纳米药物11、组织工程相关纳米生物材料.doc

第11章 组织工程相关纳米生物材料组织工程学（Tissue Engineering）一门多学科交叉的边缘学科，其研究涉及到细胞生物学、分子生物学、发育生物学、免疫学、临床医学、生物材料学、计算机科学等多个相关学科。它是继细胞生物学和分子生物学之后，生命科学发展史上又一个新的里程碑，标志着医学将走出器官移植的范畴，步入制造组织和器官的新时代，人们试图通过组织工程学的研究，真正建造出替代人每一种组织甚至器官功能的生物性替代物。它的提出、建立和发展是对医学领域组织、器官缺损和功能障碍传统治疗方法和模式的一次革命，孕育着巨大的科学价值和广阔的临床应用前景，是21世纪生命科学研究领域的焦点之一，必将产生巨大的社会和经济效益【12】。目前国内外对组织工程学研究极为重视，组织工程相关产品正逐步形成高附加值的高科技产业，有些产品已开始进入临床。如人工皮肤TransCyte、Apligraf、人工软骨CarticelTM等。其它领域如骨、膀胱、血管、角膜、神经、输尿管、肝、胰、心脏瓣膜、血细胞、食管、肠管等的研究也正处于积极的实验阶段。但是，目前组织工程研究尚存在许多基本问题亟待解决，主要表现在：生命现象的本质及活动规律，即各种细胞、组织和器官的基本结构及其与功能的关系；如何调控种子细胞的特异性粘附、增殖、定向分化以使其获得良好的生物学活性，充分发挥其特定的功能；生长因子等组织诱导因子的大规模制备及持续控制释放；具有良好表面相容性、结构相容性、适当生物降解性和特定生物活性的仿生“智能”基质材料的研制，以引发人们所需的特异性、可控性生物反应等等【34】。纳米科技给上述问题的解决带来了新的发展机遇。和它在生物医用材料领域中的意义与应用前景一样，纳米科技在组织工程学各领域的研究中也有重大的科学意义及广阔的应用前景，人们可以将纳米科技在其它领域的研究成果广泛地应用于组织工程学各相关领域【5-8】。组织工程学和纳米科技的有机结合，标志着组织工程学研究进入一个崭新的时代纳米组织工程学时代。纳米组织工程学（Nano tissue engineering）就是将纳米科学与技术和组织工程学有机结合，从原子、分子水平认识细胞和组织的基本结构及其与功能的关系，阐明生命现象的本质及活动规律，并研制具有特定功能的仿生纳米装置和材料，为更好地恢复、维持或改善病损组织的功能奠定基础【14】。纳米组织工程学的首要任务是利用纳米科学的原理和技术，从原子、分子水平进一步深入认识真核细胞基因组的结构及功能调控、基因产物如何构建成细胞结构、如何调节和行使细胞功能等，从而认识各种细胞、组织和器官的基本结构及其与功能的关系，阐明生命现象的本质及活动规律。然后从科学认识发展到工程技术，设计和制造出相应的纳米器件、纳米药物、纳米仿生“智能”基质材料，如纳米细胞监测器、纳米细胞清扫器、纳米细胞修复器、纳米细胞等，以更好地调控种子细胞的特异性粘附、增殖、定向分化等生物学行为，使其获得良好的生物学活性，实现良好的功能替代。为最终解决目前组织工程学研究存在的基本问题提供强有力的技术支持【3-4】。在组织工程学研究中，细胞外基质替代物即基质材料的研究是一个至关重要的方面，是目前限制其发展和临床应用的一个瓶颈。如何研制出具有良好表面相容性、结构相容性、适当生物降解性和特定生物活性的仿生“智能”基质材料，以引发人们所需的特异性、可控性生物反应，是目前组织工程学研究亟待解决的关键性基本问题之一【912】。因此，大力研究和开发新一代组织工程相关纳米生物医用材料，是新世纪生物医用材料的重要发展方向，也是本章讨论的重点。以下就对组织工程相关纳米生物材料的制备及表面仿生修饰予以介绍。11.1 纳米纤维支架材料的制备除可注射性材料以外,大多数组织工程支架必须预先制成多孔支架。组织工程多孔基质材料应具有功能梯度结构，在三个尺度范围控制着细胞的生长发育过程。从制备方法上看, 解剖外形和尺寸（mm-cm）则取决于成型方法,而大孔尺寸(102m)、孔壁尺寸(m)、孔壁内微细结构(如微纤,微孔,50500nm)取决于致孔方法。