[理学]7基因芯片技术.ppt

Genetic EngineeringGenetic Engineering 遗传信息迅猛增长遗传信息迅猛增长 随着人类基因组（测序）计划（ 随着人类基因组（测序）计划（Human Human genome projectgenome project）的逐步实施以及分子生物学相关）的逐步实施以及分子生物学相关 学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基 因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未 有的速度迅速增长。有的速度迅速增长。 基因分析芯片开发的动力基因分析芯片开发的动力 人类基因组（测序）计划（ 人类基因组（测序）计划（Human genome Human genome projectproject）的逐步实施，现（）的逐步实施，现（19971997年底）已完成年底）已完成2%2% 序列及序列及800800，000000个个cDNAcDNA片段片段(EST)(EST)的测序工作，的测序工作， 20082008年已全部完成；年已全部完成； 其它生物基因组的测定工作： 其它生物基因组的测定工作：1111种微生物种微生物0.6-0.6- 4.2Mb4.2Mb、大肠杆菌、大肠杆菌4.6Mb4.6Mb、酵母、酵母13Mb13Mb全序列，线全序列，线 虫虫71%71%、果蝇、果蝇6%6%、小鼠、小鼠0.2%0.2%序列得到测定。序列得到测定。 然而，怎样去研究如此众多基因的生物信息然而，怎样去研究如此众多基因的生物信息 及其在生命过程中所担负的功能，成了全世界生及其在生命过程中所担负的功能，成了全世界生 命科学工作者共同的课题！为此，建立新型杂交命科学工作者共同的课题！为此，建立新型杂交 和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速 的检测、分析就显得格外重要了。的检测、分析就显得格外重要了。 何谓基因芯片 何谓基因芯片 ？芯片的种类有哪？芯片的种类有哪 些？如何制作些？如何制作基因基因 芯片芯片？ vv生物芯片的简介生物芯片的简介 vv生物芯片的分类生物芯片的分类 vv基因芯片制作基因芯片制作 vv基因芯片的杂交及结果分析基因芯片的杂交及结果分析 vv基因芯片的应用基因芯片的应用 主要内容主要内容 第一节 生物芯片简介第一节 生物芯片简介 vv生物芯片生物芯片（BiochipBiochip） 指通过机器人自动印迹或光引导化学合成 指通过机器人自动印迹或光引导化学合成 技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生技术在硅片、玻璃、凝胶或尼龙膜上制造的生 物分子微阵列，根据分子间的特异性相互作用物分子微阵列，根据分子间的特异性相互作用 的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程的原理，将生命科学领域中不连续的分析过程 集成于芯片表面，以实现对集成于芯片表面，以实现对细胞、蛋白质、细胞、蛋白质、 基因及其它生物组分基因及其它生物组分的准确、快速、大信息的准确、快速、大信息 量的检测。量的检测。 一、一、生物芯片的定义生物芯片的定义 DNADNA芯片芯片 蛋白质芯片蛋白质芯片 细胞芯片细胞芯片 组织芯片组织芯片 多糖芯片多糖芯片 神经元芯片神经元芯片 等等等等 功能不同分为：功能不同分为： 样品制备芯片样品制备芯片 生化反应芯片生化反应芯片 检测芯片检测芯片 毛细管电泳芯片毛细管电泳芯片 DNADNA芯片芯片 蛋白质芯片蛋白质芯片 生物芯片按探针不同分为：生物芯片按探针不同分为： DNADNA芯片是生物芯片芯片是生物芯片（Biochip)Biochip)的一种的一种 生物芯片包括：生物芯片包括： DNADNA芯片芯片 蛋白质芯片蛋白质芯片 其它芯片其它芯片 DNADNA芯片技术芯片技术是指在固相支持物上原位合成是指在固相支持物上原位合成（in in situ synthesissitu synthesis）寡核苷酸探针，或者直接将大量的寡核苷酸探针，或者直接将大量的 DNADNA探针以显微打印的方式有序的固化于支持物表探针以显微打印的方式有序的固化于支持物表 面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检 测分析即可得出样品的遗传信息（基因序列及表达测分析即可得出样品的遗传信息（基因序列及表达 的信息）。的信息）。 由于常用计算机硅芯片作为固相由于常用计算机硅芯片作为固相 支持物，所以称为支持物，所以称为DNADNA芯片。芯片。 