《凝胶排阻》PPT课件.ppt

第四章 凝胶（排阻）层析 中国医科大学实验技术中心 孙晋民 1 排阻层析(exclusion chromatography)，亦称分子筛层析 (molecular sieve chromatography)、凝胶过滤 (gelfiltration)。凡是利用生物大分子的相对分子质量 (relativemolecular mass，Mr)差异进行层析分离的方法，均 称之为排阻层析。用于排阻层析的分离介质称为排阻层析介质 。在20世纪60年代初就开始使用凝胶介质分离生物大分子。例 如，用淀粉或者琼脂糖作为电泳支持物分离血清中的蛋白质， 凝胶在其中起分子筛作用。后来人们将凝胶制成球形微珠，作 为液相层析分离介质，用于分离生物大分子，并获得巨大成功 。现在使用的凝胶层析介质的用途远远超出了电泳分离介质的 范畴，已成为分离纯化生物大分子最重要的分离介质之一，也 是作为合成带有配基的层析介质应用最广泛的一种载体。凝胶 层析介质主要是以葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等为原料，通 过特殊工艺合成的层析介质。目前已成为生物化学、分子生物 学和生物制药在研究和生产中必不可少的分离介质。 第一节第一节 概述概述 2 第二节 凝胶层析原理 一、基本原理 凝胶类层析介质是一种在球体内部具有大 孔网状结构凝胶微粒，不同大小的网状孔径 像筛子一样，可以把大小不同的生物大分子 按一定的顺序进行分离，好像“目数”不同的 普通筛子一样把大小不同颗粒分级筛分。但 是排阻层析与普通筛分的原理不同，排阻层 析是按生物分子分子量的大小排序进行筛分 的。 3 相对分子质量大的生物分子由于不能进入 或不能完全进入凝胶内部的网状孔，沿着凝胶 颗粒间的空隙或大的网状孔通过，大分子相对 于小分子迁移的路径近，在柱内的停留时间短 ，保留值小，所以在层析过程中迁移率最快， 走在小分子的前面，先从柱中流出； 4 分子量小的分子由于能够进入凝胶内部 的网状孔，沿着凝胶颗粒不同大小的网状 孔流过，相对于大分子迁移的路径长，在 柱内的停留时间长，保留值大，所以在层 析过程中迁移率最慢，走在大分子的后面 ，后从柱中流出。 5 样品中分子量大小不同的各种分子在流过 凝胶内部网状孔时就受到凝胶介质排阻效应， 也称为分子筛效应，将它们一个一个分离，从 而达到分离的目的。普通筛分是大颗粒不能通 过筛子的筛孔而被截留在筛板的上面，小颗粒 可以通过筛孔。所以普通筛分与凝胶层析筛分 的原理是不一样的。排阻层析分离的基本原理 如图所示。 6 7 凝胶层析介质分离的分子主要分3部分。 第一部分是全排阻分子，也可称之为上限分 子量，不能起筛分作用的大分子。第二部分 是部分渗透分子，称为分离分子，是凝胶介 质有效分离的分子。第三部分是全渗透分子 ，称之为下限分子量，是不能起筛分作用的 小分子。 8 从图可以看出，A-B之间为该凝胶的有效分 离范围，可分离相对分子质量范围是1000 100000，高于相对分子质量为100000的是全排 阻分子，低于相对分子质量为1000的是全渗透 分子。 凝胶层析的分离范围示意图 9 二、参数的表示方法及其意义 1.柱床体积 凝胶层析介质经溶胀、装柱、沉降、体 积稳定后，所占层析柱内的总体积，称为柱床体积 或床体积，以Vt(total volume)表示，单位为ml。 2.外水体积 存在于柱床体积内凝胶颗粒之外、颗粒 之间的空隙所占有的那一部分水相体积或溶剂体积 ，称之为外水体积或外体积，以Vo(outer volume)表 示，单位为m1。 10 3.内水体积 是凝胶吸水溶胀后，存在于凝 胶颗粒内所占有的那一部分水相体积或溶剂 体积，称之为内水体积或内体积以Vi(inner volume)表示，单位为m1。 4.凝胶体积 是凝胶颗粒自身的体积，也就 是床体积减去外水体积和内水体积后所占有 的体积，称为胶体积或称干胶体积,以 Vg(gel volume)表示，单位为m1。 11 l5.