纳米材料制备技术可以对基质材料表面的纳米结构(nm)进行设计和加工。纳米材料中的维数概念与一般材料科学中的维数有所不同，纳米材料根据维数的不同分为三类：零维材料指空间三维从尺度均为纳米尺度的材料，如纳米颗粒。一维材料指空间尺度有两维处于纳米尺度的材料，如纳米棒。二维材料指空间尺度有一维处于纳米尺度的材料，如超薄层。从多孔支架的孔形态上看，主要有纤维、多孔海绵/泡沫、相连管状结构等三种,其中纤维支架是组织工程研究中最早采用的细胞外基质替代物之一。在典型的结缔组织中，结构蛋白纤维，如胶原纤维和弹性蛋白纤维的直径从几十纳米到几百纳米，这些纳米级蛋白纤维相互交缠，形成非编织状的网，为组织提供拉力和弹力。粘连蛋白，如纤维结合蛋白、层粘连蛋白为细胞的黏附提供特殊的结合位点。纳米纤维支架有较高的表面与体积比，它可以大大增加细胞的黏附，从而可以增加细胞的迁移，增殖及分化功能。因此，纳米纤维支架较传统的支架更有发展前途【1315】，也是本章讨论的重点。11.1.1 纳米纤维支架材料的制备有三种方法合成这种纳米纤维支架材料：自组装技术，电子纺丝技术，相分离技术。1 自组装技术应用分子自组装技术，依靠分子间非共价键的键合作用制备超分子纳米材料。在材料表面通过非共价键形成自组装膜，吸附分子存在时，局部形成的无序单层可以自我再生，生成更完善的有序体系，具有较大的流动性和可变形性，赋予适宜细胞生长的材料表面拓扑结构。用自组装技术合成纳米级超分子结构，也可合成纳米纤维【15】。为了模拟形成天然骨的纳米结构, Stupp等【1619】应用pH控制的自组装技术设计合成了一种两亲性多肽（PA）, 可以自组装生成纳米结构纤维支架。这种圆锥形的两亲性多肽主要包括5 个基本的化学结构特征: (1) 长的疏水烃基尾端; (2) 含有4个连续的半胱氨酸残基，通过氧化反应，半胱氨酸上的SH基团可与另外一条多肽链上SH自组装形成二硫键，从而使多肽链形成牢固的高级结构; (3) 含三个甘氨酸的交连部分，以提供亲水性的头基与坚硬的交联区域的结合; (4) 磷酸化的丝氨酸位点，这些位点带有大量负电荷，可以诱导钙离子沉积、成核生长并自组装而成纳米晶HA; (5) 含有细胞结合配体序列ArgGlyA sp（RGD），可促进种子细胞的黏附。其中，半胱氨酸，磷酸纤维化的丝氨酸以及RGD序列是PA肽链的特征性结构（图111）。由于PAs有圆锥状结构和两性分子的特点，可以自组装形成圆柱状纳米纤维, 纳米纤维直径约为7.6nm，长度超过1m（图112）。在结构方面，两亲性多肽链与纳米纤维垂直，疏水端包裹在长柱状结构内部，亲水端暴露在长柱状结构的表面。这与天然胶原基质有所不同，在天然胶原中其排列呈平行状。在pH=8时将二硫苏糖醇注入PAs，然后调整pH=4，酸化的PAs很快自组装交联固化而形成纳米纤维。这种离散型纳米纤维能通过氧化生成二硫键发生交联达到材料的自组装, 同时也能通过自由巯基的释放来控制自组装的可逆过程; 生成的纳米纤维可相互交织形成网状结构, 宏观呈凝胶状。研究表明, 提供足够量的酸性磷酸化丝氨酸和天门冬氨酸能促进初始HA 的成核, 将此凝胶浸入钙磷酸盐缓冲溶液中,表面充满带负电荷酸性氨基酸的纳米纤维可通过建立局部的过饱和离子环境促进自身矿化生成纳米HA晶体, 这些矿化的纳米纤维中Ca/P比率为1.670.08, 而且晶体学上的HA c 轴沿胶原纤维长轴定向排列, 类似与自然骨最基本的形态学结构。图11-1两亲性多肽（PA）图11-2两亲性多肽自组装形成圆柱状纳米纤维, 纳米纤维直径约为7.6nm。 胶原是一种三股螺旋超二级结构，它由三条左旋的多肽链组成。Fields 等用一种两亲性多肽（PA）分子去模拟这种结构。PA由a1(IV)1263-1277胶原序列Gly-Val-Gly-Asp-Lys-Asn-Pro-Gly-Trp-Pro-Gly-Ala-Pro（IV-HI）结合一个长链单或双羟基脂质（1418）组成。