DNADNA芯片又被称为基因芯片芯片又被称为基因芯片（ gene chipsgene chips）、DNADNA阵列阵列（DNA DNA arrayarray）、cDNAcDNA芯片芯片（cDNAcDNA chips chips） 、寡核苷酸阵列、寡核苷酸阵列（oligonucleotideoligonucleotide arrayarray）等。等。 基因芯片基因芯片指对数以千记的指对数以千记的DNADNA片段同时进行处理片段同时进行处理 分析的技术，诸如基因组分析的技术，诸如基因组DNADNA突变谱和突变谱和mRNAmRNA表达表达 谱的检测等（谱的检测等（Trends in Biotechnology)Trends in Biotechnology)。 该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后 该技术系指将大量探针分子固定于支持物上后 与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分 子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列 信息。信息。 vv基因芯片分析的过程：基因芯片分析的过程： 样品及其标记处理、芯片的制作、分子杂 样品及其标记处理、芯片的制作、分子杂 交、信号的检测和数据处理及分析等几个步骤交、信号的检测和数据处理及分析等几个步骤 。 二、二、基因芯片的分析流程基因芯片的分析流程 原理原理 - - 通过杂交检测信息通过杂交检测信息 一组寡核苷酸探针一组寡核苷酸探针 TATGCAATCTAGTATGCAATCTAG CGTTAGATCGTTAGAT ACGTTAGAACGTTAGA ATACGTTAGATCATACGTTAGATC TACGTTAGTACGTTAG 由杂交位置确定的一组由杂交位置确定的一组 核酸探针序列核酸探针序列 GTTAGATCGTTAGATC 杂交探针组杂交探针组 TATGCAATCTAGTATGCAATCTAG 重组的互补序列重组的互补序列 靶序列靶序列 TACGTTAGTACGTTAG ACGTTAGAACGTTAGA ATACGTTAATACGTTA CGTTAGATCGTTAGAT GTTAGATCGTTAGATC ATACGTTAATACGTTA 基因芯片基因芯片 荧光标记的荧光标记的 样品样品 共聚焦显微镜共聚焦显微镜 获取荧光图象获取荧光图象 杂交结果分析杂交结果分析 探探 针针 设设 计计 杂交杂交 早在八十年代初有人就曾设想利用计算机早在八十年代初有人就曾设想利用计算机 半导体技术生产基因芯片以对人类基因组大量半导体技术生产基因芯片以对人类基因组大量 的遗传信息进行分析和检查，但直到光引导原的遗传信息进行分析和检查，但直到光引导原 位合成位合成(light-directed (light-directed in in situsitu synthesis)synthesis)高密度探高密度探 针技术和激光共聚焦显微扫描问世之后才使该针技术和激光共聚焦显微扫描问世之后才使该 设想逐步成为现实，并迅速应用到分子生物学设想逐步成为现实，并迅速应用到分子生物学 的多个领域，得到了科学界的高度重视。的多个领域，得到了科学界的高度重视。 三、三、基因芯片技术的发展史基因芯片技术的发展史 vv1989 1989 年英国牛津大学的年英国牛津大学的 Southern Southern 等取得了在刚等取得了在刚 性载体表面固定寡聚核苷酸及杂交法测序的专利性载体表面固定寡聚核苷酸及杂交法测序的专利 ；与此同时俄罗斯和美国的科学家也提出了运用；与此同时俄罗斯和美国的科学家也提出了运用 杂交法测定核酸序列（杂交法测定核酸序列（SBHSBH）的设想。）的设想。 1994 1994 年研年研 制出了一种基因芯片并用于检测制出了一种基因芯片并用于检测 -地中海贫血病地中海贫血病 的基因突变，筛选了一百多个的基因突变，筛选了一百多个 -地中海贫血病已地中海贫血病已 知的突变基因。知的突变基因。 三、三、基因芯片技术的发展史基因芯片技术的发展史 基因芯片发展历史基因芯片发展历史 Southern & Northern Southern & Northern BlotBlot Dot Dot BlotBlot MacroarrayMacroarray MicroarrayMicroarray vv1995 1995 年，一些国际大公司与研究机构合作共年，一些国际大公司与研究机构合作共 同开发具有商业价值的生物芯片及其相关的分同开发具有商业价值的生物芯片及其相关的分 析技术。析技术。 1997 1997 年世界上第一张全基因组基因芯年世界上第一张全基因组基因芯 片片含有含有 6116 6116 个基因的酵母全基因组芯片在个基因的酵母全基因组芯片在 斯坦福大学斯坦福大学 Brown Brown 实验室完成。