分子生物学常用实验技术及方法.doc

第二章 常用实验技术及方法一、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)反应总体积为50 l，其中含有：模板DNA 0.5 lPCR缓冲液(不含MgCl2) 5 l10MgCl2 溶液 5 ldNTP (2.5 mmol/L) 0.5 l引物1 (50 umol/L) 0.5 l引物2 (50 umol/L) 0.5 lTaq DNA 聚合酶 0.5 l无菌去离子水加至 50 l上层用25 l 液体石蜡油覆盖。循环参数为： 94 变性10 min94 变性1 min56 退火1 min72 延伸2 min共30个循取环，PCR结束后，取2 l PCR扩增产物，经1 %琼脂糖凝胶电泳，在紫外检测仪上观察并拍照。二、基于PCR技术的定点突变1. 根据所要突变位点的特定氨基酸，并按公认的四引物法原理，分别设计上下游引物Primer 3和Primer 4，这两条引物部分交错互补，但分别含有欲突变后的碱基（红点）的互补序列（如下图所示）；P1P2P4P32. 用基因5端的Primer 1和Primer 2 PCR扩增DNA片段1，用基因3端的Primer4和Primer 3一起PCR扩增DNA片段2，PCR反应条件基本如上(七、聚合酶链反应)，可根据具体实验略有调整，反应完毕后，分别电泳回收DNA片段1和DNA片段2；3. 以片段1和片段2为模板，进行第二次PCR反应，反应体系为50 l：片段1 1 l片段2 1 l10PCR缓冲液(不含MgCl2) 5 l10MgCl2溶液 5 ldNTP (2.5 mmol/L) 5 lTaq酶 1 l加ddH2O至 50 l在该反应体系中先不加入引物，按上述反应条件进行10个循环，然后再加入Primer 1和Primer 4各1 ul，按上述反应条件再扩增30个循环；4. PCR产物经电泳检查，然后连接到相应的载体中，进行测序以确定定点突变的正确性。三、Total RNA的提取 (Catrimox-14TM RNA Isolation Kit Ver. 2.11) 1. 吸弃培养细胞中的旧培养基，用PBS洗涤1-2次后，加入1 ml的Catrimox-14TM溶液，然后充分混匀；2. 收集细胞裂解液，按以下条件进行离心：细胞数1107 ： 1500 rpm (约112.5g) 5 min 3. 除去上层溶液，加入1 ml的DEPC处理的H2O，上下颠倒混合数次后， 12000 rpm离心2 min；4. 吸弃上层溶液，激烈振荡使沉淀松动；5. 向Microtube中加入1 ml的2 M LiCl溶液；6. 激烈振荡后，室温下12000 rpm离心5 min，除去溶液；7. 沉淀用70 %冷乙醇清洗一次；8. 沉淀经过简单的真空干燥后，溶于适当的缓冲液中。四、RT-PCR (TaKaRa One Step RNA PCR Kit) 1. 按Takara Kit 中所提供的标准步骤配制PCR 体系；2. 按以下条件进行RT-PCR 反应 (1) 50 30 min (2) 94 2 min (3) 94 1 min (4) 56 1 min (5) 72 2 min 3. 重复步骤(3)-(4)-(5)，共30个循环； 4. 反应结束后，取3-5 l进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将PCR产物冷冻保存。五、DNA 样品的琼脂糖凝胶电泳50TAE: 242 g Tris 碱57.1 ml 冰乙酸 100 ml 0.5 M EDTA (pH 8.0)1. 称取0.5 g agarose，置于250 ml 锥形瓶中，加入50 ml 1TAE（含EB 0.5 ug/ml），加热使其全部溶解；2. 封口、安放梳子；3. 待凝胶稍凉后铺板；4. 胶凝固后，放入电泳槽中，倒入1TAE，淹没胶面，拔去梳子；5. 将DNA 样品与6的上样缓冲液混合，加于加样孔中；6. 80-100V 恒压电泳，待溴酚蓝走至凝胶适当位置时，停止电泳，紫外灯下观察或拍照。