微生物正交实验.ppt

微生物学教研室 菌种的扩大培养是发酵生产的第一道工序,该工 序又称为种子制备。 菌体数量增加 种子制备 高质量的种子 种子的扩大培养任务： 获得纯而壮且活力旺盛、接种数量足够的培 养物。 发酵时间长短和接种量的大小有关。 将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，有利于缩短 发酵时间，提高发酵罐利用率，减少染菌机会。 一、种子制备的过程 1、固体培养基上生产大量孢子的孢子制 备 2、液体培养基中生产大量菌丝的过程 1、孢子制备 孢子制备是种子制备的开始，孢子的质量、数量对以 后菌丝的生长、繁殖、发酵产量有明显影响。 （1）放线菌孢子的制备 限制碳源、氮源（碳源1，氮源不超过0.5） ；添加麸皮、豌豆浸汁、蛋白胨、无机盐；干燥 。 放线菌发酵生产的工艺流程： 菌种 母斜面 子斜面 摇瓶种子 种子罐 发酵罐 （孢子） （孢子） （菌丝） （2）霉菌孢子的制备 一般以大米、小米、玉米、麸皮等天然 农产品为培养基 （3）细菌培养物的制备 斜面多为碳源限量、氮源丰富的配方 2、种子制备 种子制备是将固体培养基上培养出的孢 子或菌体转入到液体培养基中培养，使其 繁殖成大量菌丝或菌体的过程。 （1）摇瓶种子制备：某些孢子发芽和菌丝繁殖速度 缓慢的菌种，需将孢子经摇瓶培养成菌丝后再进 入种子罐，这就是摇瓶种子。分母瓶和子瓶。 （2）种子罐种子制备：因菌种不同而异，一般可分 为一级种子、二级种子和三级种子的制备。 A、一级种子：孢子或摇瓶菌丝被接入到体积较小 的种子罐中，经培养后形成大量菌丝。一级种子 转入到发酵罐内发酵，称为二级发酵。 B、二级种子：将一级种子转入体积较大的种子罐 中，经过培养形成更多的菌丝。二级种子转入到 发酵罐内发酵，称为三级发酵。 C、三级种子，四级发酵 种子罐的级数主要决定于菌株性质和菌体生长速度 及发酵设备的合理应用。 二、种子培养 表面培养法：好氧静置 培养法 固体培养法：曲法培养 液体深层培养 液体表面培养 固体表面培养 浅盘固体培养 深层固体培养 液体深层培养 液体深层种子罐从罐底部通气，送入的 空气由搅拌浆叶分散成微小气泡以促进氧 的溶解。这种由罐底部通气搅拌的培养方 法，相对于气液界面靠自然扩散使氧溶解 的表面培养法，称为深层培养法。 深层培养基本操作的三个控制点： 灭菌 温度控制 通气、搅拌 几种深层培养法 （1）控制培养法：根据罐内部的变化情况，掌握 短时间内状态变量的变化以及可能测定的环境 因子对微生物代谢活动的影响，以此为基础 作控制培养，以达到产物的最优培养条件。 （2）载体培养法：以天然或人工合成的多孔 材料代替麸皮之类的固体基质作为微生 物的载体。 （3）两步法：酶制剂的两步深层培养中，将 菌体生长（营养期）和产酶条件（繁殖 期）区分开。 三、种子质量控制 种子质量主要受孢子质量、培养基、培养 条件、种龄和接种量等因素的影响。 种子的质量是发酵能否正常进行的重要因 素之一，因为种子制备不仅是要提供一定 数量的菌体，更为重要的是要为发酵生产 提供适合发酵、具有一定生理状态大的菌 体。种子质量的控制将以此为出发点。 三、种子质量控制 1、培养基：尽量选择一些有利于孢子发芽和菌丝生 长的培养基；营养成分要尽可能和发酵培养基相 近。 2、培养条件：最适温度；通气搅拌的控制。 青霉素生产：通气充足和通气不足的种子都接入 发酵罐，发酵单位可相差一倍。 土霉素发酵生产：一级种子罐通气量小却有利。 搅拌不足会引起菌丝结团、菌丝粘壁等异常 3、种龄：即种子培养时间。一般选对数生长期，菌 体量尚未达到最高峰时移种。 最适种龄：细菌724h； 霉菌 1650h； 放线菌2164h 同一菌种的不同罐批培养相同的时间，得到种子 质量也不完全一致，因此最适的种龄更应通过多 次试验，根据本批种子质量来确定。 4、接种量：即移入的种子液体积和接种后培 养液体积的比例。