从而使基因芯实验室完成。从而使基因芯 片技术在世界上快速得到应用。片技术在世界上快速得到应用。 vv基因芯片技术的特点的核心是微型化基因芯片技术的特点的核心是微型化 芯片每平方厘米固体表面上可固定十万个 芯片每平方厘米固体表面上可固定十万个 DNA DNA 片段、数万个基因。一次分析可得到数万片段、数万个基因。一次分析可得到数万 个基因的表达信息。微型化的另一方面是样品用个基因的表达信息。微型化的另一方面是样品用 量与试剂用量的微量化，用纳克级的量与试剂用量的微量化，用纳克级的 mRNA mRNA 、 微升级的杂交液就能分析成千上万个基因的表达微升级的杂交液就能分析成千上万个基因的表达 信息。这些都是其它研究技术所无法比拟的。信息。这些都是其它研究技术所无法比拟的。 四、四、基因芯片技术的特点基因芯片技术的特点 将样品中的DNA/RNA表上荧 光标记，则可以定量检验基 因的表达水平 碱基互补 基因芯片的密度：基因芯片的密度：100-1million DNA 100-1million DNA 探针探针/1cm/1cm 2 2 vv 芯片制作及分析过程易于自动化芯片制作及分析过程易于自动化 芯片设计制作可实现自动化，可根据要求 芯片设计制作可实现自动化，可根据要求 将需要分析的基因制作成符合要求的芯片；杂将需要分析的基因制作成符合要求的芯片；杂 交、洗片等过程都可实现自动化，工作效率大交、洗片等过程都可实现自动化，工作效率大 幅提高。幅提高。 四、基因芯片技术的特点四、基因芯片技术的特点 技术操作简单 技术操作简单 自动化程高 自动化程高 序列数量大 序列数量大 检测效率高 检测效率高 应用范围广 应用范围广 成本相对低 成本相对低 四、基因芯片技术的特点四、基因芯片技术的特点 高度集成化高度集成化 大通量平行分析大通量平行分析 大规模大规模 高灵敏度高灵敏度 样品需要量小样品需要量小 DNADNA芯片的特点芯片的特点 第二节 生物芯片的分类第二节 生物芯片的分类 基因芯片基因芯片以其片基以其片基(substrate)(substrate)的不同可以的不同可以 分为分为无机片基无机片基和和有机合成物片基有机合成物片基。 前者主要包括半导体硅片和玻璃片，其上前者主要包括半导体硅片和玻璃片，其上 的探针主要以原位聚合的方法合成，后者主要的探针主要以原位聚合的方法合成，后者主要 有特定孔径的硝酸纤维膜和尼龙膜，其上的探有特定孔径的硝酸纤维膜和尼龙膜，其上的探 针主要是预先合成后通过特殊的微量点样装置针主要是预先合成后通过特殊的微量点样装置 或仪器滴加到片基上去（如下表所示）。或仪器滴加到片基上去（如下表所示）。 基因芯片的主要类型及其简要特点基因芯片的主要类型及其简要特点 不过，也有人不过，也有人(Robert S. Matson)(Robert S. Matson)等以聚丙烯膜等以聚丙烯膜 为支持物用传统的亚磷酰胺固相法原位合成高密为支持物用传统的亚磷酰胺固相法原位合成高密 度探针序列。度探针序列。 vv按载体材料可将芯片分为玻璃芯片、硅芯片按载体材料可将芯片分为玻璃芯片、硅芯片 、陶瓷芯片。目前，玻片材料因易得、荧光背、陶瓷芯片。目前，玻片材料因易得、荧光背 景低、应用方便等优点在国际上被广泛接受。景低、应用方便等优点在国际上被广泛接受。 通常是将玻片用化学方法处理并联接上活性基通常是将玻片用化学方法处理并联接上活性基 团，如氨基、醛基、巯基等，使生物分子通过团，如氨基、醛基、巯基等，使生物分子通过 共价键或离子键与载体结合。共价键或离子键与载体结合。 一按载体材料一按载体材料 vv根据芯片点样方式不同，可分为原位合成芯根据芯片点样方式不同，可分为原位合成芯 片、微矩阵芯片和电定位芯片三类。片、微矩阵芯片和电定位芯片三类。 原位合成芯片原位合成芯片（Loci-synthetic DNA ChipLoci-synthetic DNA Chip） 矩阵芯片矩阵芯片（MicroarrayMicroarray） 电定位芯片电定位芯片（MicroelectronicMicroelectronic） 二按点样方式二按点样方式 vv 根据芯片固定的生物分子类型可以将生物芯根据芯片固定的生物分子类型可以将生物芯 片划分为基因芯片、蛋白质芯片及芯片实验室片划分为基因芯片、蛋白质芯片及芯片实验室 。 基因芯片或基因芯片或 DNA DNA 芯片芯片 蛋白质芯片（蛋白质芯片（Protein ChipProtein Chip） 芯片实验室（芯片实验室（Lab-on-ChipLab-on-Chip） 三按芯片固定的生物分子类型三按芯片固定的生物分子类型 vv生物芯片因功能和用途不同可分为测序芯片生物芯片因功能和用途不同可分为测序芯片 、表达谱芯片和基因差异表达分析芯片等。、表达谱芯片和基因差异表达分析芯片等。 