胶原序列的头端组成了三维螺旋结构，而亲脂的尾部与疏水端相结合以诱发和稳定胶原序列头端的三维结构，并且因它的长度和分支不同而影响PA超分子结构的热稳定性。在生理条件下，（IV-HI）PAs可以自组装成三股螺旋状结构。在（IV-HI）PA中培养黑色素瘤细胞，以检测与细胞黏附，展开及信号传导有关的生物学特性。发现PA能明显诱导细胞黏附。细胞的展开在50molar的（IV-HI）PA双分子层及（C18）2-Glu-C2-COOH3亲水分子面明显增加。这种三股螺旋构象的稳定性可以影响细胞的黏附及展开【2021】。在酸性分泌蛋白序列的基础上研发了嵌合体PA。特点是其富含半胱氨酸，即富含半胱氨酸酸性分泌蛋白（SPARC）。其能促进细胞增殖及血管发生。上皮细胞被用来检测SPARC PA的生物活性。SPARC PA自身能轻微地促进细胞的黏附和伸展，当它与C10（a1(I)496-507）混合时，它可以明显地促进细胞黏附和展开，其水平相当于I型胶原。 2 电子纺丝技术【22】电子纺丝技术是通过在聚合体溶液/融液中加入电荷悬浮微粒而制成超细的纳米纤维。1934年Formhals首先申请了电子纺丝技术的专利。其原理是利用电流使得聚合体溶解/融化，再由收集器收集，聚合体溶液/融液要在收集器中固化，在收集器的顶端通过重力或机械泵产生悬浮微粒，用（1020KV）的高电压产生足够的静电荷，当静电荷克服了微粒的表面张力后聚合体溶液/融液就喷出了。随着溶剂的蒸发，表面电荷密度增加，喷射流越来越细，纳米纤维雏形形成。在喷射物干燥的过程中，喷射物中静电荷的放射状力量远远大于喷射物中的内聚力，这些导致聚合物扩展或分解成直径相同的小的喷射物和电位电荷，这些小的喷射物最终在金属样本收集器上形成纳米纤维【2324】。在电子纺丝技术中寻找合适的溶剂相当困难。HFP是静电纤维缠绕技术中溶解蛋白质的常用溶剂。溶解丝蛋白用甲醇作溶剂。静电纤维缠绕技术中丝蛋白可以在水中与PEO混合，然后用甲醇洗涤，除去PEO。Huang等用基因工程的方法合成一条含多次重复的弹力蛋白多肽链，（Val-Pro-Gly-Val-Gly）4(Val-Pro-Gly-Lys-Gly)。这条多肽溶解在水中，在适当条件下用静电纤维缠绕技术合成直径200300nm的纳米纤维。Fang报道用小牛胸腺钠DNA水溶液合成直径5080 nm的纳米纤维【25】。目前,利用电子纺丝技术开发生物医用材料制品已成为研究的热点。研究的方向主要集中在两方面:一是利用电子纺丝制备的纳米级纤维,作为细胞支架、药物等添加剂的载以及纳米级仿生材料等。二是改变收集方法以获得薄膜及管状物等功能性形态结构,可广泛用于伤口包覆材料、功能性膜、人造导管等【2627】。 现在组织工程中广泛应用的生物材料多是由电子纺丝技术制成的纳米纤维。典型的生物可降解聚合物PLGA或PCL,水溶性生物材料如PEO、PVA用水或有机溶剂很容易被电子纺丝法制成纳米纤维，PLGA及PCL纤维的直径分别为500800nm及200600nm，PLGA无纺三维多孔支架的孔隙率90%（图113）。型胶原纤维的平均直径250nm，天然的聚合体，如：胶原，丝蛋白，弹力蛋白衍生肽，纤维蛋白原，酪蛋白及脂肪酶甚至DNA都可以用电子纺丝技术处理，生成纳米纤维。一个有趣的现象是静电纤维缠绕技术生成的型胶原纳米纤维的67nm现色带为典型的天然胶原纤维。Fang等【28】用1mg 的小牛胸腺Na - DNA 溶液(浓度0.3 1.5 %),通过电子纺丝制备了50 - 80nm纳米纤维。图11-3 电子纺丝法制备的PLGA纳米纤维，直径为500800nm，孔隙率90%。从生物学角度看,人体几乎所有器官(如骨、牙周组织、胶原、皮肤、软骨等) 都是以纳米级纤维形式存在。许多报道，认为电子纺丝制备的纳米纤维膜能够支持细胞粘附和增殖,接种在纤维膜上的细胞保持表型并按纳米纤维取向引导生长。电子纺丝制备的纳米纤维支架与常规纤维支架相比,纳米纤维支架与细胞外基质在形态结构上具有更高的相似性，在纤维支架中纤维直径小于细胞直径有利于细胞粘附和生长。