蛋白质组学的研究方法和进展.ppt

第九章 蛋白质组学的研究方法和进展 背 景 基因数量有限性和基因结构的相对稳定性 vs 生命现象的复杂性和多变性 从genomic到proteome n对蛋白质的数量、结构、性质、相互关 系和生物学功能进行全面深入的研究已 成为生命科学研究的迫切需要和重要任 务。 第一节 蛋白质组学的概念及其发展史 第二节 蛋白质组学研究方法概述 第三节 蛋白质组学在疾病研究中的应 用 主要内容 第一节 蛋白质组学的概念及其发展 史 n蛋白质组是澳大利亚学者Williams和 Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白 质（protein）与基因组（genome）两 个词的杂合,意指proteins expressed by a genome，即“一个细胞或一个组 织基因组所表达的全部蛋白质”。 一、蛋白质组学的概念 n对应于基因组的所有蛋白质构成的 整体，不是局限于一个或几个蛋白 质。 n同一基因组在不同细胞、不同组织 中的表达情况各不相同 。 n在空间和时间上动态变化着的整体 。 蛋白质组是： 蛋白质组学(proteomics) 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一 门新兴科学，其目的是从整体的角度分析 细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达 水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互 作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命 活动规律。 主要研究内容 了解某种特定的细胞、组 织或器官制造的蛋白质种类； 明确各种蛋白质分子是如 何形成类似于电路的网络的； 描绘蛋白质的精确三维结构，揭 示其结构上的关键部位，如与药物结 合并且决定其活性的部位。 n研究对象 n基础技术 n研究层次 功能蛋白质组学 (functional proteomics)的提出 n功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某 一生理现象相关的所有蛋白质。 n介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研 究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质 组学之间。 n从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚 群体。 n将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接 近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白质 组图谱。 二、蛋白质组学的产生与发展 背 景 基因组时代 后基因组时代 研究重点的转移及其标志 功能基因组学的主要任务 mRNA水平的基因表达研究取得进 展，但mRNA与蛋白质间的相关系 数仅为0.40.5 蛋白质自身特点难以从DNA和 mRNA水平得到解答 进 展 各国政府支持，国际著名研究和商业机构 加盟： 1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白 质组研究中心（Australia Proteome Analysis Facility，APAF） 美国国立癌症研究院（NCI）投资1 000万 美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋 白质组数据库。 NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不 同阶段的蛋白质组数据库。 英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成 或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋 白质组研究。 Celera公司投资上亿美元独自启动了全 面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体 液中的蛋白质及其异构体，构建新一代 的蛋白质表达数据库的工作。 1997年召开了第一次国际“蛋白质组学 ”会议 1998年在美国旧金山召开了第二届国 际蛋白质组学会议 1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋 白质组会议 我国也于1998年启动了蛋白质组学 研究，在中科院上海生物化学研究所 举办了两次全国性的蛋白质组学研讨 会 2003成立了中国人类蛋白质组 组织（CHHUPO），并分别于2003 年9月、2004年8月以及2005年8月 召开了中国蛋白质组学首届、第二届 及第三届学术大会，2004年10月在 中国北京召开了第三届国际蛋白质组 学会议。 n 科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973” 计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金 委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。 n我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组 研究方面取得了较大的进展。 第二节 蛋白质组学研究方法概述 蛋白质组研究更为复杂和困难： 蛋白质数目大大超过基因数目。 蛋白质随时间和空间而变化。 发展高通量、高灵敏度、高准 确性的研究技术平台是现在乃至相 当一段时间内蛋白质组学研究中的 主要任务。 当前主要任务 一、蛋白质组表达模式的 研究方法 n研究蛋白质组的组成成分 n支撑技术主要有双向凝胶电泳 、以质谱为代表的蛋白质鉴定 技术及生物信息学分析。 蛋白质组表达模式（ expression profile）： （一）蛋白质组研究中的样品制备 n通常可采用细胞或组织中的全蛋白 质组分进行蛋白质组分析。 