测序芯片测序芯片 表达谱芯片表达谱芯片 基因差异表达分析芯片基因差异表达分析芯片 四按芯片使用功能分类四按芯片使用功能分类 第三节 基因芯片的制作第三节 基因芯片的制作 基因芯片研制的总体蓝图基因芯片研制的总体蓝图 研制方向的确定研制方向的确定 基因组序列分析与待检基因探基因组序列分析与待检基因探 针序列的确定针序列的确定 检测样品检测样品 的制备的制备 探针阵列的探针阵列的 准备准备 检测设备的检测设备的 研制研制 杂交检测与数据分析杂交检测与数据分析 一、一、DNA DNA 样品的来源样品的来源 根据基因芯片的检测目的不同 根据基因芯片的检测目的不同, ,可以把样品制可以把样品制 备方法分为备方法分为 用于表达谱测量的 用于表达谱测量的mRNAmRNA样品制备样品制备 用于多态性 用于多态性( (或突变或突变) )研究的基因样品的制备研究的基因样品的制备 vv 生物芯片微阵列的制作技术按照制作方法可生物芯片微阵列的制作技术按照制作方法可 分为两大类，即分为两大类，即原位合成原位合成和和预合成后点样预合成后点样。 二生物芯片的制作二生物芯片的制作 vv 预合成后点样预合成后点样 指制备芯片微阵列前，要固定的探针已经 指制备芯片微阵列前，要固定的探针已经 合成好，点滴系统需要做的就是把这些合成好合成好，点滴系统需要做的就是把这些合成好 的样品涂印或喷涂在基体上。的样品涂印或喷涂在基体上。 vv原位合成方法原位合成方法 由点滴系统将探针的组成部分逐步转移到 由点滴系统将探针的组成部分逐步转移到 基体上，同时实现探针合成和转移的目的。基体上，同时实现探针合成和转移的目的。 该方法有两类：该方法有两类： 光引导原位聚合技术与压电打印原位聚合 光引导原位聚合技术与压电打印原位聚合 技术。技术。 接触点样法接触点样法 喷墨法喷墨法 光刻光刻 DNA DNA 合成法合成法 目前已经知道的基因芯片制作法有，接 目前已经知道的基因芯片制作法有，接 触点样法、喷墨法和原位合成法等。触点样法、喷墨法和原位合成法等。 vv光引导原位聚合技术光引导原位聚合技术 Light directed Light directed oligonucleotide synthesis.oligonucleotide synthesis. A A solid solid support support is is derivatized derivatized with with a a covalent covalent linker linker molecule molecule terminated terminated with with a a photolabile photolabile protecting protecting group. group. Light Light is is directed directed through through a a mask mask to to deprotect deprotect and and activate activate selected selected sites, sites, and and protected protected nucleotides nucleotides couple couple to to the the activated activated sites. sites. The The process process is is repeated, repeated, activating activating different different sets sets of of sites sites and and coupling coupling different different bases bases allowing allowing arbitrary arbitrary DNA DNA probes probes to to be be constructed constructed at each site.at each site. 原位合成原位合成(In Situ Synthesis)(In Situ Synthesis) 光引导原位聚合技术 光引导原位聚合技术的简要过程为：首先使支持物的简要过程为：首先使支持物 羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来，选取择适当的羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来，选取择适当的 蔽光膜（蔽光膜（maskmask）使需要聚合的部位透光，其它部们不透光）使需要聚合的部位透光，其它部们不透光 。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基 解保护，进而与单体分子共价结合。