纳米纤维支架特有的高比表面积和孔隙率,有利于细胞接种、迁移和增殖,并有好的生物相容性,达到了细胞支架的设计要求【29】。最近,Jin等【30】将人骨髓干细胞(hBMSCs) 种植在由丝素和PEO(聚氧乙烯) 共混后电子纺丝制备的纤维支架上。培养10 天后,用SEM和MTT观测后发现,纳米纤维膜促进了细胞粘附和增殖。Yoshimoto等【31】把从小鼠骨髓获得的骨髓基质干细胞(MSCs) 进行扩增,接种在电子纺丝制得的PCL (聚己内酯) 细胞支架上,在动态培养液中培养4 周。用SEM观察并进行组织学和免疫组织化学测试。1 周后发现细胞进入支架,并产生大量细胞外基质。4 周后发现钙化和I 型胶原。Yoshimoto 认为PCL 作为组织工程的生物材料有巨大的潜力。传统的膜材料由于存在难以控制孔隙率,浸在液氮中易变脆和难以保持完整性等缺点,限制了其作为细胞储存和运输载体材料的应用。为克服上述缺点,近来Chu等人将细胞包埋在用电子纺丝法制备的双层纤维膜中,形成纤维膜/ 细胞/ 纤维膜结构。将骨细胞包埋在用PLA 制备的双层纤维膜中,结果发现这种结构浸在液氮后能保持完整、没有变脆。同时纤维膜的孔状结构有利于氧气、养分和CO2 的传输。另外,这种结构有利于细胞释放,细胞活性没有受到影响。认为这种细胞载体可以包埋不同细胞以用于修复神经缺陷和引导骨组织再生等。Bowlin 等【32】则用电子纺丝法制备的PLA/ PGA 纤维膜作为肌细胞的支架,开展肌肉组织工程的研究。人造血管的多孔性和顺应性能影响组织反应,多孔的人造血管有利于宿主组织的长入,使其内壁能更好地内膜化。近来Dubson利用电子纺丝技术,用聚氨酯、聚四氟乙烯等原料,采用不同收集方法和工艺参数获得的复层人造血管柔顺性好,孔隙率高,力学性能优良。植入狗体内易于内膜化,没有发现细化和血栓。美国弗吉尼亚联邦大学的Jason Gorss等【33】用特殊的收集装置获得了胶原蛋白人造血管,直径比常规的移植血管小6 倍。胶原蛋白是许多细胞外基质的主要成分,因此胶原蛋白作为组织工程的细胞支架对细胞培养十分有利,但传统的胶原膜由于力学性能差限制了其作为支架的应用 。近来,Matthews【34】在用电子纺丝法研究胶原作为细胞支架的可行性,用冻干的鸡胸软骨型胶原电子纺丝后获得了110nm1. 8m 的纤维,并将软骨细胞种植在这种纤维支架上。结果显示,胶原纤维支架与软骨细胞具有良好的相容性,能促进细胞生长,并且细胞容易迁移到支架内部。Huang等【35】用型胶原和PEO 共混后电子纺丝获得了纳米级纤维,认为这种基于细胞外基质成分的织物可用在伤口包覆和组织工程中。利用电子纺丝技术,国外已经成功开发生物医用材料制品，国内在这方面的研究还十分匮乏。与溶液喷丝法制备无纺布纤维支架相比, 用电子纺丝法制备纳米纤维需要高电压操作, 加工成型比较困难, 制备的无纺布比较薄, 力学性能不很理想。 溶液喷丝法可制备具有一定厚度和形状的无纺布, 有一定的力学性能, 加工成型安全而且容易操作, 与溶液浇铸粒子浸出法制备的多孔支架相比, 无纺布支架连通性好, 有利于细胞的黏附以及营养和代谢产物的进出。今后随着纳米技术和组织工程研究的发展,电子纺丝技术必将进一步完善，必将得到进一步开发和应用。 3 相分离技术/冷冻干燥技术相分离技术是制备三维组织工程支架常用的一种方法，是指将聚合物溶液、乳液或水凝胶在低温下冷冻,冷冻过程中发生相分离,形成富溶剂相和富聚合物相,然后经冷冻干燥或萃取，除去溶剂而形成多孔结构聚合体支架的方法。因而,相分离法又往往称为冷冻干燥法。相分离/冷冻干燥法孔尺寸往往偏小,但该法避免了高温,因而得到了研究者的重视。当某些条件如：溶剂、聚合提的浓度、凝胶化温度、凝胶作用时间等可以精确控制时，就能合成微小的或纳米级聚合物纤维支架。这种支架的结构更接近于天然细胞外基质的微结构,与天然的胶原非常相似，其纤维直径约50500nm，孔隙率大于98【3637】。图11-4 相分离技术制备的PLLA纳米纤维支架。纤维直径约50500nm，孔隙率大于98（a: SEM500，b: SEM20K）。