《westernblot技术》PPT课件.ppt

LOGO Western Blot 技术 姓名：姓名：= 印 迹 法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 Western 印迹法 Eastern 印迹法 印迹法（印迹法（blottingblotting）: :将样品转移到固相载体上，而后 利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 Company Logo Western Blot 原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至 一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测 。 Company Logo Western Blot 原理 经电泳分离后的蛋白质样品，转移到固相载体上，经电泳分离后的蛋白质样品，转移到固相载体上， 固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分 离的多肽类型及其生物学活性不变。离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的 抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反 应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异 性目的基因表达的蛋白成分。性目的基因表达的蛋白成分。 Company Logo Western Blot 操作步骤 一一. . 制备、处理蛋白样品制备、处理蛋白样品 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 将待分离的蛋白样品与样品缓冲液按将待分离的蛋白样品与样品缓冲液按4:14:1比例混合比例混合 ( 50 ( 50100100gg蛋白蛋白),),沸水煮沸沸水煮沸1010minmin, , 立即插入碎 立即插入碎 冰中备用。 冰中备用。 Company Logo Western Blot 操作步骤 二二. . SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 制备聚丙烯酰胺凝胶制备聚丙烯酰胺凝胶：将玻璃板洗净将玻璃板洗净, ,水不挂壁为准水不挂壁为准, , 晾干晾干, , 底边和两侧对齐底边和两侧对齐, , 两侧夹紧两侧夹紧, , 立于制胶架上。根立于制胶架上。根 据所要分析的蛋白质分子量大小配制分离胶据所要分析的蛋白质分子量大小配制分离胶, , 沿玻璃板沿玻璃板 上的左上角位置连续平稳注入两层玻璃板中上的左上角位置连续平稳注入两层玻璃板中, , 待分离胶聚待分离胶聚 合、凝固后合、凝固后, , 将积层胶溶液也沿玻璃板左上角注入后立即将积层胶溶液也沿玻璃板左上角注入后立即 插入梳子。插入梳子。 Company Logo Western Blot 操作步骤 二二. . SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶 上样上样：将制备好的凝胶：将制备好的凝胶( (带着梳子带着梳子) )小心从制胶架上取下小心从制胶架上取下, , 放置于电泳槽槽中放置于电泳槽槽中, ,将电泳缓冲液注入电泳槽中将电泳缓冲液注入电泳槽中, , 缓慢拔出梳子，吸取处理好的蛋白样品缓慢拔出梳子，吸取处理好的蛋白样品202030LL 30LL 点样。点样。 电泳电泳：打开电源打开电源, , 选择稳压模式电泳选择稳压模式电泳( (也可选择恒流电泳也可选择恒流电泳), ), 80 80200V200V工作电压，积层胶用工作电压，积层胶用80-100V,80-100V,分离胶用分离胶用 150-200V 150-200V。待溴酚蓝到达分离胶底部时。待溴酚蓝到达分离胶底部时( (约约1h1h后后) ) 停止电泳。停止电泳。 Company Logo Western Blot 操作步骤 三三. . 转膜转膜 取胶取胶：电泳结束后用塑料板小心将胶从两块玻璃板之间剥：电泳结束后用塑料板小心将胶从两块玻璃板之间剥 离出来，用转移缓冲液洗净。离出来，用转移缓冲液洗净。 制作转移三明治制作转移三明治：打开转移盒，三明治顺序：正极面打开转移盒，三明治顺序：正极面 海绵垫海绵垫33张张WhatmanWhatman滤纸滤纸PVDFPVDF膜膜凝凝 胶胶33张张WhatmanWhatman滤纸滤纸海绵垫海绵垫负极面。关负极面。关 上转移盒。上转移盒。 Company Logo Western Blot 操作步骤 三三. . 转膜转膜 转移转移：将转移盒放入转移槽，正极面对红板，负极面对：将转移盒放入转移槽，正极面对红板，负极面对 黑板，加满转移缓冲液，通电转移，将转移槽放入黑板，加满转移缓冲液，通电转移，将转移槽放入 4 4冰箱内，冰箱内，200mA200mA转移转移2h2h。 洗膜洗膜：打开三明治，取膜。将膜浸泡于：打开三明治，取膜。将膜浸泡于TBSTTBST中，置于摇床中，置于摇床 上洗膜上洗膜10min.10min. Company Logo Western Blot 操作步骤 四四. . 封闭封闭 将转移膜取下，用将转移膜取下，用PBSPBS漂洗漂洗, , 放入小塑料袋中放入小塑料袋中, , 加入适加入适 量新鲜封闭液量新鲜封闭液, , 挤赶气泡挤赶气泡, , 用电热封口机封口后室温下放用电热封口机封口后室温下放 在摇床上摇。