食品中氨基酸和蛋白质的测定

食品中氨基酸和蛋白质的测定第十章食品中氨基酸和蛋白质的测定一、氨基酸的测定二、蛋白质的测定第2页,共80页，2024年2月25日，星期天

蛋白质可以被酶、酸或碱水解，其水解的最终产物为氨基酸。构成蛋白质的氨基酸20种。其中必需氨基酸8种:亮氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸。一、氨基酸的测定（一）概述第3页,共80页，2024年2月25日，星期天氨基酸态氮的测定甲醛滴定法电位滴定法氨基酸总量的测定茚三酮比色法氨基酸类型和含量的测定氨基酸自动分析仪第4页,共80页，2024年2月25日，星期天（二）食品中氨基酸态氮的测定

原理：氨基酸为两性电解质，既含有酸性的羧基，又含有碱性的氨基，在接近中性的水溶液中，全部解离为双极离子形成内盐，当加入甲醛后，氨基与甲醛反应，从而使其碱性消失，游离出酸性的羧基，这样就可以用标准碱溶液来滴定羧基，根据消耗的碱标准溶液的体积即可计算出氨基酸态氮。1.甲醛滴定法第5页,共80页，2024年2月25日，星期天甲醛反应RCHNH3+COO－HCHORCHNHCH2OHHCHORCHN(CH2OH)2羟甲基氨基酸二羟甲基氨基酸COO－COO－H+第6页,共80页，2024年2月25日，星期天（1）40%中性甲醛（2）1%酚酞指示剂（3）0.1mol/L氢氧化钠标准溶液（4）活性碳试剂第7页,共80页，2024年2月25日，星期天仪器第8页,共80页，2024年2月25日，星期天（1）样品处理：对于含水量少的固体样品粉碎过筛，混匀，称样含水多的固体样品洗净擦干，去皮、核、柄，切成小块于植物组织捣碎机中，加等量的水，捣成匀浆，称匀浆液体样品：直接吸取将样品置于小烧杯中，加蒸馏水50mL，活性炭5g，加热煮沸5min，期间不断用玻璃棒搅拌，过滤，用40mL热蒸馏水洗涤活性炭，收集滤液备用。

测定步骤第9页,共80页，2024年2月25日，星期天（2）测定在上述滤液中加入3-4滴酚酞指示剂，用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈浅红色，而后加入中性甲醛20mL，摇匀，浅红色消失（为什么？）。继续用0.1mol/L氢氧化钠标准溶液滴定至溶液呈浅红色，记录自甲醛加入后所消耗的0.1mol/L氢氧化钠标准溶液的体积。

（3）做空白实验第10页,共80页，2024年2月25日，星期天式中：C---氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L）

V---样品溶液消耗的氢氧化钠标准溶液体积（mL）

V0---空白消耗氢氧化钠标准溶液体积（mL）

m---样品的质量（g）

0.014------氮的毫摩尔质量（g/mmol）结果计算第11页,共80页，2024年2月25日，星期天1.该方法简便、易行，适用于测定食品中的游离氨基酸态氮。2.若样品颜色较深，可加适量活性炭脱色后再测定，或用电位滴定法进行测定。说明及注意事项第12页,共80页，2024年2月25日，星期天2.电位滴定法

原理：氨基酸为两性电解质，既含有羧基又含有氨基，加入甲醛后，甲醛与氨基酸的氨基作用，使羧基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液进行滴定，以酸度计测定终点pH=9.2

。第13页,共80页，2024年2月25日，星期天酸度计酸度计磁力搅拌器仪器第14页,共80页，2024年2月25日，星期天（1）40％中性甲醛溶液（2）0.05mol/LNaOH标准溶液

试剂第15页,共80页，2024年2月25日，星期天

吸取含氨基酸的样品溶液5-10mL于100mL容量瓶中，加水至刻度，混匀后吸取20mL置于200mL烧杯中，加水60mL，插入酸度计的指示电极和参比电极，开动磁力搅拌器，用0.05mol/LNaOH标准溶液滴定至酸度计指示pH8.2，记录消耗氢氧化钠标准溶液毫升数，供计算总酸含量。向上述溶液中加入10mL40%中性甲醛溶液，混匀。再用氢氧化钠标准溶液继续滴定至pH9.2，记录自加入甲醛后消耗氢氧化钠标准溶液毫升数。测定步骤（1）样品处理同甲醛滴定法（2）样液测定（3）做空白实验第16页,共80页，2024年2月25日，星期天式中：C---氢氧化钠标准溶液的浓度（mol/L）