按体系形态的不同,相分离技术可简单地分为乳液冷冻干燥法、溶液冷冻干燥法和水凝胶冷冻干燥法。用相分离技术制备多孔泡沫支架的过程涉及热诱导凝胶、溶剂交换和冻干，包括5个基本步骤：聚合物溶出；相分离；凝胶作用；水解，冷冻及真空下冷冻干燥法从凝胶中溶剂萃取；凝胶化，这是最重要的步骤，其控制多孔基质的形态学特征。低温下凝胶化可形成纳米级的纤维网状结构。其它过程的改变，如：溶剂，聚合体的类型，聚合物的浓度，溶质的改变，热处理及操作程序的改变等，都可以影响多孔泡沫的形态。例如，用相分离技术制备三维PLLA纳米纤维的具体方法为:50 下配制一定浓度的PLLA 溶液; 将少量聚合物溶液迅速冷却, 使其在某一温度下形成凝胶; 将凝胶浸入蒸馏水中进行溶剂置换;将溶剂置换后的凝胶移至冰箱中冷冻一段时间;冻干。得到的纤维状网络支架中的纤维直径约为50500 nm , 支架的比表面积极大, 是盐粒洗出法制得支架的3 倍。这样的支架能够为细胞粘附生长提供一个更大的空间。溶液冷冻干燥法用于多孔支架制备时,所得支架孔尺寸往往小于100m。Nam 等【38】通过冷冻过程参数的调控并利用加粗效应制备了孔尺寸超过100m 的多孔支架,发现孔尺寸的影响因素主要有溶液浓度、冷冻速率和冷冻温度梯度。Ma等【39】用改进的溶液冷冻干燥法制备出具有与天然胶原类似的纳米纤维网络结构的多孔支架,但仍存在孔尺寸过小的缺点。同时，Ma等【40】比较了相同孔隙率的纳米纤维支架和泡沫状PLLA支架，研究发现：纳米纤维支架大约吸收4倍的人血清蛋白，还可以优先地吸收细胞黏附蛋白，如：纤维结合蛋白和玻璃体结合蛋白，比泡沫状PLLA支架大约高出24倍，纳米纤维支架中成骨细胞的黏附是泡沫状PLLA支架的2倍。某种蛋白对纳米纤维支架的特殊亲和力表示这种结构可以作为一种选择性的酶作用底物，增加ECM与细胞间的相互作用。乳液冷冻干燥法: Whang 等【41】首先将乳液冷冻干燥法用于组织工程多孔支架的制备。将水与聚合物溶液一起均化得到油包水乳液,并浇铸到模具中,冷冻干燥脱除水分和溶剂,得到多孔支架。支架孔隙率9095 % ,大孔尺寸达200m ,溶剂挥发还会形成0.01m 以下的微孔,孔表面积达58102m2/g,为相连的孔结构。孔结构的影响因素主要有油水比、聚合物分子量。该法避免了高温,有利于生物活性分子如蛋白质生长因子或分化因子的引入和控制释放,孔比表面积大,易操作,可制作厚的器件(1cm),但孔尺寸偏小。将明胶、藻酸盐、壳聚糖等水凝胶经冷冻干燥亦可制得多孔支架。亲水性水凝胶多孔支架在体液环境中强度下降是一个值得重视的问题,一般需要与其它材料复合。应用相分离技术可制备出相连管状孔道结构，并具有纳米纤维孔壁结构。在相分离聚合体固化过程中，通过在泡沫中加入糖、无机盐或石蜡球，可进一步增加孔率，可以制成管状细孔及任意孔结构，在孔隙的设计上随意性及变化性强（图11-5）。Ma等【42】将糖纤维等水溶性纤维材料预先构建成具有特定结构的三维“负”支架,“负”支架经水蒸汽处理后形成连结,然后将聚合物溶液滴在“负”支架上,冷冻使聚合物溶液凝胶化,用水浸出糖纤维,然后冷冻干燥脱除溶剂,得到的多孔支架具有预先设计的相连管状孔道结构,孔隙率高达90 %以上,并具有纳米纤维孔壁结构。“负”支架的构建既可手工完成,也可用快速成型技术来实现自动化。与通常的快速成型技术不同的是,首先形成的是最终的多孔支架的“负”复制品。该支架的相连管状孔道结构更有利于支架内的传质过程,其纳米纤维孔壁结构则更有利于细胞粘附（图11-6）。图11-5 相分离技术制备的PLLA纳米纤维支架图11-6 相分离技术制备出相连管状孔道结构，孔壁具有纳米纤维网状结构。应用相分离技术制成的纳米纤维支架，其多样性更丰富也更容易控制。通过控制孔隙结构间纤维的直径来控制支架的形状，通过操作系统良好的控制，可一步一步获得任意形状的支架。相分离技术的另一个优点是，不需要很复杂的设备，技术操作简单，它可以产成连续的纤维网状结构，具有良好的机械性能。另外，这种支架克服了潜在的免疫反应及疾病的传播。