n也可以进行样品预分级，即将细胞 或组织中的全体蛋白质分成不同部 分，分别进行研究。 样品预分级的主要方法 n蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性 蛋白等 n蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等 n蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基 体、叶绿体等 样品预分级主要作用在于 提高低丰度蛋白质的上样量 和检测灵敏度。 组织水平上的蛋白质组样品制备 临床样本都是各种细胞或组 织混杂，而且状态不一，如肿瘤中 癌变的上皮类细胞总是与血管、基 质细胞等混杂。 激光捕获显微切割(laser capture microdissection，LCM) 可直接在显微镜下从组织切片 中精确分离特定的细胞或细胞群。 （二）蛋白质组研究中的样品分离 n双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis，2-DE)：利用蛋 白质的等电点和分子量，结合凝胶 化学特性，分离各种蛋白质的方法 。 原 理 第一向在高压电场下对蛋白质进 行等电聚焦(IEF), 再在第一向垂直方 向上进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳(SDS-PAGE)。 1975年首先由OFarrell等创立 。 特 点 n可分离10100 kD分子量的蛋白 质 n高灵敏度和高分辨率 n便于计算机进行图像分析处理 n与质谱分析匹配 第一向IEF电泳 n传统OFarrell系统双向电泳的缺陷 。 nBjellgvist等发展并完善了固相pH 梯度等电聚焦技术，Grg等成功地 将之应用于双向电泳。 优点 固相pH梯度等电聚焦的优点 克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点 。 稳定的可以随意精确设定的pH梯度。 尤其可在较窄的pH范围内进行第二 轮分析，大大提高了分辨率及重复性。 第二向SDS-PAGE电泳 垂直板电泳 水平超薄胶电泳 2-DE技术的缺点 极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质 ，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰 度蛋白质用此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质 谱联用实现自动化。 新型非凝胶技术 液相色谱法 liquid chromatography，LC 毛细管电泳 capillary electrophoresis，CE n液质联用技术（LC-MS/MS） 蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以 代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽 段分子量，再通过串联MS技术，得到部分 序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定 蛋白质。 根据蛋白质带电性及疏水性不同 ，用MS分离多肽复合物。 n多维色谱技术（LC/LC-MS/MS） n多维蛋白质鉴定技术 (multidimensional protein identification technology) （三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定 传统方法：蛋白质微量测序 氨基酸组成分析 新型蛋白质鉴定技术 质谱（MS）法 基本原理：样品分子离子化后， 根据离子间质荷比（m/z）的差 异来分离并确定样品的分子量。 “软电离”的特点 n分子电离时保留整个分子的完整性， 不会形成碎片离子。 n灵敏度高、快速、能同时提供样品的 精确分子量和结构信息、既可定性又 可定量、并能有效地与各种色谱联用 来分析复杂体系。 n基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱 （matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI- TOF MS） n电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS） 主要质谱类型 鉴定和注释蛋白质的路线 n通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻 匹配 n通过测出样品中部分肽段二级质谱信息 或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配 目 录 仪 器 nMALDI-TOF质谱仪：灵敏度 高（可达fmol），分析速度快 ，谱图简单易于解析以及受缓 冲液、盐份的干扰小 肽质谱指纹图在数据库中匹配 不成功的可能原因 n 样品量太少，PMF图信噪比太低，输 入库中搜寻的数据质量不好。 n2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非 单一蛋白质，所获PMF图实际上是两 个以上蛋白质的混合图。 n 操作中角蛋白或其他蛋白质的污染 n蛋白质发生了较多的转译后修饰，数 据库中未有记载 n所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自 酶解片段多 n未知的新蛋白质 n数据库规模太小 续： 组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（MALDI- TOF/TOF） 傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS） 表面增强激光解吸/电离飞行时间质 谱（SELDI-TOF-MS） 联合技术精确鉴定蛋白质 （四）蛋白质组学研究的生物信息学 生物信息学是蛋白质组学研究 的一个不可缺少的部分。 