因为合成所用的单体解保护，进而与单体分子共价结合。因为合成所用的单体 分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基 的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基 团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光） 决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序 就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的。 优点：优点： 合成效率高，点阵密度高合成效率高，点阵密度高 缺点：缺点： 设备昂贵，技术复杂，反应产率低设备昂贵，技术复杂，反应产率低 操作过程（见下图）操作过程（见下图） * * 使使支持物氨基化支持物氨基化 * * 用光不稳定保护基（用光不稳定保护基（photo photo labile labile protecting protecting groupgroup）将）将 NHNH 2 2 基保护起来基保护起来 * * 选择适当的挡光板（选择适当的挡光板（maskmask）使需要聚合的部位透光，使需要聚合的部位透光， 不需发生聚反应的部分不透光。这样，光通过挡光板照不需发生聚反应的部分不透光。这样，光通过挡光板照 射到支持物上，受光的部分射到支持物上，受光的部分NHNH 2 2 解保护解保护 * * 合成所用单体分子一端按传统固相合成方法活化另一端合成所用单体分子一端按传统固相合成方法活化另一端 则受光敏保护基团保护。这时，用单体分子去和支持物则受光敏保护基团保护。这时，用单体分子去和支持物 上解保护的氨基反应，偶联后的部位将仍旧带上保护基上解保护的氨基反应，偶联后的部位将仍旧带上保护基 团。团。 * * 类似地，进行以后其它反应直至得到目的寡聚体序列。类似地，进行以后其它反应直至得到目的寡聚体序列。 光引导原位合成技术原理图光引导原位合成技术原理图 vv压电打印原位聚合技术压电打印原位聚合技术 压电打印原位聚合技术压电打印原位聚合技术其装置与普通的彩色喷墨其装置与普通的彩色喷墨 打印机并无两样，所用技术也是常规的固相合成方法。即打印机并无两样，所用技术也是常规的固相合成方法。即 ，将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂替代，支持物，将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂替代，支持物 经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试 剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一 般的固相原位合成技术。如此类推，可以合成出长度为般的固相原位合成技术。如此类推，可以合成出长度为4040 到到5050个碱基的探针。个碱基的探针。 优点：优点： 设备廉价，技术相对简单，反应产率高设备廉价，技术相对简单，反应产率高 缺点：缺点： 点阵密度低，易产生交叉污染点阵密度低，易产生交叉污染 vv“ “点膜点膜” ”型型 合成工作用传统的 合成工作用传统的DNADNA固相合成仪完成，只是合成后固相合成仪完成，只是合成后 用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于 硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。支持物应事先进行特定处硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。支持物应事先进行特定处 理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷，以便能理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷，以便能 够牢固地结合寡核苷酸分子。该方法是目前大多数中小型够牢固地结合寡核苷酸分子。该方法是目前大多数中小型 公司所采用的方法。公司所采用的方法。 优点：设备廉价，技术简便，研制周期短，灵活性高优点：设备廉价，技术简便，研制周期短，灵活性高 缺点：点阵密度低缺点：点阵密度低 三制作生物芯片常用的工具三制作生物芯片常用的工具 （略）（略） vv基因芯片技术基因芯片技术包括三大部分，即芯片的制作；包括三大部分，即芯片的制作； 样品的标记；探针与标记样品的分子杂交等。样品的标记；探针与标记样品的分子杂交等。 