洗脱体积 自加样液时开始，到洗脱组分 浓度最大时出现的峰(洗脱峰峰顶)为止，所 收集的体积，以Ve(elution volume)表示， 单位为m1 l计算法：根据层析柱体积计算总体积可用下列公 式表示 l t=r2h 干凝胶用量（克） r2h 膨胀度（床体积克干胶 ） 12 三、参数之间的关系 测量法 1.床体积与Vo，Vi，Vg之间的关系式是： Vt=Vo+Vi+Vg (1-1) 2.洗脱体积与Vo，Vi的关系式为： Ve=Vo+KdVi (1-2) 式中Kd-样品组分在流动相和固定相之间的分配 系数，也可以视为相对分子质量不同的溶质在凝 胶颗粒的内部和外部的分配系数。它只与被分离 物质相对分子质量的大小、凝胶颗粒空隙和网状 孔径大小有关，与层析柱的长短和粗细无关。Kd可 以通过实验获得。 13 3.Kd与体积之间的关系 可以将式(1-2)变换一下， 即可得到Kd与体积之间的关系式：(1-3) Ve Vo Vi 式中 Ve-实验测得的实际洗脱体积。 可用不被凝胶滞留的大的相对分子质量组分 测得，通常用相对分子质量在2106的蓝色葡聚糖 -2000测定，可以通过干胶的吸水量(每克干胶所吸 附水的毫升数)求得。对于一定条件的凝胶层析柱 来说，只要通过实验得知某一组分的洗脱体积Ve， 就可以计算出Kd值。 以上关系可以通过图2表示。 Kd= 14 15 四、Kd的几种判断 在凝胶柱层析过程中，Kd可以有以 下几种情况： 1.Kd=0时，Ve=Vo 对于完全不能进入凝胶 内部的大分子(全排阻)，其洗脱体积就 等于外水体积。 2.Kd=1时，Ve=Vo+Vi。对于完全可以进入 凝胶内部的小分子(全渗透)，其洗脱体 积就等于外水体积和内水体积之和。 16 由此可见，对于某一凝胶介质，如果在 层析过程中有两种全排阻的大分子，即 Kd=0，尽管它们在分子量之间的差别很大 ，但由于它们已经超出了该凝胶质的所能 分离大分子的范畴，不可能有分离效果。 17 同样两种小分子全部都能进入凝胶颗 粒内部空隙， Kd=1，尽管它们在分子量大小 仍有差异，但由于它们已经超出了该凝胶质 的所能分离小分子的范畴，同样也不可能有 分离效果。因此，不同型号的凝胶介质有不 同的相对分子质量分离范畴。在进行排阻层 析之前，根据分离的相对分子质量选择合适 的凝胶介质。 18 3.01时，表示凝胶具有一定的吸附作用 ，此时VeVo+Vi。例如某些芳香族化合物 的洗脱体积远超出理论计算的最大值， 这些化合物的Kd值一般都是大于1的。如 苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸在SephadexG -25中的Kd值分别为1.2、1.4和2.2。 19 在实际工作中，小分子不易得到Kd=1的数 值，尤其是对交联度大的凝胶介质Kd差别 较明显，如同样一个小分子在SphadexG-10 柱层析测得的Kd是0.75左右，同样一个小 分子在SphadexG-25柱层析测得的Kd是0.8 左右。 20 造成这种差别的原因是由于一部分水分 子与凝胶结合较牢固，成为凝胶本身的一部 分，使凝胶的有效网状孔变小，小分子不能 扩散和渗透到凝胶内部，是凝胶失去了部分 筛分作用所致。此时的Vi不能以凝胶的吸水量 进行计算，因此，通常以小分子化合物通过 凝胶柱来测定Vi值。另外一种计算方法是不使 用Vi和Kd，而是用Kav，(有效分配系数)代替 Kd，定义如下。 21 22 在这里实际上是将原来以水作为固定相 (Vi)改为凝胶颗粒(Vt-Vo)作为固定相，而 洗脱剂(Ve-Vo)作为流动相。Kav，和Kd值对 交联度较小的凝胶介质差别不大，而对交 联度大的凝胶介质差异较大。 在排阻层析过程中，凝胶层析介质一般 情况对流动相的组分无吸附作用，当流动 相的体积Vt流过后，上样后的所有组分都 应当被洗脱出来，这是凝胶排阻层析与其 他的层析方法所不同之处。 23 五、Ve与相对分子质量的关系 对同一类型的化合物，洗脱特性与组分的 相对分子质量有关，各种组分流过凝胶柱时 ，洗脱顺序按相对分子质量(Mr)的大小排列 先后流出。Ve与Mr的关系式如下。 Ve=K1-K2lgMr (1-7) 式中： K1-常数； K2-常数； Mr-相对分子质量； Ve-洗脱体积。 