纳米纤维支架通过渗入可以完全控制相互关联的孔状结构，模拟天然胶原的三维立体结构。通过天然细胞外基质与合成生物可降解聚合物的比较，纳米支架可增加细胞的黏附，迁移，生长，功能，以及可控降解率，亲水性，以及适应特殊用途的机械性能。以此技术为模板，可以制造出各种解剖形状的支架。11.1.2 纳米纤维直径的控制及定向排列在组织工程支架的应用过程中，不同的组织对纤维直径的要求不同。纳米纤维的直径从几十到300纳米不等，人们一直渴望获得天然ECM中蛋白纤维的直径，换句话说，在人造的基底膜中，需要制造小直径纤维（从几到几十纳米）来模拟型胶原及层粘连蛋白。在电子纺丝技术中，可以通过调节参数（聚合体浓度，聚合体溶液的流动速率，溶剂的导电率，温度等等）来控制纳米纤维的直径。Fridrilh等研制的数学模型表明，纳米纤维的直径由聚合体溶液的流动速率，电流及液体的表面张力决定，改变聚合体溶液的流动速率将产生6种不同直径的纤维，与在PCL上获得的试验数据相同。Peneker称可以制成直径3nm的聚合体纳米纤维，相当于6或7个分子跨一个纤维。Ma PX等用调整聚合体浓度和溶剂导电率的方法获得直径10nm的PLLA-co-PCL纳米纤维。当前研制直径为几纳米的纳米纤维是研究的重点，它在组织工程支架，防护服，高性能超虑膜等方面有广阔的应用前景。在天然组织中细胞通常是规则地定向排列，细胞的方向性对组织的功能是非常重要的。例如，在天然的血管中，由血流产生的切应力决定内皮细胞的排列方向是顺应血流方向，相反，在血管壁上平滑肌细胞的排列方式是围绕血管壁呈同心圆排列，可以为血管提供机械性强度以抵抗内部的压力。另外，在韧带组织中，成纤维细胞的排列方向与韧带的方向一致，可以增强组织的牵拉力。因此，在组织工程支架上控制细胞的方向是非常重要的。在电子纺丝技术，当纳米纤维沉淀在一个静止盘中可随机获得定向的无纺纳米纤维基质。反之，沉淀在一个旋转的收集器上，可获得对齐的纳米纤维基质。通过使用一个边缘锐利的旋转盘作为收集器，Ma PX等制备了定向排列的PLLA-co-PCL纳米纤维，已成功地被用来指导细胞的排列。Xu等【43】发现在定向排列的聚合体纳米纤维上比任意方向的纳米纤维上有更多的平滑肌细胞黏附与增殖。Lee等【44】在定向排列的PU纳米纤维上培养人韧带成纤维细胞，发现成纤维细胞的方向与纳米纤维的方向一致，比在任意方向的纳米纤维上产生更多的胶原。还有一种方法制备定向排列的纳米纤维。Zong等【45】用柱形法制备定向排列的聚合体纳米纤维，用电子纺丝技术，从抗拉力伸展器中按一定的速率拉出无纺的网状纤维，随后在拉紧状态下在几个不同的温度下（6090）退火。柱形拉出及退火的纳米纤维不仅能增强纤维的方向而且能增强晶体的方向。Li等【46】用二块带电的导体组成一个特制的收集器。两块导体间有一空隙，空隙的宽度可以从几十毫米到几百毫米，受静电的相互作用，带电荷的纳米纤维被来长以跨越这个空隙，而形成单向的定向排列的纳米纤维。美国曾专利报道，通过一个辅助的电场，围绕纵轴旋转的收集管可以制备同心圆方向的定向排列的纳米纤维，由此获得的小直径管道结构纳米纤维基质，可作为血管，泌尿道及胆道修复假体。11.1.3 纳米纤维基质的生物相容性目前对纳米纤维基质的生物相容性的研究多集中在在纳米纤维基质中进行体外细胞培养，以评价细胞黏附，增殖，基因表达及分泌细胞外基质的功能。在PPOD/PLLA-b-PEC上培养NIH3T3成纤维细胞发现：依据纳米纤维的方向，细胞试图保持其表型及生长趋势【4748】。由PLLA-PCL嵌段共聚物制成的无纺定向排列的纳米纤维基质被用来作为血管组织再生的支架。嵌段共聚物纳米纤维基质可以促进内皮细胞及平滑肌细胞的黏附和增殖。Li等【4951】在PLGA或PCL纳米纤维上培养成纤维细胞，软骨细胞，骨髓衍生的间充质干细胞，结果发现：纳米纤维的结构能够支持细胞的黏附和增殖。在三维的PCL支架上培养牛胚胎软骨细胞，用逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）评价其表型，软骨细胞种植在纳米纤维PCL支架上，在不含血清的介质中培养，通过不断表达软骨特有的细胞外基质来保持其软骨表型。