六、从琼脂糖凝胶上回收DNA 片段（Vitagene DNA 片段回收Kit）1. 用一灭菌刀片割下含目的DNA 片段的琼脂糖凝胶块，放入Eppendorf管中；2. 用Vitagene DNA 片段回收Kit，并按照试剂盒提供的步骤回收所要的DNA片段。七、DNA 片段的连接反应1. 总体系为10-20 l，外源DNA插入片段和载体片段按一定摩尔比混合；2. 加入1-2 ul 10Buffer，2 ul T4DNA连接酶，混匀；3. 12-16 反应过夜。八、大肠杆菌感受态细胞的制备1. 挑取单菌落接种于3-5 ml LB 液体培养基中，37 振荡培养过夜；2. 取0.5 ml培养物转接种于50 ml LB 液体培养基中，37 振荡培养约3 h至对数生长期(OD600 = 0.4-0.6)；3. 将细菌转移至50 ml 离心管中，冰浴20 min；4. 于4，4200 rpm 离心10 min，弃上清；5. 用5 ml 冰预冷的0.1 M CaCl2悬浮菌体，冰浴30 min；6. 于4 ，4200 rpm 离心10 min，弃上清；7. 用3 ml 0.1 M CaCl2/15%甘油悬浮菌体（动作要轻），每管分装100 l，立即使用或置于-70 冰箱保存。九、大肠杆菌感受态细胞的转化1. 感受态细胞若保存于-70 冰箱，取出后先在冰上复苏5-10 min；2. 加入适量DNA 样品，混匀，冰浴30 min；3. 42 水浴1 min，立即放入冰上冷却2 min；4. 加入0.5 ml LB 液体培养基， 37 振荡培养45 min；5. 取适量转化的菌体，涂布于含抗生素的LB 平板上，等平板表面的液体被吸收后，倒置放入37 温箱，培养过夜。十、大肠杆菌质粒DNA 的小规模制备(一)、材料：1. Solution I 葡萄糖 50 mMTris-HCl (pH8.0) 25 mMEDTA (pH8.0) 10 mM2. Solution II NaOH 0.2 MSDS 1%3. Solution III 5 M 乙酸钾 60 ml冰乙酸 11.5 ml去离子水 28.5 ml4. TE Buffer (pH8.0) Tris-HCl (pH8.0) 10 mMEDTA (pH8.0) 1 mM(二)、方法：1. 在2 ml含相应抗生素的LB液体培养基中接种单菌落，37 剧烈振摇培养过夜；2. 取细菌培养物置于Eppendorf管中，13000 rpm离心30 sec，弃上清；3. 用100 l Solution重悬菌体沉淀，冰浴2-3 min；4. 加200 l新鲜配制的Solution，颠倒Epp管数次以充分混匀，室温放置2 min；5. 加150 l用冰预冷的Solution ，温和振荡数次，冰浴3-5 min；6. 13000 rpm离心5 min，将上清转移至一新Epp管中；7. 加等体积异丙醇振荡混匀，室温5 min；8. 13000 rpm离心5 min，弃上清，并用200 ul去离子水溶解沉淀；9. 加100 ul 7.5 M (NH4)2Ac混匀，冰浴5 min； 10. 13000 rpm离心2 min；11. 转移上清至一新Epp管；12. 加2倍体积的乙醇，振荡混匀，于室温放置5 min，13000 rpm离心5 min；13. 用1 ml 70 %乙醇洗涤双链DNA沉淀，13000 rpm离心5 min，弃上清，在空气中使核酸沉淀干燥10分钟；14. 用20 l TE buffer重新溶解核酸沉淀，贮存于-20 备用。十一、蛋白质诱导表达(一)、材料1. 氨苄青霉素（用去离子水配成60 mg/ml，用0.22 m 滤器过滤除菌，-20 避光保存）2. IPTG（用去离子水配成200 mM，用0.22 m 滤器过滤除菌，-20 保存）3. PMSF（用异丙醇配成10 mM，-20 保存）(二)、方法1. 挑取单克隆接种于含有氨苄青霉素（100 g/ml）的小量LB 培养液中，37 振荡培养过夜；2. 