A-Sephadex G100;B-sephadex G-200 24 有时Ve也可以用分离体积(Ve-Vo)、相对保留 体积(Ve/Vo)、简化洗脱体积(VeVt)或有效 分配系数(Kav)代替，它们与相对分子质量的 关系与公式(1-7)相同，只是常数不同。但实 际操作过程中大多数都是以Kav对相对分子质 量的对数(1gMr)作图，得到工作曲线，也称 之为“选择曲线”，如图3所示。 曲线的斜率是表明凝胶的性质，是一个重 要的特征。在凝胶允许的分离范围内，曲线 的斜率越陡，分级分离的效果越好。 25 凝胶排阻层析分离主要决定于溶质中 相对分子质量的大小和相应凝胶的交联度。 在同一类型的生物大分子(球形分子或线形 分子)的前提下，凝胶分级分离的范围越窄 ，测定的相对分子质量越准确。凝胶排阻层 析具有设备简单、操作方便、重复性好、条 件温和等优点，是实验室测定相对分子质量 常用的方法，也是生物大分子分离纯化常用 的分离手段。 26 第三节凝胶层析介质 一、凝胶的基本性质 自然界天然凝胶和化学合成的凝胶种类 很多，但能用排阻层析的凝胶则不多。排 阻层析的凝胶是一种球形颗粒，球内部是 多孔网状结构。与普通凝胶在性能上主要 有以下几点区别。 27 1.化学稳定性 合成凝胶的原料和合成凝胶介质以 后所保留的化学基团(如羟基等)必须具有良好的 惰性，不与待分离物质发生化学反应，不影响被 分离物质原有的性质(如生物活性、构象等)；在 比较苛刻的环境中(在偏碱或偏酸的溶液中和在高 浓度的盐溶液中)不发生降解、变性反应，保持相 对稳定。 2.无特异性吸附 凝胶颗粒上不存在或存在极少的 离子基团，不与溶液中的离子化合物发生离子交 换、吸附或亲和反应。在低离子强度下，洗脱峰 不出现拖尾现象，被分离物质有较高的回收率。 28 3.具有较好的耐受性 凝胶颗粒对温度和有 机溶剂具有较好的耐受性，尤其是对物理 聚合的凝胶，在高温下(100左右)不发 生熔融，在有机溶剂中凝胶的体积不发生 收缩变形。 4.刚性好 凝胶颗粒具有一定机械强度，在 允许的操作压范围内，柱床体积保持稳定 ，在层析的过程中流速不发生改变。 29 二、凝胶层析介质的分类 目前，常用于排阻层析的凝胶类介质主要有 4大类，即葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰 胺凝胶和琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等层析介 质。 1.葡聚糖凝胶层析介质 葡聚糖凝胶层析介质是由 多聚葡聚糖通过与环氧氯丙烷交联而合成的，是 一类具有网状结构的珠状凝胶颗粒。葡聚糖凝胶 交联的程度(简称交联度)与凝胶颗粒网状结构孔 径的大小有直接关系，交联度越大，网状结构的 孔径越小，分离的分子量就小；反之，交联度越 小，网状结构的孔径越大，分离的分子量就大。 葡聚糖凝胶交联结构如图4。 30 31 交联的葡聚糖不溶于有机溶剂和水的聚合 物，但由于其结构中含有大量的羟基，又具 有很强的亲水性，能迅速在水和电解质溶液 中溶胀，在层析过程中非常容易与水溶性溶 质接触。合成的葡聚糖凝胶在酸性条件下糖 苷键容易被水解，在碱性环境中比较稳定。 一般在0.25molL NaOH溶液中，60的条件 下放置两个月以上仍不改变其原有的基本性 质。所以常用稀碱溶液处理葡聚糖凝胶层析 介质，以除去残留在凝胶介质上的变性蛋白 和其他杂质。 32 l 在氧化剂的作用下葡聚糖凝胶上的羟 基容易氧化成羧基，增加了带电荷基团，容 易与溶液中的离子化合物发生交换反应，使 其非特异性吸附的能力增强，从而影响分离 效果和回收率。葡聚糖凝胶对温度具有较好 的耐受性，通常在溶胀状态的葡聚糖凝胶可 以耐受110高温，而在未溶胀状态下的干 胶可以耐受120 的高温。 33 最常用的葡聚糖凝胶层析介质是SephadexG 系列产品，它是由Pharmacia生产的，介质 的型号不同，其交联度也不同，分离相对分 子质量的范围有差异。