除了促进其表型的表达，当把PCL纳米纤维置于富含血清的介质中，能促进软骨细胞的增殖。将成人来源的脊髓间充质干细胞在PCL纳米纤维支架中培养，在转化生长因子B1（TGF-B1）存在下可以诱导生成软骨细胞，可以通过软骨特有的基因表达和合成软骨相关的细胞外基质（ECM）蛋白证实。Yoshimoto等【52】将鼠脊髓间充质干细胞种植到PCL纳米纤维上，在成骨的培养基中动态培养，1周后发现细胞有深入纳米纤维基质的趋势。4周后发现支架被多层细胞覆盖，PCL纳米纤维上可见矿化和I型胶原。Shin等【53】在纳米纤维网格中培养心肌细胞，心肌细胞在PCL网上黏附良好，并表达心肌特有的蛋白，如：a-肌球蛋白重链，间隙连接蛋白43和I型肌钙蛋白。来自天然原料的纳米纤维通常比合成聚合物纳米纤维有更好的细胞间相互作用。平滑肌细胞在纳米纤维基质中培养7天后发现，细胞渗入基质并整合于网状结构中。对软骨细胞的种植发现，型胶原支架能够支持细胞的生长并有利于细胞的浸润【5455】。Jin等【56】在丝蛋白纳米纤维上培养人骨髓基质细胞（BMSCs），培养14天后发现丝蛋白基质支持BMSC的黏附和增殖，也可促进人的角质化细胞及成纤维细胞在丝蛋白纳米纤维上的黏附和增殖。11.1.4 纳米纤维的修饰在体内环境中，细胞和材料的相互作用实际上是细胞膜表面的受体与生物材料表面所能提供的相应配体之间的分子识别。因此，对纳米纤维进行修饰就是通过材料表面与细胞间相互作用的角度来调控细胞的黏附，迁移，分化及增殖。在保持纳米纤维物理、力学性能的前提下引入可促进细胞黏附、生长的生物活性分子，以显著提高纳米纤维的细胞相容性进而指导组织合成。具体到纳米纤维，其修饰分为整体修饰和表面修饰。纳米纤维的本体修饰：聚合体纳米纤维通过混入其他分子而改变其功能。活性分子如生长因子，药物和基因可直接混入聚合体溶液。Luu等【57】将质粒和PLA-PGE、PLGA在DMF溶液中混合，将混合物制成纳米纤维，支架释放质粒DNA达20天，最大释放发生在混合后2小时。Verreck等【58】分别用DMF和DMAC作溶剂，制备含药物依曲康唑和酮舍林的PU纳米纤维，药物的释放曲线与时间呈线性关系。Wang等【59】将荧光聚合体与聚氨酯乳胶混合，将混合物制成纳米纤维膜，该膜具有高度敏感的光学探测功能，用于检测金属离子（Fe3+和Hg2+）和2，4二硝基甲苯(DNT)纳米纤维的表面修饰：合成生物材料的表面修饰是为了提高其生物相容性。Sanders等【60】通过血浆诱导来改变PU纤维表面的阴阳极电荷，制成聚合体网状纤维结构，植入小鼠皮下，5周后发现负电荷的表面容易有脉管长入。ECM蛋白质如胶原，纤维结合蛋白和层粘连蛋白被涂在丝纤蛋白纳米纤维的表面以促进细胞的黏附。表面修饰也可以减缓纳米纤维的退化和破坏。血浆、紫外线、r射线、高温或基本环境的破坏都很容易破坏纳米纤维，一些表面修饰方法，如涂层，表面静电作用，在适当的条件下可以固定活性分子在聚合体的表面，以抵抗纳米纤维抵御外界环境变化的能力。综上所述，纳米组织工程材料制备技术是一门新兴的技术，还有许多丞待解决的问题。例如：如何构建理想的细胞纳米材料界面、如何在材料表面引入细胞特异性识别的位点、如何对材料表面进行修饰以提高纳米材料的组织相容性和力学相容性、如何携带更多的生长因子并持续控制释放、如何使纳米支架材料上培养的细胞组织免遭受体免疫系统的排斥等等。11.2 组织工程相关纳米生物材料的表面修饰由于生物材料在纳米(nm)尺度的分子组成与结构决定着材料表面的理化性质及介观结构特性，生物材料表面的拓扑结构、亲水/ 疏水平衡、自由能、电荷状况、化学基团和生物特异性识别等特征又与材料/细胞相互作用有密切关系，它调控着细胞的粘附与基因的表达，强烈地影响种子细胞的生长与功能，其细微变化对材料生物活性的改变是相当巨大的。