《CR分子标记》PPT课件.ppt

聚合酶链反应技术（PCR） 及分子标记 聚合酶链反应技术简称PCR技术，是一 种利用DNA变性和复性原理在体外进行 特定的DNA片段高效扩增的技术，可检 出微量靶序列（1个copy）。在模板 DNA、引物和dNTP存在的条件下依赖于 DNA聚合酶的酶促合成反应。 仅需用极少量模板，在一对引物介导下 ，在数小时内可扩增至100-200万copy. PCR(Polymerase Chain Reaction) Three steps: denaturation, primer annealing, polymerization. PCR反应分三步：变性、退火及延伸。 发展历史 60s-70s：基因的体外分离技术。 Khorana（1971）：美国教授、1968年诺贝 尔医学奖得主，提出 “经过DNA变性，与合适 引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重 复该过程便可克隆tRNA基因”。 Kary Mullis(1985) 发明过程 Mullis 在“偶然想出的聚合酶链反应”一文中写到 : “这种简单得令人惊奇，可以无限量地拷贝DNA 片段的方法是在不可想象的情况下，即驾车行驶在 月色下的加利福尼亚山间公路上时想出来的”。 专利官司 1987年美国专利局专利授权 1989年，DuPont异议，大小公司对簿公堂，将决定 谁将获得诺贝尔奖。DuPont理由是，1971年PCR的雏 形已由Khorana一系列文章阐明，并公布于众，应当 是公共产权。斯坦福大学Kornberg（研究DNA聚合酶 获诺贝尔奖）也认为，任何具备生物技术知识的人都 可以从Khorana等的文章中推知如何操作PCR。 美国专利局驳回DuPont异议，地方法院判属Cetus Cetus获胜后马上反诉，指出DuPont已侵犯另一项与 PCR有关的专利并要求对方赔偿以及不再销售与PCR 有关试剂和仪器。 PCR发展速度 惊人，没有一种技术能与之相比 引用论文最多、应用范围十分广泛 1993年度诺贝尔化学奖：Mullis，与开 创了“寡核苷酸基因定点诱变”加拿大 籍英国科学家Michael Smith共获。 PCR具有特异、敏感、产率高、快速、简 便、重复性好、易自动化等突出优点；能 在一个试管内将所要研究的目的基因或某 一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百 万倍, 肉眼能直接观察和判断；可从一根毛 发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量 的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天 几星期才能做到的事情，用PCR几小时便 可完成。PCR技术是生物医学领域中的一 项革命性创举和里程碑。 Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚 合酶I的Klenow片段，其缺点是： Klenow酶不耐高温，90会变性失活，每次 循环都要重新加。 引物链延伸反应在37下进行，容易发生模板 和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差 ，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催 化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出 的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板 进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶 只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程 序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内 没能引起生物医学界的足够重视。 1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合 酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一 ，真实性也较高，但每循环一次，仍需 加入新酶。1988年Saiki 等从温泉中分离 的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合 酶。 此酶特点： 耐高温，在70下反应2h后其残留活性大于原 来的90%，在93下反应2h后其残留活性是原来 的60%，在95下反应2h后其残留活性是原来的 40%。 在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应 后再加新酶。 大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加 了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和 效率，因而其灵敏性也大大提高，此酶为Taq DNA多聚酶(Taq DNA Polymerase)。 PCR技术的基本原理 其特异性依赖于与靶序列两端互补 的寡核苷酸引物。 模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时 间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解 离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准 备； 模板DNA与引物的退火：模板DNA变性成单链后，温 度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补配对结合 ； 引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶 的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基 配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互 补链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一 个循环需24min，23h就能将待扩目的基因扩增放大 几百万倍。 标准的PCR反应体系： 10扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10100pmol 模板DNA 0.12ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸水至 100ul PCR反应五要素：参加PCR反应的物质 主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和 Mg2+ 引物：引物是PCR特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度 设计引物应遵循以下原则： 引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。 