V---样品溶液消耗的氢氧化钠标准溶液体积（mL）

V0---空白消耗氢氧化钠标准溶液体积（mL）

m---样品的质量（g）

0.014------氮的毫摩尔质量（g/mmol）结果计算第17页,共80页，2024年2月25日，星期天1.此法适用于测定各类食品中的游离氨基酸。2.操作简便，结果准确性高。

说明及注意事项第18页,共80页，2024年2月25日，星期天（二）氨基酸总量的测定

------茚三酮比色法

氨基酸在碱性溶液中与水合茚三酮作用，生成蓝紫色化合物，其颜色深浅在一定范围内与氨基酸含量成正比，在波长570nm下比色，测定吸光度。脯氨酸与水合茚三酮作用生成黄色化合物，需在波长440nm下比色。

原理第19页,共80页，2024年2月25日，星期天还原茚三酮水合茚三酮蓝紫色物质第20页,共80页，2024年2月25日，星期天（1）2%茚三酮溶液:茚三酮+SnCl2试剂（2）pH8.04磷酸缓冲液（3）氨基酸标准溶液:亮氨酸第21页,共80页，2024年2月25日，星期天1.制作甘露糖标准曲线：（1）绘制标准曲线测定步骤试管管号0123456氨基酸标准液（200µg/mL）0123456氨基酸含量（µg）020040060080010001200加蒸馏水（mL）8765432pH8.04磷酸缓冲液（mL）22222222%茚三酮溶液（mL）2222222第22页,共80页，2024年2月25日，星期天

混匀，置于沸水浴中加热15min，冷却后，用水定容至50mL，静置15min后，在波长570nm下比色，测定吸光度。以氨基酸含量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。第23页,共80页，2024年2月25日，星期天含水少的固体样品粉碎过筛，混匀，称取含水多的固体样品洗净擦干，去皮、核、柄，切成小块于植物组织捣碎机中，加等量的水，捣成匀浆，称匀浆液体样品直接吸取

置于小烧杯中，加蒸馏水50mL，活性炭5g，加热煮沸5min，期间不断用玻璃棒搅拌，过滤，用30~40mL热蒸馏水洗涤活性炭，收集滤液于100mL容量瓶中，定容，备用。（2）样品处理

（3）测定

吸取样液1~4mL于刻度试管中，按照标准曲线测定第24页,共80页，2024年2月25日，星期天结果计算式中：C---待测溶液的氨基酸含量（µg）

m---样品的质量（g）

v1---样品溶液总体积（mL）

v2---测定用样品溶液的体积（mL）

第25页,共80页，2024年2月25日，星期天1.茚三酮受光、空气、温度、湿度等影响而被氧化成淡红色或深红色，使用前必须纯化。2.茚三酮与氨基酸反应所产生的颜色在1h保持稳定，故应抓紧时间比色。3.该显色反应十分灵敏，故需用无氨蒸馏水。说明与注意事项方法：普通蒸馏水中加硫酸调至pH<2，使水中各种形态的氨或胺最终都变成不挥发的盐类，用附有缓冲球的蒸馏器进行蒸馏，收集馏出液即可。

无氨蒸馏水制备第26页,共80页，2024年2月25日，星期天利用各种氨基酸的不同性质，使用阳离子交换树脂在色谱柱上进行分离。洗脱下来的氨基酸和茚三酮反应生成蓝紫色化合物的颜色深浅与氨基酸的含量成正比。（三）氨基酸自动分析仪法原理第27页,共80页，2024年2月25日，星期天第28页,共80页，2024年2月25日，星期天水解：准确称取固体样品50~200mg，小心加入水解管中，加入6mol/LHCl10mL,酒精喷灯封管后，置烘箱中于110℃水解22-24小时。（1）样品处理操作步骤第29页,共80页，2024年2月25日，星期天封管的三种方式：

液态氮冷冻后封管（注意：冷冻时不能将水解管直接置液氮中，否则容易冻裂）真空泵抽真空后封管（注意：如果真空泵抽力太大，则容易在封管过程中将软化的玻璃抽碎）氮吹仪吹氮气15分钟后封管。第30页,共80页，2024年2月25日，星期天样品过滤和定容：水解后的样品取出冷却至室温，开管后过滤到25mL容量瓶中，水解管用去离子水洗涤3次，洗涤液过滤到容量瓶中，用去离子水洗涤滤纸，洗涤液也收集到容量瓶中。定容。脱酸：吸取样液1-2mL，置真空脱酸仪上脱酸。温度60℃，脱至干燥，底部留有少许固体或痕渍为止。