例如SephadexG-25、 SephadexG-50、SephadexG-75、SephadexG- 100、SephadexG-200等，代表着不同型号的 葡聚糖凝胶，英文字母G后面的阿拉伯数字 ，表示凝胶吸水量。不同型号的葡聚糖凝胶 的有关技术参数见表-1。 34 表-1 葡聚糖凝胶层析介质的有关技术参数 凝胶型号 颗颗粒大小 m 溶胀胀体积积 (m1g) 分离范围围(Mr) Sephadex G-10 Sephadex G-15 Sephadex G-25 Sephadex G-50 Sephadex G-75 Sephadex G-100 Sephadex G-150 Sephadex G-200 40120 40120 50150 50150 40120 40120 40120 40120 23 2535 46 911 1215 1520 2030 2040 小于7102 小于15103 10103 50103 15103 30104 30103 80104 40103 10105 50103 30105 50103 60105 35 SephadexG系列产品，“G”后面的阿拉伯数字 越大，表示交联度越小，凝胶孔径越大，相对分 子质量分离范围越大，凝胶的溶胀体积大。与此 相反，“G”后面的阿拉伯数越小，表示交联度 越大，凝胶孔径越小，相对分子质量分离范围越 小，凝胶的溶胀体积小。 凝胶的特性：具有耐高温(100沸水煮)、在 酸性或碱性条件下稳定（在pH211范围内稳定) ，但是在高盐浓度下体积易收缩，凝胶的刚性较 差。 36 2.琼脂糖凝胶层析介质 琼脂是自然界广泛 存在的一种天然多糖混合物，主要来源于海 藻。琼脂主要由两部分组成，一部分是中性 链状多糖，称为琼脂糖(agarose)，其基本 结构是由B-D-吡喃半乳糖和3，6-脱水-L-吡 喃半乳糖相间结合而成的链状多糖；另一部 分是带负电荷的琼脂糖(agaropectin)，在 分子中含有磺酸基和羧基，在制备琼脂糖时 需要用氯代十六烷吡啶或聚乙烯醇等有机溶 剂将琼胶沉淀除去。其部分结构如下。 37 图5 38 目前能生产琼脂糖凝胶层析介质厂家很多 ，生产工艺和产品的名称也因生产厂家不同 而异，但介质的基本性能都很相近。例如瑞 典生产的Sepharose系列、美国生产的 SuperAgoGel系列、英国生产的Sagavac系列 、丹麦生产的Gelarose系列、我国生产的QT 系列等都是以琼脂糖为原料制成的。 39 琼脂糖凝胶是一种大孔胶，由于半乳糖的 分子中含有许多羟基，具有良好的亲水性，在 层析过程中非常容易与水溶性溶质或溶剂接触 。它的交联度随着琼脂的浓度增加而增大，制 备时以物理的方式聚胶，首先配制一定浓度的 琼脂糖，加温直至使其完全融化，然后迅速冷 却获得凝胶，凝胶内部的网状结构主要是依靠 糖链之间的次级键如氢键来维持稳定，网状孔 径的大小通过改变凝胶的交联度来控制。琼脂 糖分子中不带电荷，所以非特异性吸附较少， 样品在排阻层析分离时回收率较高。 40 由于琼脂糖凝胶链与链之间不是共价结合 ，所以对于未经特殊处理的琼脂糖凝胶，当 环境的温度高于56oC时就会开始融化，如果 经过特殊方式处理或经过交联的琼脂糖可以 耐受100120的高温，机械强度也有较大 的提高。 41 最常用的琼脂糖凝胶层析介质是 SepharoseB系列产品，它是由Pharmacia生产 的，介质的型号不同，其交联度也不同，分 离分子量的范围有差异。例如，Sepharose 4B 、Sepharose 6B、Sepharose 8B等。不同型号 的琼脂糖凝胶表示不同的琼脂糖百分含量， 有关技术参数见表2。 42 凝胶型号 颗颗粒大小 m 凝胶浓浓度 分离范围围(Mr) Sepharose 2B Sepharose 4B Sepharose 6B Sepharmse 8B Sepharose12B 50130 50130 50130 50130 50130 2 4 6 8 12 510515107 210515106 51042106 21047105 51035104 表2 琼脂糖凝胶层析介质的有关技术参数 43 在SepharoseB系列产品中，“B”前面的阿 拉伯数字表示琼脂糖的百分浓度，琼脂糖浓 度越高表示交联度越大，凝胶孔径越小，相 对分子质量分离范围越小。