引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下 可扩增长至10kb的片段。 引物碱基：G+C含量以40-60%为宜，G+C太少扩 增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶 核苷酸的成串排列。 避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互 补，特别是3端的互补，否则会形成引物二聚体 ，产生非特异的扩增条带。 设计引物应遵循以下原则： 引物3端的碱基，特别是最末及倒数第 二个碱基，应严格要求配对，以避免因末 端碱基不配对而导致PCR失败。 引物中有或能加上合适的酶切位点，被 扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这 对酶切分析或分子克隆很有好处。 引物的特异性：引物应与核酸序列数据 库的其它序列无明显同源性。 引物量： 每条引物的浓度0.11umol或10 100pmol，以最低引物量产生所需要的 结果为好，引物浓度偏高会引起错配和 非特异性扩增，且可增加引物之间形成 二聚体的机会。 dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切 关系，dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高 浓度后，小量分装， -20冰冻保存。 多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中， dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4 种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其 中任何一种浓度不同于其它几种时，就会 引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的 产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。 模板的量与纯度，是PCR成败与否的关键 环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用 SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种 dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度 为1.52.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过 高，反应特异性降低，出现非特异扩增 ，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活 性，使反应产物减少。 变性温度与时间： 变性温度低，解链不完全是导致PCR失 败的最主要原因。一般情况下，93 94lmin足以使模板DNA变性，若低于 93则需延长时间，但温度不能过高， 因为高温环境对酶的活性有影响。 退火(复性)温度与时间： 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变 性后温度快速冷却至4060，可使引物和 模板发生结合。退火温度与时间，取决于引物 的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的 长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引 物，55为选择最适退火温度的起点较为理想 。 引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适 的温度： Tm值(解链温度)=4(G+C)2(A+T) 复性温度=Tm值-(510) 在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可 大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR反应的特异性。复性时间一般为30 60sec，足以使引物与模板之间完全结合。 (c)(c) (b)(b) 引物引物2 2 5533 33 33 55 55 ( (d)d) 新引物新引物 5533 靶靶DNADNA的扩增的扩增 (a)(a) 5533 引物引物1 1 3 3 55 3355 引物引物2 2互补链互补链引物引物1 1互补链互补链 单位长度的链单位长度的链 不同长度的链不同长度的链 5 5 3 3 3 3 5 5 引物引物1 1互补链互补链 引物引物2 2互补链互补链 目的片段（不同长度的链未示出）目的片段（不同长度的链未示出） 聚合酶链式反应示意图聚合酶链式反应示意图 (e)(e) (f)(f) (g)(g) 温度（温度（ ） 时间（时间（minmin ） 9494 7272 6060 9494变性（变性（ 1min1min） 60 60 退火退火 （1min1min） 72 72 延伸延伸 （1.5min1.5min） 循环循环1 1 循环循环2 2 循环循环3 3 PCRPCR反应的温度循环周期反应的温度循环周期 PCR PCR 反应的每一个温度循环周期都是由反应的每一个温度循环周期都是由DNADNA变性、引变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是应参数是9494变性变性1min1min， 60 60 退火退火1min1min， 72 72 延伸延伸1.5min1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增如此周而复始，重复进行，直至扩增 产物的数量满足实验需求为止。产物的数量满足实验需求为止。 procedures template(DNA or RNA), primers, Taq enzyme, 10PCR buffer, Mg+, 5mmol/L dNTPs pre-denaturation- denature completely Denaturation annealing Elongation cycles:25-30 Taq DNA聚合酶 分离:1969年，美国黄石国家公园 温泉 分子量:94KDa 活性：在几种水生栖热菌中活性最 高，200 000U/mg Taq DNA聚合酶 离子需要：对Mg2+、单价离子性质和浓度较 敏感。最适浓度为50mmol/L。 忠实性:没有校正单核苷酸错配功能-致命弱 点。一般出错率为210-4核苷酸/每轮循环 ，利用PCR克隆、测序时尤应注意。 Taq DNA聚合酶 抑制剂:尿素、乙醇、DMSO、DMF、甲酰胺、 SDS及许多其他化学药剂。 