第31页,共80页，2024年2月25日，星期天脱酸后的样品，加入1-2mL蒸馏水溶解，置振荡混合器上混合均匀，针管吸取少量，通过0.45或0.22µm过滤器过滤后，上机分析。第32页,共80页，2024年2月25日，星期天自动分析仪氨基酸分离图谱（2）样品分析第33页,共80页，2024年2月25日，星期天测量峰高或用峰高乘以半峰宽确定峰面积计算出氨基酸的精确含量。根据峰出现的时间可以确定氨基酸的种类。第34页,共80页，2024年2月25日，星期天（一）概述二、蛋白质的测定（1）蛋白质是生命的物质基础，是构成生物体细胞组织的重要成分，是生物体发育及修补组织的原料，一切有生命的活体都含有不同类型的蛋白质。（2）人体的酸碱平衡、水平衡的维持；（3）遗传信息的传递；（4）物质的代谢及运转都与蛋白质有关。（5）人及动物需要从食品得到蛋白质及其分解产物，来构成自身的蛋白质，是人体重要的营养物质；（6）衡量食品的重要营养指标。1.蛋白质的生理功用及在食品中的作用第35页,共80页，2024年2月25日，星期天2.

食品中的蛋白质含量动物性食品：如牛肉中蛋白质含量为20.0%，猪肉中为9.5%，兔肉为21%，鸡肉为20%，牛乳为3.5%，黄鱼为17.0%，带鱼为18.0%植物性食品：大豆为40%，稻米为8.5%，面粉为9.9%，菠菜为2.4%，黄瓜为1.0%，桃为0.8%，柑橘为0.9%，苹果为0.4%和油菜为1.5%左右

第36页,共80页，2024年2月25日，星期天不同的蛋白质其氨基酸构成比例及方式不同。

一般蛋白质平均含氮量为16%，即一份氮素相当于6.25份蛋白质，此数值（6.25）称为蛋白质系数。

不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米，荞麦，青豆，鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70，牛乳及其制品为6.38。第37页,共80页，2024年2月25日，星期天3.蛋白质测定方法

测定蛋白质的方法可分为两大类：一类是利用蛋白质的共性，即含氮量、肽键和折射率测定蛋白质含量；另一类是利用蛋白质中特定氨基酸残基、酸性和碱性基团以及芳香基团等测定蛋白质含量。

第38页,共80页，2024年2月25日，星期天具体测定方法凯氏定氮法：最常用的，国内外应用普遍。快速测定法：双缩脲反应、Folin-酚法、考马斯亮蓝G250法、紫外吸收法第39页,共80页，2024年2月25日，星期天考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，当其与蛋白质结合后变为青色，在一定范围内（0-1000μg/mL），颜色的深浅与蛋白质含量成正比，在波长595nm下比色，测定吸光度。此反应十分迅速，在1h内保持稳定，反应非常灵敏。原理

（一）考马斯亮蓝法

第40页,共80页，2024年2月25日，星期天电子天平紫外-可见分光光度计仪器第41页,共80页，2024年2月25日，星期天试剂（1）牛血清白蛋白标准溶液

（2）考马斯亮蓝G250溶液：考马斯亮蓝G250+乙醇+磷酸第42页,共80页，2024年2月25日，星期天（1）标准曲线的绘制

管号123456100μg/mL牛血清白蛋白标准溶液的量（mL）00.20.40.60.81蒸馏水的量（mL）10.80.60.40.20.0蛋白质浓度（μg/mL）020406080100测定步骤

分别向各试管中，加入5mL考马斯亮蓝，盖塞，充分混合，放置2min，于595nm下比色，测定吸光度，以蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。第43页,共80页，2024年2月25日，星期天（2）样品处理含水量少的固体样品粉碎，称取0.1000-0.2000g于离心管中，加蒸馏水10mL；含水量多的固体样品加等量的水捣成匀浆，称取匀浆2-5g于离心管中，加蒸馏水6mL；放置0.5-1h，以充分提取，而后离心20min，上清液转入10mL容量瓶中，定容。

第44页,共80页，2024年2月25日，星期天（3）测定吸取提取液0.1mL，分别放入10mL具塞试管中，加蒸馏水0.9mL，加入5mL考马斯亮蓝，盖塞，充分混合，放置2min，于595nm下比色，测定吸光度，根据吸光度从标准曲线上查得待测液中蛋白质含量。