与此相反琼脂糖 浓度越低表示交联度越小，凝胶孔径越大， 相对分子质量分离范围越大，因此琼脂糖凝 胶的交联度表示方法与葡聚糖凝胶相反。 44 琼脂糖凝胶的特性：具有良好的大孔性 和机械强度，交联的琼脂糖凝胶除了能耐受 120 蒸汽压力处理外，还可以耐受一定的 酸碱度(在pH312范围内稳定)和在6M尿素 中不变形。 45 3. 聚丙烯酰胺凝胶层析介质 聚丙烯酰胺凝胶是一 种化学合成的凝胶，组成的基本单位是丙烯酰胺 (acrylamide，简称Acy)，也称之为单体，分子式 (CH2CII-CONH2)；交联剂是N，N-亚甲基双丙 烯酰胺(N，N，-methylenebisacrylamide，简称bis) 。丙烯酰胺和N，N二亚甲基双丙烯酰胺在自由 氧基的诱发下发生聚合反应，在制备过程中经过 特殊工艺合成球形的聚丙酰胺凝胶珠。通过控制 丙烯酰胺浓度和N，N，-亚甲基双丙烯酰胺的比 例，就可以得到不同交联度的聚丙酰胺凝胶。其 部分结构式如下。 46 47 聚丙烯酰胺凝胶层析介质的稳定性不如交 联的聚葡糖凝胶，它在酸性的条件下酰胺键 容易被水解生成羧酸，使凝胶介质带有一定 的离子交换基团，在排阻层析时对溶液中带 电荷组分发生离子交换作用，使介质的非特 异性吸附增加。因此，聚丙烯酰胺凝胶层析 应当尽量避免使用酸性较强的缓冲液。尽管 目前使用的聚丙烯酰胺凝胶层析介质在说明 书上表明对酸碱溶液有较大的耐受性(在pH2 11的溶液中)，但是，如果介质长时间处 于酸性环境中还是有一定影响的。 48 最常用的聚丙烯酰胺凝胶层析介质是 Bio-Gel-P系列产品，它是由Bio-Rad公司生 产的，介质的型号不同，其交联度也不同， 分离相对分子质量的范围有差异。介质的有 关技术参数见表3。 49 表3聚丙烯酰胺凝胶层析介质的有关技术参数 凝胶型号 溶胀胀体积积 (mlg) 排阻下限 (103) 分离范围围(Mr) Bio-Gel P2 Bio-Gel P4 Bio-Gel P6 Bio-Gel P10 Bio-Gel P30 Bio-Gel P60 Bio-Gel P100 Bio-Gel P150 Bio-Gel P200 Bio-Gel P300 3.8 5.8 8.8 12.4 14.9 19.0 19.0 24.0 34.0 40.0 1.6 3.6 4.6 10 30 60 100 150 200 300 21022103 51024103 11035103 51031.7104 21045104 31047104 41041105 51041.5105 81043105 11054105 50 在Bio-GelP系列产品中，“P”后面的阿 拉伯数字越大，表示交联越小，凝胶孔径越 大，相对分子质量分离范围越大，凝胶的溶 胀体积越大。与此相反，“P”后面的阿拉 伯数字越小，表示交联越大，凝胶孔径越小 ，相对分子质量分离范围越小，凝胶的溶胀 体积越小。它与葡聚糖凝胶介质的表示方法 一样。 51 聚丙烯酰胺凝胶的特点：具有良好的大 孔性和机械强度，交联后具有一定的耐受性 。但在低于pH2的酸性环境中或高温下，分子 中的酰胺基易被水解产生羧酸；对偏酸或偏 碱性的化合物及芳香族类化合物均有不同程 度的吸附。 52 4.琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶层析介质 琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶层析介质 是由琼脂糖聚丙烯酰胺按不同比例制成的混 合型凝胶。它利用聚丙烯酰胺作为三维空间 骨架，在骨架中间填充琼脂糖凝胶，由于聚 丙烯酰胺骨架机械性能比琼脂糖凝胶高，制 成的凝胶刚性好，孔径大，很适合于生物大 分子的分离。制备这类介质在工艺和技术上 要比制备单一材料的凝胶复杂得多。其理化 性质介于琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶之间。 