基因芯片制作的关键就是如何将大量的探针分 基因芯片制作的关键就是如何将大量的探针分 子固定于支持物上，并保持探针分子的构像处于自子固定于支持物上，并保持探针分子的构像处于自 然状态，使探针然状态，使探针 DNA DNA 分子能自由地与样品分子进分子能自由地与样品分子进 行杂交。行杂交。 四四DNA DNA 分子在刚性表面的固定分子在刚性表面的固定 薄膜型薄膜型 如聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。 如聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等。 这种类型这种类型“ “芯片芯片” ”的点阵是通过的点阵是通过“ “点膜点膜” ”形式制作形式制作 的，并通过一定的方法使探针能够牢固地结合的，并通过一定的方法使探针能够牢固地结合 于其上，整个过程类似于斑点杂交技术（如于其上，整个过程类似于斑点杂交技术（如 CloneTechCloneTech公司）。公司）。 vv从支持物来分主要有：从支持物来分主要有： 玻片型 玻片型 这种芯片的点阵是通过这种芯片的点阵是通过 原位合成技术制作的，点阵原位合成技术制作的，点阵 密度很高，所以必须借助于密度很高，所以必须借助于 特殊的仪器对测定结果进行特殊的仪器对测定结果进行 解读和分析。当前具有此类解读和分析。当前具有此类 产品研制能力的公司很少（产品研制能力的公司很少（ 如如AffimetrixAffimetrix公司）。公司）。 微板型微板型 这种芯片实质上是一种具有高密度、小容量 这种芯片实质上是一种具有高密度、小容量 测试孔的小型酶联免疫检测板（如测试孔的小型酶联免疫检测板（如PEPE公司等）。公司等）。 集成电路型集成电路型 将杂交技术与微电子技术结合于一体有目的将杂交技术与微电子技术结合于一体有目的 地通过电子装置检测或控制地通过电子装置检测或控制DNADNA等生物大分子的等生物大分子的 作用过程（如作用过程（如NanogenNanogen公司）公司） 第四节 基因芯片的杂交及结果分析第四节 基因芯片的杂交及结果分析 将不同条件下从某生物体中转录出来的所 将不同条件下从某生物体中转录出来的所 有有 mRNA mRNA 经标记成为探针后，再与包含它所有经标记成为探针后，再与包含它所有 基因而制成的芯片杂交。通过分析杂交位点及基因而制成的芯片杂交。通过分析杂交位点及 其信号强弱，就可得出不同情况下每个基因是其信号强弱，就可得出不同情况下每个基因是 否已表达及表达多少。否已表达及表达多少。 vv标记的方法通常是在反转录的底物中加入带标记的方法通常是在反转录的底物中加入带 有标记基团的寡核苷酸单体，通过反转录将标有标记基团的寡核苷酸单体，通过反转录将标 记分子掺入记分子掺入 cDNAcDNA 分子中。分子中。 mRNA mRNA 反转录标记反转录标记 方法直接影响方法直接影响 DNA DNA 芯片分析结果的准确性及重芯片分析结果的准确性及重 现性。现性。 一探针的标记一探针的标记 vv在一定的条件下，分子间氢键的断裂与恢复在一定的条件下，分子间氢键的断裂与恢复 是是 DNA/DNA DNA/DNA 、 DNA/RNA DNA/RNA 分子间选择性结合分子间选择性结合 的根本动力，这一过程称之为杂交。的根本动力，这一过程称之为杂交。 二杂交二杂交 基因芯片不仅可对大量基因或序列同时、快速进行 基因芯片不仅可对大量基因或序列同时、快速进行 定性、定量分析，而且作为一种极有发展前途的测序策定性、定量分析，而且作为一种极有发展前途的测序策 略也倍受人们的重视。略也倍受人们的重视。 以下图为例，首先将八聚体寡核苷酸所有可能的 以下图为例，首先将八聚体寡核苷酸所有可能的 序列组合合成或固定于片基上，对于每一序列其在片基序列组合合成或固定于片基上，对于每一序列其在片基 上的位置是预先决定好的。样品扩增并经标记后与片基上的位置是预先决定好的。样品扩增并经标记后与片基 上所有序列进行杂交反应。这样，就会出现特定的杂交上所有序列进行杂交反应。这样，就会出现特定的杂交 图谱，有杂交信号部位的寡核苷酸片段与待测样品序列图谱，有杂交信号部位的寡核苷酸片段与待测样品序列 是互补的最后分析产生杂交信号的寡核苷酸序列的重叠是互补的最后分析产生杂交信号的寡核苷酸序列的重叠 情况进而推导出样品的核酸序列。情况进而推导出样品的核酸序列。 利用基因芯片进行杂交测序的原理利用基因芯片进行杂交测序的原理 三芯片结果读取与扫描仪三芯片结果读取与扫描仪 对于用荧光素标记经扩增（ 对于用荧光素标记经扩增（ 也可用其他放大技术）的序列或也可用其他放大技术）的序列或 样品，与芯片上的探针进行杂交样品，与芯片上的探针进行杂交 ，然后冲洗，采集荧光图像。，然后冲洗，采集荧光图像。 图像的采集用落射荧光显微 图像的采集用落射荧