将过夜培养物按1100 的比例接种到含氨苄青霉素（100 g/ml）的LB 液体培养基中，37 振荡培养至OD600约为0.5；3. 加入IPTG 至终浓度为0.1-1 mM，每隔一小时取一次样；4. 在诱导了3 小时的菌液中取适量（如10 ml），离心，去上清，加入1ml PBS 重悬，再加入PMSF 至终浓度为0.1 M，冰上预冷10 min；5. 进行超声破碎10 min（10-20 sec /次），至菌液较为澄清，离心，取上清；6. 用相同体积的PBS 重悬沉淀，将诱导前及诱导后所取的样品，以及超声破碎后的上清和沉淀分别进行蛋白电泳检测，染色、脱色；7. 根据脱色结果，可确定是否有表达出目的蛋白，选择合适的诱导时间以及表达量较高的克隆，并且判断所表达的蛋白是可溶性的还是以包涵体形式存在。十二、GST 融合蛋白的表达和纯化1. 按上述蛋白质诱导表达的方法表达出GST 融合蛋白，此时GST 融合蛋白是溶于PBS 中的；2. 取适量Glutathione SepharoseTM 4B beads（Amersham Biosciences，Sweden），用PBS 洗3 遍；3. 将beads 加入GST 融合蛋白的上清液中，4 Rotation 4-6 h；4. 4最高速离心3-5 sec，小心吸弃上清；并用PBS 洗3 遍；5. 藕联了GST 融合蛋白的beads 备用于后面的实验。十三、蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(一)、材料1. 30%丙烯酰胺储存液： 丙烯酰胺 29.2 g亚甲双丙烯酰胺 0.8 g加蒸馏水溶解后，补加蒸馏水至终体积为100ml。检测其pH值，应不大于7.0。过滤，避光储存。2. 2SDS 凝胶加样缓冲液： Tris-HCl (pH6.8) 100 mMSDS（电泳级） 4 %溴酚蓝 0.2 %甘油 20 %使用前加入二硫苏糖醇（DTT）至终浓度为200 mM。3. 5Tris-甘氨酸电泳缓冲液： Tris 碱 15.1 g甘氨酸 94 g溶解于900 ml dd H2O，再加入50 ml 10%（w/v）SDS（电泳级），用dd H2O补至1000 ml。 (二)、方法1. 配制所需浓度的分离胶：12 %分离胶15 %分离胶dd H2O 2.64 mldd H2O 1.7 ml30 %丙烯酰胺 3.2 ml30 %丙烯酰胺 4 ml1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 2 ml1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 2 ml10 % SDS 80 l10 % SDS 80 l10 % APS 80 l10 % APS 80 lTEMED 3.2 lTEMED 3.2 l2. 将配好的分离胶灌注到两玻璃板的空隙中，用异丁醇覆盖；3. 室温聚合，倾出异丁醇，用蒸馏水洗涤，并用滤纸吸净残留的液体；4. 配制5%的浓缩胶：dd H2O3.4 ml30 %丙烯酰胺0.83 ml1.0 M Tris-HCl (pH 6.8)0.63 ml10 % SDS50 l10 % APS50 lTEMED5 l5. 在已聚合的分离胶上灌注浓缩胶，立即插入梳子，室温聚合30 min；6. 待浓缩胶聚合完全后，小心拔出梳子；7. 向电泳槽中加入1Tris-甘氨酸电泳缓冲液，加样，并在所有不用的样品孔中加入等体积的1SDS 凝胶加样缓冲液；8. 接通电源（正极接下槽），先用120 V 电压电泳至染料前沿进入分离胶再将电压提高到150-200 V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部；9. 关闭电源，从电泳装置上卸下玻璃板，剥胶，接下来染色脱色或者做Western Blotting 鉴定。十四、Western Blot (一)、材料1. 转移Buffer: Tris碱 25 mM 6.08gGlycine L-甘氨酸 192 mM 28.80gMethnol甲醇 20% v/v500ml( ddH2O 定容至2 L)2. 