最常用的琼脂糖聚丙烯酰胺混合凝胶 层析介质是UltrolGelAcA系列。介质的主要 技术参数见表4。 53 表4 琼脂糖聚丙烯酰胺混合凝胶层析介质 的主要技术参数凝胶型号 丙烯酰烯酰 胺 浓浓度 琼琼脂糖 浓浓度 分离范围围(Mr) Ultrol Gel AcA22 Ultrol Gel AcA34 Ultrol Gel AcA44 Ultrol Gel AcA54 2 3 4 5 2 4 4 4 11051.2106 21043.5105 11041.3105 51037104 54 UltrolGel“AcA”表示合成时用的丙烯 酰胺和琼脂糖的量，其后面阿拉伯数字分别 表示聚丙烯酰胺和琼脂糖的百分浓度，阿拉 伯数字越小表示丙烯酰胺和琼脂糖浓度越低 ，其交联度越小，凝胶孔径越大，分离分子 量的范围越大。与此相反，阿拉伯数字越大 表示丙烯酰胺和琼脂糖浓度越高，其交联度 越大，凝胶孔径越小，分离分子量的范围越 小。交联度的表示方法与琼脂糖凝胶一样。 55 三、凝胶的规格与用途 凝胶排阻层析介质根据其用途和使用的规模 ，具有不同的规格，也就是说在同一交联度、 同一性能的条件下的凝胶介质有不同的规格。 主要从球形介质的直径大小可以分为粗、中粗 、中细、细、超细等几类，但不同型号的凝胶 分类略有区别，如中粗葡聚糖凝胶颗粒，直径 大小一般在40120m之间，而琼脂糖凝胶颗粒 ，直径大小：般在50150m之间。不同规 格的凝胶见表5所示。 56 表5 不同规格的凝胶及用途 凝胶规规格 粒度范围围/m 用 途 粗 中粗 中细细 细细 超细细 100300 40160 2080 1040 35 大规规模制备备或工业业化生产产析 常规规分析或小量制备备 实验实验 室分析测测定或微量制备备 微量分析 超微量分析或用于HPLC填料 57 四、凝胶性能的比较 不同的凝胶层析介质，由于合成介质的 原料不同,其分辨率存在着较大的差别。例 如SephadexG-75和Bio-GelP-30分离同一种 样品，SephadexG-75分离的不如Bio-GelP- 30好，如图7-1所示。同一种凝胶介质不同 型号，由于它们的交联度不同，其分辨率 也会有较大的差异。例如SephadexG-75、 SephadexG-100、SephadexG-150的分辨率 有较大的差异。如图7-2所示。 58 59 第四节 凝胶（排阻）层析分离条件的确定 一、凝胶层析介质的选择 1.凝胶层析介质型号的选择 根据相对分子质量分离范围选择相应型号 的凝胶介质，确定是组别分离还是组分分离 。组别分离是指相对分子质量之间相差很大 (数十至数百倍)的样品，如生物大分子与有 机小分子或无机盐等的分离；组分分离是指 相对分子质量之间相差较小(2000以上)的 生物大分子。 60 组别分离一般选用交联度较大的凝胶层 析介质，例如，蛋白质脱盐可选用葡聚糖凝 胶SephadexG-25或聚丙烯酰胺凝胶Bio-GelP- 6、Bio-GelP-10。组分分离要根据被分离组 分所预测的最大相对分子质量的上限值和最 小相对分子质量的下限值的分离范围来选择 合适的凝胶。如分离相对分子质量在5000 60000之间的多种组分，可选用葡聚糖凝胶 SephadexG-75或UltrolGelAcA54。 61 2.凝胶粒度的选择 选择凝胶粒度的大小，主要是基于分离样 品是层析的规模或相邻两组分相对分子质量 的差异进行选择。粒度较大的凝胶介质流速 快，适于具有一定规模的分离或者组别分离 ，但由于其颗粒大层析时涡旋扩散影响较大 ，被分离组分在柱内容易扩散，分辨率较低 。粒度较小的凝胶介质适于分析分离，层析 时涡旋扩散影响较小，组分在柱内扩散小， 分辨率相对较高，但流速较慢。实验室常用 的凝胶介质的粒度范围是中粗级。 62 凝胶介质粒度的均匀性也是很重要 的，凝胶介质的最大颗粒和最小颗粒的 差值越小越好，说明介质的均匀度好。 均匀度好的介质流速相对于均匀度差的 介质快，效率高。 63 二、层析柱的选择 层析柱的选择，主要考虑被分离组分 相对分子质量的差异，选用相应的柱长 与柱内径之比的层析柱。