（4）做空白实验第45页,共80页，2024年2月25日，星期天结果计算式中：C---待测溶液的氨基酸含量（µg）

m---样品的质量（g）

v1---样品溶液总体积（mL）

v2---测定用样品溶液的体积（mL）

第46页,共80页，2024年2月25日，星期天说明该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

第47页,共80页，2024年2月25日，星期天灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中测定蛋白质含量时常用此法；本法亦适用于豆类、油料、谷类等作物种子及肉类等样品测定。

方法特点及应用范围（二）双缩脲法

第48页,共80页，2024年2月25日，星期天

在碱性溶液中双缩脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)能与Cu2+生成紫红色的络合物，这一反应称为双缩脲反应，蛋白质分子中的肽键也能与Cu2+发生双缩脲反应，溶液紫红色的深浅与蛋白质含量在一定范围（1～10mg）内成正比，可用分光光度计在波长540nm来测其吸光度，确定含量。原理第49页,共80页，2024年2月25日，星期天2H2N－C－NH2H2N－C－N－C－NH2＋NH3↑1320COOHO尿素双缩脲双缩脲CuSO4+NaOH紫红色物质第50页,共80页，2024年2月25日，星期天电子天平紫外-可见分光光度计仪器第51页,共80页，2024年2月25日，星期天

（1）双缩脲试剂

:硫酸铜+酒石酸钾钠+NaOH试剂（2）0.05mol/L的NaOH溶液（3）5mg/mL标准酪蛋白溶液第52页,共80页，2024年2月25日，星期天（1）标准曲线的绘制

试剂

管号123456标准酪蛋白溶液（mL）00.20.40.60.81.0蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.20双缩脲试剂（mL）444444蛋白质含量（mg）01.02.03.04.05.0测定步骤

振荡15min，室温静置30min，于波长540nm下比色，以蛋白质含量(mg)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

第53页,共80页，2024年2月25日，星期天称取烘干磨碎样品约0.2000g，放入干燥的三角瓶中。然后加入5mL0.05mol/L的NaOH溶液湿润，之后再加入20mL的双缩脲试剂，振荡15min，室温静置反应30min，过滤。（2）样品处理取滤液在540nm波长下比色，在标准曲线上查出相应的蛋白质含量(mg)。（3）样液测定第54页,共80页，2024年2月25日，星期天结果计算式中：C---从标准曲线上查出得相应的蛋白质含量(mg)m---样品的质量（g）第55页,共80页，2024年2月25日，星期天1.三角瓶一定要干燥，勿使样品粘在瓶壁上。2.所用酪蛋白需经凯氏定氮法确定蛋白质的含量。3.此法简单、快速、有较好的精确度，分析对象较广泛，但此法准确度稍低，有色物质、还原糖、淀粉、脂类等对本法测定谷物样品蛋白质含量干扰较大。

说明与注意事项第56页,共80页，2024年2月25日，星期天凯氏定氮法是测定总有机氮量较为准确的方法之一，故国内外应用较为普遍，是一经典分析方法，至今仍被作为标准检验方法。（三）凯氏定氮法食品中的含氮化合物大多以蛋白质为主体，所以检验食品中蛋白质时，往往测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数，即可得到蛋白质含量。凯氏定氮法可用于所有动物性、植物性食品的蛋白质含量测定。

第57页,共80页，2024年2月25日，星期天因样品中常含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，故通常将测定结果称为粗蛋白质含量。为什么凯氏定氮法测得的蛋白质含量为粗蛋白含量？第58页,共80页，2024年2月25日，星期天1.常量凯氏定氮法将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨，并与硫酸结合成硫酸铵，此过程称为消化。加碱将消化液碱化，使氨游离出来，再通过水蒸气蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收形成硼酸铵。再以标准盐酸或硫酸溶液滴定，根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。

原理第59页,共80页，2024年2月25日，星期天①样品消化2NH2(CH)2COOH＋13H2SO4→

(NH4)2SO4

＋6CO2＋12SO2

＋16H2O第60页,共80页，2024年2月25日，星期天浓硫酸具有脱水性，有机物脱水后被炭化为碳、氢、氮浓硫酸又具有氧化性，将有机物炭化后的碳氧化为二氧化碳，硫酸则被还原成二氧化硫

2H2SO4

＋C＝2SO2＋2H2O＋CO2

二氧化硫使氮还原为氨，本身则被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸作用生成硫酸铵留在酸性溶液中。H2SO4＋2NH3