内源DNA:不同来源的酶可能由于制备过程中 残留的原细菌DNA或PCR产物的污染而含有 不明来源的DNA。在使用扩增保守序列的通 用引物时，会在无模板对照管出现扩增带 。 保存:在-20至少6个月。 PCR污染及其对策 强大扩增能力+检测的敏感性 极微量的污染便可导致假阳性 污染源的追踪 点样器和加样器;离心机;微解剖刀;浓 缩用具、真空瓶;电泳装置;紫外灯箱;乙 醇或水浴锅;冰箱门把手、实验台面等 污染的预防 (1)隔离不同操作区 (2)分装试剂 (3)改进实验操作 (4)专用加样器 (5)结果的重演 PCR技术的应用 遗传性疾病 地中海贫血的基因诊断 血友病 苯丙酮尿症 传染性疾病 肝炎 性病 肿瘤 法医学 个人识别、亲子鉴定 1985年，英国遗传学家Jeffreys采用DNA 指纹图谱进行个人识别和亲子鉴定。 有时犯罪物证量很少，不足以用来进行 DNA指纹分析，PCR有效解决这些问题。对 于犯罪现场中遗留的少量生物物证，如一 根毛发、一滴血等都可用于分析，在法医 学上认证罪犯、亲子鉴定以及人的性别鉴 定中PCR技术被普遍采用。 植物遗传育种 构建遗传图谱、分离目的基因、 基因定位 分子标记辅助育种 了解不同品种间的亲缘关系、系统 进化 畜 牧 畜禽病诊断:猪伪狂犬病毒、猪口蹄疫 病毒、猪瘟病毒、牛白血病毒、牛病 毒、性腹泻病毒、免疫缺陷病毒等检 测 性别鉴定：牛、绵羊Y染色体上特异 DNA片段 构建基因图谱 检测基因整合与表达：转基因鱼 植物保护 杀虫病原微生物的基因型鉴定 植物病原微生物分类 形态学上相似性和潜在的血清学 交互反应，用常规方法难以区分，采 用反转录PCR（RT-PCR）可准确快速区 分 其他 考古学 植物分类学 群体生态学 定点突变技术（定点突变技术（site-directed site-directed mutagenesis)mutagenesis) 通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变 所编码的氨基酸序列，常用来研究某个氨 基酸对蛋白质的结构、催化活性以及结合 配体能力的影响，也用于改造DNA调控元 件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶 切位点等。 55 33 33 55 靶靶DNADNA片段片段 引物引物A A 5 55 5 引物引物AA 3333 PCRPCRPCRPCR PCRPCR 3 33 35555 PCRPCR 引物引物B B引物引物C C 5 55 53333 混合混合, ,变性变性, ,退火退火 55 33 55 33 33 55 33 55 + + DNADNA聚合酶聚合酶 55 33 33 55 55 33 33 55 用引物用引物B B和和C C作作PCRPCR PCRPCR定点诱变定点诱变 2 2、PCRPCR用于基因突变用于基因突变 逆转录聚合酶链式反应 (RTPCR) RT-PCR间接用来扩增从RNA分子得到的 一段特异序列。RNA首先被逆转录为 cDNA。用位于一段特异序列或者一个基因 两侧的引物生成以cDNA为模板的PCR产 物成为一个标准的PCR反应。得到阳性产 物说明存在着特异的RNA序列。 对于一个成功的PCR反应来说，寡聚核 苷酸引物是最重要的组分。引物的长度 范围通常在18至25个核苷酸之间。用常 规条件扩增的PCR产物的长度范围为100 1000bp。 实时定量PCR Real-time Quantity PCR 定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起 来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技 术是一种在PCR反应体系中加入荧光基团 利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程 ，最后通过标准曲线对未知模板进行定量 分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模 板的定量而且具有灵敏度高、特异性和可 靠性更强、能实现多重反应、自动化程度 高、无污染性、具实时性和准确性等特点 。 作用原理 实时荧光定量PCR常用的检测模式五种： （1）TaqMan探针 （2）SYBR Green （3）LUX引物 （4）Molecular beacon （5）荧光谐震能量传递（FRET,Roche product） TaqMan探针方法的作用原理: 原理：利用Taq 酶的53外切核酸酶活性 并在PCR过程中反应体系加入一个荧光标记 探针。 TaqMan探针5端标以荧光发射基团，3 端标以荧光猝灭基团。该探针在PCR过程中 不能被延伸。当探针保持完整时，3端猝灭 基团抑制5发射基团的荧光发射。 在PCR的退火期，探针与引物所包含序列 内的DNA模板发生特异性杂交。延伸期引 物在Taq酶作用下沿DNA模板延伸，当到 达探针处，Taq酶发挥53外切核酸酶活 性，继而发生置换，切断探针后，发射基 团远离猝灭基团，荧光信号得到释放。 这时荧光探测系统便会检测到光密度增 加。模板每复制一次，就有一个探针被切 断，伴有一个荧光信号的释放。 由于被释放的荧光基团数目和PCR产物 数量是一对一的关系，且光密度同释放的 荧光基团的数目也成正比关系，因此该技 术可对模板准确定量。由于扩增产物短时 效率较高，故扩增长度一般为50150bp 。 实时PCR技术原理 探针设计一般应符合以下条件： (1) GC碱基含量在40%-60%。 （2） 避免单核苷酸序列的连续重复，尤其是G。 （3）避免5端为G， 因为G对荧光可能有抑制作 用，尽量使C个数多于G。 （4）长度应在15-25个碱基左右，以保证结合的 特异性。 （5）探针的Tm值要比引物的Tm值至少高出约10 另外，探针与引物不能形成二聚体， 位置与上游 引物尽量接近但不要重叠。 (2) SYBR Green I荧光染料的原理 SYBR Green I是一种只与双链DNA小沟结 合的染料，当它与DNA双链结合时，发出 荧光；从DNA双链上释放出来时，荧光信 号急剧减弱。因此，在一个体系内，其信 号强度代表了双链DNA分子的数量。它的 缺点是在于能与非特异性双链DNA（如引 物二聚体）结合，但是其产生的干扰可能 通过熔解曲线分析得到解决。 (3)LUX引物 LUX 引物是利用荧光标记的引物实现定量的一项 新技术。目的使用类分子信标的发夹结构设计引物 ，使引物同时起到荧光探针的作用。引物对中的一 个引物3端用荧光报告基团标记。在没有单链模板 的情况下，该引物自身配对，形成发夹结构，使荧 光淬灭。在模板存在的情况下，引物与模板配对， 发夹结构打开，产生荧光信号。使用LUX引物，不 需要专门设计探针，即省了成本又给实验设计提供 了宽松的条件。 图.LUX 引物工作原理 Lux引物 LUXTM 技术的优势 1.通过/dlux-easy-to-use methode设计适合客户的实验的LUXTM Primer。 2.购买已经验证，即用的LUXTM Primer这 些引物只适合看家基因（40）和人类基 因。 3.通过和Invittrogen Custom LUXTM Primer服 务中心联系，由专家给您设计适合您实验 的新的引物。 分子标记（Molecu