在摇床上摇。 Company Logo Western Blot 操作步骤 五五. . 免疫反应免疫反应 加一抗加一抗：将封闭过的膜取出：将封闭过的膜取出, , 再放入一新塑料袋中再放入一新塑料袋中, , 加入加入 一抗液一抗液, , 挤赶气泡挤赶气泡, , 封口。室温下在摇床上摇封口。室温下在摇床上摇1 1 h, h,或或4 4冰箱放置过夜。冰箱放置过夜。 洗洗 膜膜：用用TBSTTBST洗膜液洗去未结合靶蛋白的抗体。洗膜液洗去未结合靶蛋白的抗体。 加二抗加二抗：将漂洗过的膜放入新塑料袋中将漂洗过的膜放入新塑料袋中, , 加入二抗液。室加入二抗液。室 温下在水平摇床上摇温下在水平摇床上摇2h2h。 Company Logo Western Blot 操作步骤 六六. . 底物显色底物显色 化学发光反应化学发光反应 ( (ECLECL) )检测检测 放射自显影放射自显影 底物荧光底物荧光ECFECF 底物底物DABDAB呈色呈色 Company Logo Western Blot 操作步骤 六六. . 底物显色底物显色 化学发光反应化学发光反应 ( (ECLECL) )检测检测：取出洗过的滤膜：取出洗过的滤膜, , 先在滤纸上先在滤纸上 沥干。将膜放入小暗盒中沥干。将膜放入小暗盒中, , 加发光液于膜上加发光液于膜上, , 室温孵室温孵 育育 3 m i n , 3 m i n , 立即准备压片曝光。立即准备压片曝光。 Company Logo Western Blot 操作步骤 六六. . 底物显色底物显色 曝光及冲洗曝光及冲洗X X光胶片光胶片：在暗室中观察发光条带的强度在暗室中观察发光条带的强度, , 确确 定曝光时间。将定曝光时间。将 X X光胶片放在暗盒中的滤膜上光胶片放在暗盒中的滤膜上, ,盖严盖严, , 计时曝光计时曝光, , 冲洗冲洗 X X光片。光片。 分析分析：用凝胶成像系统扫描图像，检测积分吸光度值：用凝胶成像系统扫描图像，检测积分吸光度值, ,分分 析目标带的分子量和净光密度值。析目标带的分子量和净光密度值。 Company Logo Western Blot 所用仪器 Company Logo Western Blot 常见问题分析 一一. .条带比正常的窄？出现条带比正常的窄？出现“微笑微笑”或或“倒微笑倒微笑”条带条带？ 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓；凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓； 拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲；拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把上样带扭曲； 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样 品品 ，调整盐浓度；，调整盐浓度； 胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电胶板底部有气泡会影响电泳效果，应赶走气泡。同时注意电 泳槽装置是否合适。泳槽装置是否合适。 Company Logo Western Blot 常见问题分析 二二. .凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓凝胶肿胀或卷曲？条带歪斜或漂移？单个或多个白点？转膜缓 冲液过热冲液过热？ 可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡可将凝胶在转膜之前放到转膜缓冲液中浸泡5-10min5-10min ； 电转仪长期使用导致海绵变薄，电转仪长期使用导致海绵变薄，“三明治三明治”结构不紧凑导致结构不紧凑导致 。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸；。可在两块海绵之间垫上少许普通的草纸； 确保膜和胶块之间没有气泡确保膜和胶块之间没有气泡； 缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降缓冲液中离子浓度太低，电流或电压太高。转膜过程注意降 温温。 Company Logo Western Blot 常见问题分析 三三. .背景太高背景太高？ 原因原因 膜没有均匀浸湿； 膜或者缓冲液污染； 封闭不充分； 抗体与封闭剂出现交叉反应 ； 抗体浓度过高。 Company Logo Western Blot 常见问题分析 三三. .背景太高背景太高？ 解决办法解决办法 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿； 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液； 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应； 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 。 Company Logo Western Blot 技术 总结总结 Western BlotWestern Blot 技术不涉及复杂的