接种量大小与该菌在发 酵罐中生长繁殖的速度有关。 近年来，生产上多以大接种量和丰富培养基作为 高产措施， 如谷氨酸生产：采用高生物素、大接 种量、添加青霉素 加大接种量 双种法 种子罐染菌或不理想 倒种法、混种进罐 5、种子质量标准 （1）细胞或菌体： 菌体形态：显微镜观察 菌体健壮、菌形一致、均匀整齐（单细胞菌体种 子） 菌丝粗壮、对某些染料着色力强、生产旺盛、菌 丝分枝和内含物情况良好（霉菌和放线菌种子） 菌体生长量：离心沉淀法、光密度法、物质代谢 的反应 种子液外观：颜色、粘度。 （2）生化指标：种子液的糖、氮、磷、和 pH值变化 （3）产物生成量： （4）酶活力 5、种子质量标准 6、种子异常的分析 种子异常往往表现为： （1）菌种生长发育缓慢或过快：和孢子质量 和种子罐的培养条件有关。 （2）菌丝结团：液体培养条件下，繁殖的菌 丝不分散舒展而聚集成团为菌丝团，与搅 拌效果差、接种量小有关。 （3）菌丝粘壁：与搅拌效果差、泡沫过多、 种子罐装料系数过少等有关。 种子带菌及其防治： a 种子带菌：发酵前期染菌的重要原因之一 ， 是发酵成败的关键。 b 种子带菌原因：保藏的斜面试管菌种染 菌、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移 和接种过程染菌以及种子培养基所涉及的 设备和装置染菌等。 C 种子染菌防治： u严格控制无菌室污染； u 制备种子时对沙土管、斜面、摇瓶等严格进 行管理，防 止杂菌的进入而受到污染； u 对每一级种子的培养物进行严格的无菌检查 ； u 对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理。 培 养 基 定义：提供微生物生长繁殖和生物合成各 种代谢产物所需要的按一定比例配制的多 种营养物质的混合物。 一、工业培养基的选择 l从微生物的特点来选择培养基 l液体和固体培养基选择 l从生产实践和科学试验的不同要求选择 l从经济效益方面考虑选择生产原料 二、培养基配置原则 l根据不同微生物的营养需要 配制不同的培养基 l营养成分的恰当配比 l渗透压 lpH值 l氧化还原电位 三、工业发酵培养基 l 消耗每克底物将产生最大的菌体得率 或产物得率 l 能产生最高的产品或菌体浓度 l能得到产物的最大速率 l副产品的得率小 l价廉质量稳定 l来源丰富且供应充分 蚌埠丰原生化运用先进的生物发酵和现代化工分离技术， 以生物发酵技术为起点，大力发展农产品深加工产业，发 展成为集生物化工、制药、食品加工、油脂加工、生物新 材料为一体的加工制造产业集团。 柠檬酸及其盐类产品生产能力处于全国发酵产品行业第一 位，在世界同行业排名前列，位居全国精细化工之首。 丰原生化以玉米、小麦、油料等农作物为原料，借助自己 独创的“利用玉米清液一次发酵生产柠檬酸”专利技术，国 内首家开发利用,开辟了柠檬酸生产的新途径，选育了适 应该原料的新菌株，缩短了发酵周期，提高了收率，总收 率达80%以上。降低了成本，提高了产品质量，其综合经 济技术指标处于国内领先水平。以玉米代替山芋干为原料 ，避免了环境污染，副产品还可开发利用。 1、工业常用碳源 2、工业常用氮源 3、无 机 盐 4、生长因子 5、前体物质和促进剂 四、工业发酵培养基成分 工业常用碳源 功能：供给菌体生命活动所需的能量 构成菌体细胞以及代谢的基础 谷物淀粉、甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、大麦 酒精、简单的有机酸、烷烃 甲醇、甲烷 工业常用氮源 功能：构成菌体细胞物质和代谢产物 无机氮源：氨水、铵盐、硝酸盐等 有机氮源：玉米浆、豆饼粉、鱼粉、酵母 浸出液等 无 机 盐 硫酸盐、磷酸盐、氯化物、 含钾、钙、钠、镁、铁的化合物 微量元素：铜、锰、锌、钼等 功能：构成菌体成分、酶的组成部分、酶 的激活剂或抑制剂、调节培养渗透 压、调节pH和氧化还原电位 生 长 因 子 定义：凡是微生物生长不可缺少的微量有 机物质，如：氨基酸、嘌呤、嘧啶、维生 素（生物素、硫胺素）。 