3. TBST: 4. 封闭液: 5 %脱脂奶粉（溶于TBST）5. ProtoBlot AP System with Stabilized Substrate, Human (Promega，USA)6. Lumi-PhosTM WB (Pierce, USA)(二)、方法1. SDS-PAGE 电泳分离蛋白；2. 电转移至NC膜（100V恒流1 h）；3. 用封闭液封闭2 h或4封闭过夜；4. 加入一抗，室温温育1-2 h或4 温育过夜；5. 用PBST 洗3 次，每次5-10 min；6. 加入相应的二抗，室温温育45 min；7. 用PBST 洗3 次，每次5-10 min；8. 用PBS 润洗2 次；9. 加入适量的显色底物(1：1混合)（ProtoBlot AP System with Stabilized Substrate）至目的条带清晰可见，或者用Lumi-PhosTM WB底物做ECL。十五、免疫共沉淀(一)、抗体的偶联：1. 在Epp管中，加入500 l PBS、适量的抗体和Protein A/G Beads（Perice公司），再加BSA至终浓度至0.1 %；2. 将Epp管置4 ，rotation 4 h以上，4最高速离心3-5 sec，小心吸弃上清；3. 在Epp管中加入1 ml 相应的细胞裂解buffer，颠倒混匀，4 最高速离心3-5 sec后小心吸弃上清；4. 重复步骤3，用细胞裂解液清洗Beads 3-4 次，最后吸弃上清，将Beads放4 备用。(二)、免疫共沉淀：1. 收集转染后的细胞，800g 离心5 min；2. 吸弃上清，加入适量的PBS清洗细胞，重复2 次，800g 离心5 min，最后吸弃上清；3. 加4 倍细胞沉淀体积的裂解buffer，并在4 Rotation 1h；4. 14000 rpm，4 离心15 min；5. 小心吸取上清，加入到已偶联上抗体的Protein A/G Beads，4 Rotation 过夜；6. 4 最高速离心3-5 sec，小心吸弃上清；7. 加入裂解buffer重悬Beads，最高速离心3-5 sec后，小心吸弃上清；8. 重复步骤7，用裂解buffer清洗Beads 3-4 次；9. 最后加入适量的上样buffer，95 加热5 min后SDS-PAGE分析。十六、细胞培养(一)、细胞培养条件HeLa、HEK293T以及MCF-7细胞培养在DMEM+10% FBS的培养基中，H1299细胞培养在RPMI-1640+10 % CS的培养基中，所有细胞均在37 ，5% CO2孵箱中培养。(二)、贴壁细胞的传代1. 在细胞组织培养通风橱中，用灭菌过的巴氏德吸管吸去旧培养液；2. 用PBS 洗涤细胞，旋转培养皿使溶液覆盖整个细胞表面，然后吸去；3. 加入Trypsin/EDTA 消化细胞，旋转培养皿使溶液覆盖整个细胞表面，然后吸去，将培养皿在室温放置数分钟直至细胞从培养皿底部分离开来；4. 加入细胞培养液，用吸管吹打，使细胞脱离瓶底，从而获得单细胞悬液；5. 按一定比例将细胞悬液接种在含有新的细胞培养液的培养皿中，放入细胞培养箱中继续培养。 (三)、细胞的冻存（保种）1. 在冻存前一天换一次培养液；2. 对于贴壁细胞，用Trypsin/EDTA 把细胞消化下来，将细胞收集于离心管中； 3. 室温800-1000 rmp，离心5 min；4. 去除培养液，加入冻存液，细胞最终密度为5106/ml1107/ml；5. 用吸管吹打使细胞均匀，按1 ml 分装到冻存管中；6. 在-70 冰箱中保存一天后，转移到液氮中长期保存。(五)、细胞的冻融（复苏）1. 需要进行培养的冻存细胞取出，立即投入37 水浴中融化；2. 用吸管将细胞转移到25 cm2培养瓶中，加入一定量培养液；3. 37 培养，细胞贴壁后，换新鲜培养液继续培养。十七、细胞转染1. 按约1-3105细胞/孔的细胞量在六孔板中接种指数期生长的细胞，在37 ，5% CO2 孵箱中培养过夜，直至转染前细胞密度达到50%-80%；2. 