对于组别分离 的层析柱，由于被分离的组分相对分子 质量差别较大可采用短粗的层析柱，柱 长度：柱内径=10：1或20：1，如脱盐柱 。对组分分级分离的层析柱，用细长的 层析柱；柱长度：柱内径=50：1或100： 1，如蛋白质组分分离。 64 三、流动相的选择 排阻层析所使用的缓冲溶液比较简单，一般只使 用一种缓冲液。但是在选择缓冲溶液时主要考虑3方面 的因素： 1.考虑被分离物质的稳定性，包括缓冲液的pH值、离子 强度及保护剂等。 2.考虑凝胶介质的稳定性能，不与介质发生化学反应， 不变形，不降解。 3.考虑分离物质的后处理，被分离组分经排阻层析分离 后还需采用其他层析方法进行分离(如用离子交换或亲 和层析分离等)，最好选用与后续层析方法相同的缓冲 液。如果后处理是冰冻干燥，可选用易挥发性的溶液 。如NH4HC03、HAC或NH40H等。 65 四、样液的制备 排阻层析的样液在上样前，要进行适 当的处理，去部分杂质。样液的浓度不 宜太稀，组分不宜太多，质量至少要相 差2000以上。 66 五、上样体积 排阻层析的上样量相对于其他层析方法要求 更严格，上样后的各个组分随着流动相往前流 动，不会停留在介质上。各个组分的分离峰极 容易产生扩散效应，流出体积只有增大，而不 会减少。一般情况，对组分分离的洗脱体积是 原体积的几倍至几十倍。因此对组分分离的上 样体积不超过柱床体积的0.55；组别分 离的上样体积不超过柱床体积的30。 67 第五节 凝胶介质的后处理 一、凝胶柱的保存 凝胶柱内的层析介质是浸泡在溶液中，容 易长菌。尤其是葡聚糖和琼脂糖类凝胶介质 ，极易染菌，某些微生物能分泌降解多糖糖 苷键的酶，使葡聚糖和琼脂糖的糖苷键发生 降解，而改变凝胶层析介质原有的性质。 68 虽然聚丙烯酰胺凝胶介质不容易被微生物所 降解，但长期浸泡在溶液中容易孳生细菌，使其 化学性质发生某些变化，如发生氧化，离子化等 而改变层析的特性：为了避免微生物的生长，残 留在凝胶柱内的磷酸盐和有机物必须要洗净，然 后将层析柱真空或低温保存。低温保存的温度不 能低于柱内溶液的冰点，防止柱内的凝胶结冰， 而破坏凝胶的交联度和网状结构。 69 防止微生物生长最常用的方法是在 凝胶溶液中加人一定的抑菌剂，如0.02 叠氮钠、0.010.02三氯丁醇、 0.0050.01乙基汞硫代水杨酸钠、 0.0010.01苯基汞代乙酸盐、苯基 汞代硝酸盐或苯基汞代硼酸盐等。 70 二、 凝胶介质的处理与干燥 凝胶层析介质一般不与溶液中的溶质发生 任何作用，所以在层析分离后用平衡液稍加 平衡即可进行下一次层析，但是在实际操作 中常常有些杂质污染凝胶和层析柱表面的凝 胶。因此，层析柱在使用一段时间后必须做 适当的处理，除去凝胶表面的污染物。处理 所用的溶液和溶液浓度略有不同，一般对交 联的葡聚糖凝胶类介质可以用0.1 molL NaOH和0.5 molL NaCl混合处理，聚丙烯 酰胺和琼脂糖凝胶类介质可以用0.5 1.0molL NaCl溶液处理。 71 凝胶层析介质如果在较长的时间内 不再使用，可以将其干燥长期保存。使 用过的凝胶层析介质，首先按一般的再 生程序将介质再生处理、漂洗干净，然 后用乙醇从低浓度到高浓度逐级脱水(先 后用30、50、70、80、95、 无水乙醇、乙醚)，脱水后的介质在室温 下晾干，将乙醚挥发尽，即可。 72 第六节凝胶过滤（排阻）的分离模式 一、脱盐 在生物大分子的分离纯化过程时，常用 一些无机盐或有机小分子作为洗脱剂，在洗 脱液中常常含有较高浓度的盐或其他小分子 化合物，一般要将小分子和生物大分子分开 ，常采用透析的方法。虽然透析法操作简单 ，但是费时，处理的量有限；如果采用排阻 层析法除盐，既可以节省时间，又不影响生 物大分子的特性。 73 74 脱盐最常用的凝胶介质是Sephadex G -25。例如经三氯乙酸提取的卵黏蛋白， 经Sephadex G-25柱层析除去鸡卵黏蛋白 中的盐，见图8所示。 蛋白质脱盐时，某些蛋白质由于脱盐 后溶液中电解质下降，导致其溶解度降 低，有时会出现沉淀或被吸附在柱上洗 不下来。遇见这种情况，可以用挥发性 的盐类洗脱，然后冰冻干燥。 