功能：构成细胞的组成，促进生命活动的 进行。并非必需的。 提供生长因子的农副产品原料： 玉米浆、麸皮水解液、糖蜜、酵母 谷氨酸产生菌：生物素缺陷型 生物素对菌体和谷氨酸积累都有影响 发酵中添加“亚适量”浓度 前 体 物 质 目的：有助于调节产物的形成，大幅度提 高发酵产率、降低成本。 丝氨酸前体 甘氨酸 色氨酸前体 吲哚/氨茴酸 前体直接被菌体在微生物合成过程中结合 到产物分子上，而其自身结构并没有多大 变化，产物产量大幅度提高。 促 进 剂 定义：在氨基酸、抗生素、酶制剂发酵生 产过程中，可在发酵培养基中加入 某些对发酵起一定促进作用的物 质，称为促进剂。 例如：酶制剂发酵过程，添加诱导物、表面 活性剂等促进剂。 总之，培养基配置可参照前人的经验配方， 再结合菌种和产品的特性，采用摇瓶等小发 酵设备对碳、氮、无机因子等单因子逐个试 验，观察这些因子对菌体生长和产物合成的 影响，再综合考虑各因素的影响，以得到最 优配方。 为减少试验次数，可考虑用“正交试验设计” 等方法确定培养基的组分和浓度。 正 交 试 验 法 定义：用正交表安排多因素试验与分 析试验结果的办法，简称正交试验。 因素：影响试验指标的条件 水平：因素所处的状态 简化试验次数 诸因素中哪些因素对指标的影响较大，哪 些因素较小。 所考察的因素各取什么水平能使实验指标 较好 指标在不同水平时的变化规律等 正交试验意义 常用的正交表 例如： L4（23）， L16（44）， L27（313） 正交表格式：Ln（tq） L代表正交表，n代表实验次数， t代表因素水平数，q代表因素数 。 常用的正交表可查阅有关统计学书籍直接套用。 正交表选择依据： 在能容纳所研究的因素数和因素水平数的 前提下选用试验次数最少的正交表来安排 试验 正交表安排试验注意事项： 尽可能使各因素的水平数相等， 试验的重复次数相当。 正交设计试验结果分析 直 观 分 析 方 差 分 析 直观分析 K1：每一因素每一水平下试验指标值的总和 k1：每一因素每一水平下试验指标值的平均 数 R（级差）：试验指标随因素水平变化而改 变的最大范围 正交设计表表头设计 考察指标：糖酸转化率（）考察指标：糖酸转化率（） L16(44) 正 交 实 验 正交实验结果直观分析 实 验 结 果 分 析 各因素对产酸影响的大小顺序为： 葡萄糖 KH2PO4 尿素 玉米浆， 各因素的水平为：A2，B3，C2，D3 由此最终确立了菌株的优化配方： 葡萄糖4；尿素1.5； 玉米浆1；KH2PO40.5。 直观分析优点：简便、计算工作量小 直观分析缺点：判断因素效应的精度不 够，也不能给出误差的大小。 正交试验结果方差分析 考察指标：糖酸转化率（）考察指标：糖酸转化率（） L16(44)正交实验结果 试验结果的方差分析 以n表示试验的总次数，t代表A、B、C、D四因素 每个水平的重复试验次数。 n16，t4， 方差分析的平方和 QA（Ki2）/t（Xi）2/n 111818/46362/162673.5 QB19182/46362/1614.5 QC101258/46362/1633.5 QD101550/46362/16=106.5 QXi2（Xi）2/n28137.66362/16 2856.4 QeQ(QA +QB +QC +QD)28.4 F Fs s 1 1 2 2 /s/s 2 2 2 2 F F检验法通过计算方差之比来检验 检验法通过计算方差之比来检验 两组数据是否存在显著性差异两组数据是否存在显著性差异 F F （f1f1，f2f2）0.050.05 9.28 F9.28 F（ （f1f1，f2f2）0.01 0.01 29.4629.46 当FF（f1，f2）0.05时，该处理引起的差别有 显著意义； 当FF（f1，f2）0.01时，该处理引起的差别有 非常显著意义； 当FF（f1，f2）0.05时，该处理引起的差别有 无显著意义 查单侧F分布表 根据F检验可以看出因素A非常显著， 方差分析观点认为，只需对显著的因素进 行选择，不显著的因素原则上可选试验范 围内的任一点。