制备下列溶液：Solution A: 在100 l 不含血清的培养液中加入1-2 g DNA。Solution B: 在100 l 不含血清的培养液中加入2-25 l Lipofectamine（Invitrogen，USA）试剂。3. 充分混匀上述两种溶液，室温放置15-45 min，使之形成DNA-脂质体复合物；4. 用2 ml 不含血清的培养液润洗细胞；5. 在上述混合液中加入0.8 ml 不含血清的培养液，混匀，加入到细胞中。37 ，5% CO2孵箱中培养2-24小时，推荐5小时；6. 往每孔细胞中加入1 ml含2倍平时浓度血清的培养液；7. 转染18-24小时后，换新鲜培养液；8. 转染72 h 后，将细胞按1：12接种到两个六孔板中，加入含G418的选择性培养液；9. 将细胞培养适当时间以选择真正被转染的细胞克隆；10. 挑出单克隆细胞并用Western blot 的方法验证。十八、细胞凋亡率的测定1. 转染前18-24 h 用胰酶消化并传代细胞于24 孔中，使其在转染时密度可达50%左右；2. 每24 孔瞬时转染等量不同质粒，24 h 后，每孔中所有细胞经Hoechst 33342 染色、充分混匀并静置5-10 min 后，在荧光显微镜(Olympus IX71)下随机选取5 个不同的视野进行拍照；3. 凋亡细胞的特征是在配有蓝色滤光片的荧光显微镜下可见细胞核发生了DNA 凝集和(或)片段化，同时在光学显微镜下可见其细胞有明显的皱缩、起泡和脱起；4. 计数荧光观察绿色荧光蛋白（GFP）融合的绿色的细胞及经Hoechst 33342染色后核的形态发生变化的细胞占所有发绿色荧光的细胞的百分比为凋亡细胞的死亡率。每个处理计数五个区域的细胞，并做三个处理。计数活细胞数和凋亡细胞数并进行数学统计。十九、间接免疫荧光1. 取出培养有细胞的盖玻片，吸干上面残留的培养基后，用适量预冷的PBS润洗盖玻片1-2次；2. 吸去残留液体，用4 的多聚甲醛/TBS 室温固定细胞约20 min；3. 吸去残留液体，用适量的TBST清洗细胞3次，每次5-10 min；4. 0.01 的Triton X-100/TBST室温下处理5-10 min；5. 用0.1 % Tween/TBS清洗细胞2次，每次5-10 min；6. 用1 BSA/TBS 封闭细胞1 h；7. 将适量的含有一抗的1 BSA/TBS加到含有细胞的盖玻片上，室温下孵育1h；8. 吸去抗体，用0.1 % Tween/TBS清洗细胞3次，每次5-10 min；9. 将适量的含有二抗的1 BSA/TBS加到含有细胞的盖玻片上，室温下孵育30 min；10. 吸去液体，用0.1 % Tween/TBS清洗细胞3次，每次5-10 min；11. TBST清洗细胞3次，每次5-10 min；12. 加适当浓度的Hoechst染细胞1 min；13. TBST清洗细胞3次，每次5-10 min；14. 最后吸去残留的液体后，在载玻片中央滴一滴抗淬灭剂，然后小心地盖上含有细胞的盖玻片，吸去周围多余的液体，用指甲油小心封片；15. 在荧光显微镜下观察蛋白质的细胞定位。二十、放线菌酮（CHX）抑制实验1. 按约5104细胞/孔的量在24孔板中接种指数期生长的细胞，在37 ，5 % CO2培养箱中培养过夜，直至细胞长至50 %-80 %密度；2. 用Lipofectamine 2000转染所需的质粒；3. 转染24 h 后加入25 ug/ml 的放线酮处理一定的时间，然后收集、裂解细胞并做Western Blotting。二十一、体外泛素化实验GST、GST-Siah-1以及GST-Siah-1表达在DH5或者BL21/DE3的大肠杆菌中。诱导表达以及纯化的方法如前所述。ubiquitination buffer： 50 mM Tris-HCl (pH7.6), 50 nM rabbit E1 500 nM UbcH5c 25 M Flag-ubiquitin 2 mM ATP. 反应总体系为30 ul，总的反应体系在37 以适当的速度振荡孵育1 h。反应结束后，GST、GST-Siah-1以及GST-Siah-