75 76 二、测定相对分子质量 凝胶排阻层析是测定相对分子质量的一 个常用的方法。使用一系列已知相对分子质 量的混合标准品在同一凝胶柱内同一条件下 进行分离，收集每一个组分的洗脱体积，然 后将每一个组分的洗脱体积对相对分子质量 的对数作图，获得标准相对分子质量的工作 曲线，也称之为标准曲线。 77 在同样的条件下将未知样品通过凝 胶排阻层析分离，并获得未知样品的洗 脱体积，用该洗脱体积从标准曲线上查 得未知样品相对分子质量的对数值，在 查反对数就知道该样品的相对分子质量 。如图9所示，以牛血清蛋白(67000)、 鸡卵清清蛋白(43000)、糜蛋白酶原 (25000)、(20000)、细胞色素(12000)为 例。 78 79 凝胶排阻层析是测定相对分子质量的方 法不需要复杂的仪器设备，操作简单，样 品用量少，具有一定的使用价值。但是此 法测定的相对分子质量会产生一定偏差， 线形分子和球形分子也有所不同，在同样 的条件下线形分子的结果会偏大，球形分 子会偏小。凝胶排阻层析测定的相对分子 质量与生物大分子的形状有密切的关系， 如某些线形蛋白、球形蛋白、纤维蛋白和 糖蛋白等。 80 因此，在测定时如果未知样品是球 形分子最好选择球形分子作标准蛋白， 未知样品是线形分子最好选择线形分子 作标准蛋白质，这样产生的偏差相对小 一些。如果对未知样品相对分子质量的 精确测定还需要与其他相对分子质量的 测定方法进行比较，参考其他方法做出 判断。 81 三、分离蛋白质 凝胶排阻层析是生物大分子在分离纯化 过程中不可缺少的一种手段，它是通过分 子的质量进行分离唯一的一种技术。在层 析方法中绝大多数都是以化合物的电荷差 异进行分离的(如离子交换层析、螯合层析 、吸附层析等)或以化合物的极性进行分离 (如分配层析、反相层析、疏水层析等)。 82 凝胶排阻层析可以将相对分子质量 相近、分子结构和形状相似的化合与其 他分子分开。例如SephadexG-75柱层析 可以分离相对分子质量在300080000球 形蛋白分子或100050000线形蛋白分子 。用SephadexG-50柱层析从大鼠睾丸的 提取液中分离金属结合蛋白，如图10所 示。 83 84 第七节 应用实例 鸡卵黏蛋白相对分子质量的测定 一、原理 葡聚糖凝胶SephadexG-75的相对分子质量分 离范围在300080000之间。用4种已知相对分 子质量蛋白通过SephadexG-75排阻层析分离， 得到相应的洗脱峰，分别合并各洗脱峰的体积 ，并可计算出各种标准蛋白质的Kav,以相对分 子质量的对数lgMr为横坐标，Kav为纵坐标，绘 出标准曲线。然后将卵黏蛋白在SephadexG-75 排阻层析分离得到相应的洗脱峰所计算出来的 Kav值，从标准曲线上查得相应的lgMr，即可知 道卵黏蛋白的相对分子质量。85 二、试剂与材料 试剂:标准相对分子质量蛋白质，卵黏蛋 白， 蓝色葡聚糖-2000，乙酸，乙酸钾 等。 材料:SephadexG-75，层析柱(1cml00cm) 。 86 三、操作步骤 1.凝胶介质的选择及溶胀 称取10g SephadexG-75干粉放人500ml的烧杯中， 加入200m1 0.025molL 氯化钾, 0.2molL乙酸缓冲液，在沸水浴中热溶 胀2h，冷却至室温后，抽真空脱去凝胶 中残留的空气，或在室温下溶胀24h，真 空脱气，备用。 87 2. 装柱 取一支长度为100cm，内径为lcm的层析柱。洗净 ，向柱内装人1/4左右柱床体积的缓冲液，然后把溶胀处 理好的SephadexG-75，一次装入层析柱内，在柱的下端用 夹子夹住，上端插一个漏斗，漏斗柄与柱上端密封连为一 体，再将剩余的凝胶装入漏斗中，使凝胶慢慢沉降，等凝 胶完全沉淀好以后，取出柱上端的漏斗，拧紧柱头塑料帽 ，将接口的乳胶管与盛有缓冲液的储液瓶连接，调节好流 速(流速为3ml/min)平衡。 3. 样品溶液的准备 （1）标准蛋白质混合液的配制 称取牛血清清蛋白、鸡卵 清清蛋白、以胰凝乳蛋白酶原A和牛胰岛素各23mg，溶 解在lml的缓冲液中。 （2）未知蛋白质样品溶液的配制 称取3mg