因此可选A2，因素B、C、D 可在试验范围内任取一点或由其它指标确 定。 发酵方法 好氧发酵 厌氧发酵： 液体表面发酵 固体表面发酵 通氧深层发酵 不通氧的深层发酵不通氧的深层发酵 无论好氧或厌氧发酵都可通过深层培养来实 现，这种培养均在具有一定径高比的圆柱 形发酵罐内完成，操作方法可分为一下五 种： 分批式操作 半分批式操作（流加式操作） 反复分批式操作 反复半分批式操作 连续式操作 深层发酵操作方法 （一）分批发酵 （二）补料分批发酵法 （三）连续发酵法 1、开放式连续发酵 2、封闭式连续发酵 （一）分批发酵 （batch fermentation) 每一批发酵过程都经历接种、生长繁殖、 菌体衰老进而结束发酵，最终提取出产物 。发酵工业常见单罐深层分批发酵 特 点： 微生物所处的环境是不断变化的 ，可进行少量多品种的发酵生产，发生杂 菌污染能够很容易终止操作，当运转条件 发生变化或需要生产新品种时，易改变处 理对策，对原料组成要求粗放。 迟缓期 对数期 稳定期 衰亡期 （二）补料分批发酵法 (fed-batch fermentation) 补料分批发酵法又称半连续发酵或半连续培养， 是指在分批培养过程中，间歇或连续地补加新鲜 培养基的培养方法。 补料分批发酵法广泛适用于抗生素、氨基酸、酶 制剂、有机酸、高聚物等的生产。 与分批发酵相比，其优点在于使发酵系统中维持 很低的基质浓度 低基质浓度优点 可以除去快速利用碳源的阻遏效应，并维 持适当的菌体浓度，不致加剧供氧的矛盾 避免培养基积累有毒代谢物 （三）连续发酵法 (continuous fermentation) 当微生物培养到对数生长期时，在发酵罐中一方 面以一定速度连续不断地流加新鲜液体培养基， 另一方面又以同样地速度连续不断地将发酵液排 出，使发酵罐中微生物的生长和代谢活动始终保 持旺盛的稳定状态，而pH值、温度、营养成分的 浓度、溶解氧等都保持一定，并从系统外部予以 调整，使菌体维持在恒定生长速度下进行连续生 长和发酵，大大提高发酵的生长效率和设备利用 率。 连续发酵类型 1、开放式连续发酵： 培养系统中的微生物细胞随着发酵液的流 出而一起流出，细胞流出速度等于新细胞 生成速度。可使细胞浓度处于某种稳定状 态。 最后流出的发酵液如部分返回（反馈）发 酵罐进行重复使用，则该装置叫做循环系 统，发酵液不重复使用的装置叫做不循环 系统。 （1）单罐均匀混合连续发酵：培养液以一定的流速不 断地流加到带机械搅拌的发酵罐中，与罐内发酵液充 分混合，同时带有细胞和产物的发酵液又以同样流速 连续流出。如果用一个装置将流出的发酵液中部分细 胞返回发酵罐，则构成循环系统 单罐连续发酵 1发酵罐 2分离器 （2）多罐均匀混合连续发酵 将若干搅拌发酵罐串连起来，就构成多 罐均匀混合连续发酵装置。新鲜培养液不 断流入第一次发酵罐，在最后一只罐中流 出。多级连续发酵可以在每个罐中控制不 同的环境条件以满足微生物生长各阶段的 不同需要，并能使培养液中的营养成分得 到较充分地利用，最后流出的发酵液中细 胞和产物的浓度较高，所以是最经济的连 续方法。 （3）管道非均匀混合连 续发酵： 管道的形式有 多种，如S形、直线形、 蛇形管等。培养液和从种 子罐出来的种子不断流入 管道发酵器内，使微生物 在其中生长、繁殖和积累 代谢产物。这种连续发酵 的方法主要用于厌氧发酵 。如在管道中用隔板加以 分隔，每个分隔等于一台 发酵罐，就相当于多罐串 连的连续发酵。 （4）塔式非均匀混合连 续发酵： 塔式发酵罐有两种，一种 是用多孔板将其分隔成若 干室，每个室等于一台发 酵罐，这样一台多孔塔式 发酵罐就相当于一组多级 串连的连续发酵装置；另 一种在罐内装设填充物， 使菌体在上