＝(NH4)2SO4第61页,共80页，2024年2月25日，星期天

硫酸铜：起催化剂的作用。还有氧化汞、汞、硒粉等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。

硫酸钾：目的是为了提高溶液的沸点，加快有机物的分解（纯硫酸沸点340℃，加入硫酸钾之后可以提高至400℃以上。）。也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类来提高沸点，但效果不如硫酸钾。在消化时常加入硫酸钾、硫酸铜等催化剂第62页,共80页，2024年2月25日，星期天②蒸馏2NaOH＋(NH4)2SO4＝

2NH3↑

＋Na2SO4＋2H2O

③吸收与滴定

2NH3+

4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O=2NH4Cl+4H3BO3第63页,共80页，2024年2月25日，星期天适用范围

此法可应用于各类食品中蛋白质含量测定仪器①500mL凯氏烧瓶；②定氮蒸馏装置第64页,共80页，2024年2月25日，星期天第65页,共80页，2024年2月25日，星期天（1）浓硫酸（2）硫酸铜（3）硫酸钾

试剂（4）40%氢氧化钠溶液

（5）4%硼酸吸收液（6）0.1mol/LHCl标准溶液（7）甲基红和溴甲酚氯混合指示剂1份0.2%的甲基红乙醇溶液和5份0.2%溴甲酚氯乙醇溶液混合。第66页,共80页，2024年2月25日，星期天

称取固体样品0.2000~2.0000g（液体样品10~20mL，半固体样品2~5g），小心放于500mL凯氏烧瓶中，加入研细的硫酸铜0.5g，硫酸钾10g，浓硫酸20mL，轻轻摇匀，在凯氏瓶口盖一小漏斗，斜放于电炉上小火加热(在通风橱内加热消化),待内容物全部炭化，泡沫停止产生后，加大火力，保持瓶内液体微沸，至液体变为透明的蓝绿色后，再继续加热微沸30min，冷却。加入200mL蒸馏水，加入玻璃珠数粒。测定步骤（1）样品消化第67页,共80页，2024年2月25日，星期天

将凯氏烧瓶连接好，塞紧瓶口，冷凝管下端插入接收瓶液面以下，接收瓶内预先装有50mL4%硼酸溶液和2~3滴混合指示剂，放松夹子，通过漏斗加入70~80mL40%氢氧化钠溶液并摇动凯氏烧瓶，瓶内溶液变为深蓝色，或产生黑色沉淀，再从漏斗加入100mL蒸馏水，夹紧夹子，加热蒸馏，至氨全部蒸出（馏出液约为250mL），将冷凝管下端提离液面，用蒸馏水冲洗管口，继续蒸馏1min，用表面皿接几滴溜出液，用奈氏试剂检查，如无红棕色物质生成，表示蒸馏完毕。

（2）蒸馏、吸收第68页,共80页，2024年2月25日，星期天将上述吸收液用0.1mol/LHCl标准溶液滴定，至溶液由蓝绿色变为紫红色即为滴定终点，记录消耗HCl标准溶液的体积。（3）滴定（4）做空白实验第69页,共80页，2024年2月25日，星期天式中:

c—盐酸标准液的浓度(mol/L)V0—空白滴定消耗标准液量(mL)V1—试剂滴定消耗标准液量(mL)m—样品质量(g)0.014—氮的毫摩尔质量(g/mmol)

6.25—蛋白质换算系数。结果计算第70页,共80页，2024年2月25日，星期天1.所用试剂溶液应用无氨蒸馏水配制。2.消化时不要用强火，注意不断转动凯氏烧瓶，以便利用冷凝酸液将附在瓶壁上的固体残渣洗下并促进其消化完全。3.样品中若含脂肪或糖较多时，消化过程中易产生大量泡沫，为防止泡沫溢出瓶外，在开始消化时应用小火加热，并不断摇动；或者加入少量辛醇或液体石蜡或硅油消泡剂，并同时注意控制热源强度。说明及注意事项第71页,共80页，2024年2月25日，星期天4.当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30％过氧化氢2~3mL后再继续加热消化。5.若取样量较大，如干试样超过5g，可按每克试样5mL的比例增加硫酸用量。6.一般消化至呈透明后，继续消化30min即可，但对于含有特别难以氨化的氮化合物的样品，如含赖氨酸、组氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等时，需适当延长消化时间。有机物如分解完全，消化液呈蓝色或浅绿色，但含铁量多时，呈较深绿色。第72页,共80页，2024年2月25日，星期天7.蒸馏装置不能漏气。8.蒸馏前若加碱