构建和分析双向凝胶电泳图谱 数据库的搜索与构建 应 用 蛋白质组数据库是蛋白质组 研究水平的标志和基础 n瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上 最大、种类最多的蛋白质组数据库。 n目前应用最普遍的数据库是NRDB 和 dbEST数据库。 dbEST数据库 由美国国家生物技术信息中心（NCBI）和 欧洲生物信息学研究所（EBI）共同编辑， 包括许多生物体的表达序列标签（EST） 肽序列标签(PST)或部分序列信 息最适合查寻 概念：把一个基因组表达的全部 蛋白质或一个复杂体系中所有的 蛋白质进行精确的定量和鉴定。 （五）定量蛋白质组学研究 低丰度蛋白质检测困难 蛋白质表达量差异很小，如在50% 以下时，精确定量成为瓶颈 蛋白质表达的瞬时变化 蛋白质定量的难点 1基于双向凝胶电泳的定量 蛋白质组研究策略 双向凝胶电泳(2-DE)是目前唯一能分离 展示大量蛋白质并进行蛋白质定量分析的 一种方法。 荧光差异显示双向电泳（F-2D-DIGE） 2基于生物质谱的定量蛋白 质组研究策略 原理：对于具有相同离子化能力的蛋 白质或多肽，可以通过比较质谱峰的 强度（或峰面积）得到待比较蛋白质 的相对量。 二、蛋白质组功能模式的 研究方法 n揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互 协调的关系，并深入了解蛋白质的结构 与功能的相互关系，以及基因结构与蛋 白质结构功能的关系。 主要研究目标 （一）蛋白质翻译后修饰的研究 翻译后修饰 糖基化 乙酰化 甲基化 羧基化 二硫键 n修饰肽的检测的高灵敏度方法 n蛋白质翻译后修饰的定量分析 n合适的修饰状态下处理和电离条件 n测定工作量巨大 研究面临的困难： （二）蛋白质相互作用研究技术 n生命的基本过程是不同功能蛋白质在时 空上有序和协同作用 n新陈代谢以蛋白质复合体或多蛋白质网 络协同作用实现 n细胞信号转导及病原体感染和免疫反应 n1989年Field 和Song等人在酵母细胞 中设计的分析蛋白质相互作用的方法。 n以真核细胞转录激活因子的结构和活性 特点为基础的。 1酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system） 转录激活因子GAL4的特点 nN端含NLS和与酵母GAL1基因启动子上 游激活序列(UASG)结合的结构域 nC端含GAL1转录激活结构域 n功能上相互独立又互相依赖，只有 通过某种方式结合在一起才具有完 整的转录因子活性 系 统 构 建 n分别构建含GAL4 BD 和AD 的两 个酵母融合蛋白表达载体； n建立含特殊基因型、适用于双杂交 体分析的酵母菌株 主要特点和优势 n使蛋白质表现型和基因型相联系 n筛选cDNA文库 n真实反应体内蛋白质间相互作用情 况 n不需分离靶蛋白 n敏感性高 缺 点 1.假阳性结果 2.假阳性结果 3.限于核内表达的蛋白质的相互作用 2噬菌体表面显示技术 ( phage display ) 三个基本因素： 在噬菌体p和p衣壳蛋白N端插入外 源待筛基因编码的蛋白，形成的融合蛋白表 达在噬菌体颗粒的表面；同时其保持的外源 蛋白天然构象能被相应的抗体或受体识别 n利用固相支持物上的抗体或受体，采用亲 和筛选法（panning），从噬菌体文库中 筛选出能结合筛选分子的目的噬菌体。 n外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面， 其编码基因可通过分泌型噬菌体的单链 DNA测序推导出来。 主 要 应 用 筛选与特异抗体或受体相互作用的蛋白质 研究抗体或受体的结合位点 构建随机肽库、抗体库和蛋白文库 改造和提高蛋白质的生物学和免疫学特性 研究新型多肽药物、疫苗和抗体 研究涉及到蛋白质与核酸相互作用的生物 学过程和新型的基因治疗导向系统 主要优点 n在细菌外完成 n高度的选择性 n亲和纯化反应高效性 n不需要了解筛选分子结构 缺 点 n限制肽段大小 n外源蛋白质无法正确折叠或修饰 n融合蛋白可能会影响到蛋白质本身活性 3基于质谱的蛋白质相互作用 研究方法 n靶蛋白制备 n蛋白质复合体的纯化 n蛋白质复合体的质谱鉴定 基本步骤： （1）亲和层析耦联质谱技术 n基本原理：将某种蛋白质以共价键固定在基质 （如琼脂糖）上，含有与之相互作用的蛋白质 的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结 合的蛋白质，然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱 结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱 耦联质谱技术（MDLC-ESI-MS/MS）鉴定靶 蛋白的结合蛋白。 先决条件先决条件 n得到足够多的保持生物活性的重组 靶蛋白作为诱饵（bait） n获得足够量、纯度高的与诱饵相互 作用的蛋白质 利用含靶蛋白的融合蛋白获得 相互作用蛋白质 n谷胱甘肽S转移酶（glutathione S -transferase，GST）融合蛋白 n蛋白A融合蛋白 主要优点 n灵敏度高：高浓度靶蛋白 n候选蛋白质与靶蛋白的结合机会均 等 n检测多亚基蛋白质之间的相互作用 （2）免疫共沉淀耦联质谱技术 n原理：以细胞内源性靶蛋白为诱饵， 用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免 疫共沉淀（immuno-precipitation ，IP）纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶 电泳分离后，质谱鉴定靶蛋白的结合 蛋白。 研究鼻咽癌细胞系中的研究鼻咽癌细胞系中的p53p53 相互作用蛋白相互作用蛋白 n抗p53抗体与HNE1和HNE2总蛋白进 行免疫共沉淀 nSDS-PAGE分离免疫沉淀复合物 n切取p53结合蛋白条带，酶解后进行电 喷雾串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分 析，得到相应的肽序列标签 n搜索数据库 特 点 生理条件下蛋白质之间的相互作用 所有蛋白质与靶蛋白的相互作用 可检测依赖于修饰的蛋白质相互作用 局 限 性 A. 灵敏性不高 B.