细胞 (1)原核生物特点：繁殖快、多为为_、遗传遗传 物质质相对较对较 少等。 (2)对对受体细细胞的常用处处理方法：用_处处理细细 胞，使细细胞处处于一种能吸收周围环围环 境中DNA分子 的生理状态态(这这种细细胞称为为感受态细态细 胞)。 显显微 单细单细 胞 Ca2 思考感悟 3从细细胞器的功能上分析，若通过过基因工程生 产产人的糖蛋白，可以用大肠肠杆菌吗吗？ 【提示】 不可以，糖蛋白上的糖链链是在内质质网 和高尔基体上加工完成的，而内质质网和高尔基体 存在于真核细细胞中，大肠肠杆菌是原核生物，细细胞 中不含有这这两种细细胞器。 五、目的基因的检测检测 与鉴鉴定 1检测检测 及方法 (1)检测转检测转 基因生物染色体的DNA上是否插入了目 的基因，采用DNA分子杂杂交技术术。 (2)检测检测 目的基因是否_，采用分子 杂杂交技术术。 (3)检测检测 目的基因是否_，采用抗原 抗体杂杂交。 2鉴鉴定：除了_外，还还需要进进行个体 生物学水平的鉴鉴定，如抗虫、抗病鉴鉴定等。 转录转录 出mRNA 翻译译成蛋白质质 分子检测检测 核心要点突破 目的基因的获取 1两种基因文库库的主要区别别如下表 文库类库类 型cDNA文库库基因组组文库库 文库库大小小大 基因中启动动子无有 基因中内含子无有 基因多少部分基因全部基因 物种间间的基因交流可以部分基因可以 特别别提醒 细细胞中成熟的mRNA是需要在转录转录 后 将非编码编码 区转录转录 出的序列切除的，只留下编码编码 区 序列，因而从这样这样 的mRNA反转录转录 来的cDNA不会 有启动动子序列。对对于真核生物在转录转录 后的加工过过程 中还还要将内含子部分转录转录 出的序列也切除掉，所以 真核生物的cDNA中也不会有内含子序列。 cDNA是反转录获转录获 得的双链链DNA。 生物之间进间进 行基因交流，只有使用受体生物自身 基因的启动动子比较较有利于基因的表达。 通过过cDNA文库获库获 得的目的基因没有启动动子，只 将编码编码 序列导导入受体生物中无法转录转录 。 2DNA复制、PCR技术术和基因克隆的比较较 DNA复制PCR技术术基因克隆 场场所细细胞核生物体外细细胞内 酶 解旋酶、 DNA聚合酶 Taq酶 限制酶、DNA 连连接酶 载载体不需要不需要需要 遵循原则则 碱基互补补配 对对 碱基互补补配 对对 碱基互补补配对对 结结果DNA分子 DNA分子片 段 DNA分子片段 3提取目的基因方法的比较较 途径 从基因文库库中直 接分离目的基因 人工合基因(真核细细胞) 方法鸟枪鸟枪 法 逆转录转录 法 根据已知氨 基酸序列合 成DNA 途径 从基因文库库中直 接分离目的基因 人工合基因(真核细细胞) 过过 程 供体细细胞中的DNA 限制酶 许许多DNA片段 连连接 表达载载体 导导入 受体细细胞 外源DNA扩扩增，产产 生特定性状 分离 目的基因 目的基因的 mRNA 逆转录转录 单链单链 DNA 合成 双链链DNA (即目的基因) 蛋白质质的氨基 酸序列 推测测 mRNA的核苷 酸序列 推测测 结结构基因的核 苷酸序列 化学合成 目的基因 途径 从基因文库库中 直接分离目的 基因 人工合基因(真核细细胞) 优优点操作简单简单专专一性强 专专一性强， 可产产生自然 界不存在的新 基因 缺点 工作量大，盲 目性大，专专一 性差 操作过过程较较 复杂杂，技术术 要求过过高 适用范围围狭 小 1970年，特明和巴尔的摩证实证实 了RNA病毒能 依赖赖RNA合成DNA的过过程，并发现发现 了催化此过过程 的酶。下面为为形成cDNA的过过程和PCR扩扩增过过程示 意图图。请请根据图图解回答下列问题问题 ： 例例1 1 (1)催化过过程的酶是_；核酸酶H的作用 是_。 (2)过过程也称为为DNA的变变性，此过过程在温度高达 9095 时时才能完成，说说明DNA分子具有 _性。 (3)由图图中信息分析可知，催化过过程的酶都是 _，两者在作用特性上的区别别是 _。 (4)如果RNA单链单链 中有碱基100个，其中A占25%， U占15%，则则通过该过过该过 程合成的一个双链链DNA片 段中有胞嘧啶嘧啶 _个。 【尝试尝试 解答】 (1)反转录转录 酶(或逆转录转录 酶) 分解RNA (2)稳稳定 (3)DNA聚合酶 催化过过程的酶耐高温 (4)60 【解析】 根据图图示可以看出，该过该过 程是RNA在逆 转录转录 酶的催化作用下形成cDNA(负链负链 DNA)，构成 RNADNA中间间体。中间间体中的RNA再经过经过 RNA 酶H水解，而以剩下的负链负链 DNA复制成双链链DNA的 过过程。过过程是由RNA合成DNA的过过程，需要逆转转 录录酶进进行催化。过过程是以单链单链 DNA复制获获得双链链 DNA的过过程需要DNA聚合酶催化。属于双链链DNA 复制的过过程，需要DNA聚合酶催化。过过程在70 75 环环境下进进行，所需要的酶应该应该 能够够耐高温。 【互动动探究】 (1)上述过过程中需要限制酶和DNA 连连接酶吗吗？ (2)由mRNA逆转录转录 形成的DNA具有启动动子吗吗？ 【提示】 (1)不需要。 (2)无。 【探规寻规寻 律】 (1)PCR技术术不需要解旋酶，但需利 用9095 高温使DNA分子解旋。 (2)PCR技术术的前提是要有一段已知目的基因的核苷 酸序列，以便根据这这一序列合成引物。 (3)PCR技术术是对对已知目的基因的扩扩增；从基因库库 中获获取目的基因，是先找出含有目的基因的细细胞， 再通过过一定的技术术手段获获取目的基因。 基因表达载体的构建和导入受体细胞 1基因表达载载体的构建 特别别提醒 用限制酶切割载载体和含目的基因的 DNA分子时时，可以使用不同的限制性核酸内切酶, 但是必须须切出相同黏性末端。 不同基因可以拼接的原因：不同生物的基因具 有相同的结结构和化学组组成，都是双螺旋结结构，都 由四种脱氧核糖核苷酸组组成，都遵循相同的碱基 互补补配对对原则则：AT，GC。 2目的基因的导导入 (1)不同受体细细胞的常用导导入方法 生物种类类 植物细细 胞 动动物细细胞微生物细细胞 常用方法 农农杆菌 转转化法 显显微注射法Ca2处处理法 受体细细胞体细细胞受精卵原核细细胞 生物 种 类类 植物细细胞动动物细细胞微生物细细胞 转转 化 过过 程 目的基因插入 Ti质质粒的T DNA上导导入 植物细细胞整 合到受体细细胞 的DNA表达 目的基因表达 载载体提纯纯取 卵(受精卵) 显显微注射受 精卵发发育获获 得具有新性状 的动动物 Ca2处处理细细 胞感受态细态细 胞表达载载体 与感受态细态细 胞 混合感受态态 细细胞吸收DNA 分子 (2)目的基因导导入受体细细胞 不同生物的受体细细胞不同：植物一般为为体细细胞 ，动动物一般为为受精卵，微生物一般为为大肠肠杆菌。 上图图中发发生与发发生相比，会使目的基因 的遗传遗传 特性得以稳稳定维维持和表达，原因是在进进行 细细胞分裂时时，细细胞核上的DNA经经复制后平均分配 到两个子细细胞中，保证证了亲亲子代遗传遗传 性状的稳稳定 性，而细细胞分裂时时，细细胞质质是不均分的，子细细 胞不一定含有目的基因。 (2011年高考海南卷)回答有关基因工程的问问 题题： (1)构建基因工程表达载载体时时，用不同类类型的限制 酶切割DNA后，可能产产生黏性末端，也可能产产生 _末端。若要在限制酶切割目的基因和质质 粒后使其直接进进行连连接，则应选择则应选择 能使二者产产生 _(相同、不同)黏性末端的限制酶。 例例2 2 (2)利用大肠肠杆菌生产产人胰岛岛素时时，构建的表达载载 体含有人胰岛岛素基因及其启动动子等，其中启动动子 的作用是_。 在表达载载体转转化大肠肠杆菌时时，常用_处处理 大肠肠杆菌，以利于表达载载体进进入；为为了检测检测 胰岛岛 素基因是否转录转录 出了mRNA，可用标记标记 的胰岛岛素 基因片段作探针针与mRNA杂杂交，该杂该杂 交技术术称为为 _。为为了检测检测 胰岛岛素基因转录转录 的mRNA是 否翻译译成_，常用抗原抗体杂杂交技术术。 (3)如果要将某目的基因通过农过农 杆菌转转化法导导入植 物细细胞，先要将目的基因插入农农杆菌Ti质质粒的 _中,然后用该农该农 杆菌感染植物细细胞,通过过 DNA重组组将目的基因插入植物细细胞的_上。 【尝试尝试 解答】(1)平 相同 (2)RNA聚合酶识别识别 和 结结合的位点，有了它才能驱动驱动 基因转录转录 出mRNA ，最终获终获 得所需要的蛋白质质 Ca2 DNA分子杂杂 交技术术 人胰岛岛素 (3)TDNA 染色体的DNA 【解析】(1)限制酶能识别识别 特定的DNA序列，并在 特定位点上切割DNA，形成黏性末端或平末端；要 使目的基因和质质粒直接进进行连连接，应应使用同一种 限制酶进进行切割，使二者产产生相同的黏性末端。(2) 启动动子为为DNA序列，其具有RNA聚合酶结结合位点 ，能启动转录动转录 ，合成RNA；将基因表达载载体导导入 大肠肠杆菌时时，常用Ca2 处处理；检测检测 目的基因时时， 常用 分子杂杂交技术检测术检测 目的基因或相应应的mRNA，或 采用抗原抗体杂杂交技术鉴术鉴 定相应应的蛋白质质。(3) 用农农杆菌转转化法将目的基因导导入植物细细胞时时，首 先将目的基因导导入农农杆菌Ti质质粒的TDNA中， 再利用农农杆菌侵染植物细细胞，通过过DNA重组组将目 的基因插入植物细细胞的染色体的DNA上。 【误误区警示】 (1)切割质质粒和目的基因的限制酶 必需是同一种酶，以获获得互补补的末端，利于重组组 质质粒的构建。 (2)目的基因的首端和尾端需加上启动动子和终终止子 。 组组成：目的基因启动动子终终止子标记标记 基因 (3)由于受体细细胞