所以深入研究仿生工程化生物材料表面与细胞间的相互作用，并对生物材料进行表面修饰,使其具备良好的生物相容性及能使细胞和分子产生响应的特异性识别位点,是设计和改进第三代生物材料的关键，也是当前研究的热点。通过将特定信号识别功能的生物分子与现有材料结合，即对表面进行分子设计和修饰，制成新一代的有特定修复功能的“智能”材料，可减少不必要的界面反应，使表面结构具有有序性、特定分子间的可识别性和运动性，增加表面相容性和生物活性，并能对环境中的生化、力学等各种刺激信号作出响应，以产生人们所需的特异性、可控性生物反应，实现理想的功能替代。以下就对生物材料的与细胞的相互作用及表面修饰的技术方法予以介绍。11.2.1 生物材料表面与细胞的相互作用从细胞和分子水平看,细胞与生物材料表面间的相互作用可用细胞膜与材料表面结合位点间的相互作用来描述,细胞膜受体与材料表面配体的结合方式主要有配位结合、疏水性结合、静电结合、氢键结合等,在生理环境中,贴壁细胞与植入材料的相互作用实际上是细胞膜表面受体与生物材料表面配体间的相互间分子识别,产生生物特异性与非特异性相互作用。当材料植入体内,细胞膜表面的受体积极寻找与之接触的材料表面所能提供的信号,以区别所接触材料为自体或异体,因此深入理解生物材料表面与细胞相互作用并进行表面修饰是临床应用材料设计的关键。细胞和细胞外基质间粘连不仅使其保持形态,还起着细胞间信息传送和功能调节的重要作用。细胞表面和基质表面分子间特异性相互作用,调节细胞黏附、增殖、分化和凋亡,维持细胞生长和凋亡的动态平衡。细胞和基材的黏附很大程度上由吸附的血清蛋白层决定,血清中200 种以上的蛋白质经过竞争吸附过程后形成吸附层,其中有少量的蛋白质(如纤连蛋白、层连蛋白及玻连蛋白等)有助于细胞黏附,但是吸附层中不促进细胞黏附作用的蛋白质(如白蛋白) 却占多数,因此消除非特异性吸附非常重要。当植入材料生物体系统的非特异性吸附作用被完全抑制,同时又具备细胞识别的相应位点,则会被细胞认为是自体,实现材料和细胞的融合作用,积极诱导组织再生。从仿生的角度出发,组织工程支架可视为人工细胞外基质(ECMs) ,表面修饰旨在抑制非特异性相互作用,引入特异性相互作用位点,使人工ECMs 在体内生理环境中发挥其功能。设计处理具有特定理化特性与其生物可识别能力相结合的医用高分子材料,通过计算机辅助设计,将研制出新型的人工识别材料系统,使功能团在聚合物骨架、交联结构及大分子网络中精确定位,是未来分子生物学和材料学的发展趋势。1 生物材料表面的细胞粘连调控细胞与生物材料的粘连是生物医学应用的一个重要方面,也是组织工程中促进材料与组织整合及组织重建的基础。在组织工程中,组织工程用支架植入体内后,生体内的细胞受体积极在支架表面搜寻配体,以期得到响应。细胞首先要在支架表面黏附上,才能够增殖和分泌细胞外基质。细胞粘连过程受ECM 表面的蛋白质特异识别控制。然而基质表面性质和细胞响应相关性远未阐明,尚不能进行控制。基质表面性质对细胞响应可借助于吸附过程介导,该过程涉及不同来源的许多化合物间的竞争。细胞的粘连, 可分为ECM结合、内皮细胞粘连和细胞间的粘连3类。细胞与生物材料的相互作用中,ECM 粘连极其重要。这种细胞粘连现象源于ECM 的结构蛋白,如纤连蛋白、胶原、层粘连蛋白、血纤蛋白原和弹性蛋白等粘连蛋白质的特定肽序列和细胞整联蛋白受体的相互作用。黏着斑黏附(focal adhesion) 是细胞与基质黏附接触的常见形式。黏着斑由整连蛋白作为主要黏附受体和相关细胞质斑蛋白包括踝蛋白、纽蛋白、肌动蛋白、张力蛋白、桩蛋白和大量蛋白激酶组成。整联蛋白(integrin) 是细胞表面受体的一个主要家族,主要参与调节细胞与ECMs 选择性黏附及细胞间的相互作用,直接影响到细胞的生长、增殖、凋亡等生理活动,包含由14 种及8 种两大类亚单元构成的20 多种不同杂二聚体跨膜蛋白。在各种特定的肽序列中，以精氨酸甘氨酸天冬氨酸(RGD) 序列最为显著【61】。2 生物材料表面的生物特异性识别生物材料植入体内后一般会产生非特异性和特异性相互作用, 细胞识别功能是宿主产生移植排斥的根本原因。自然界中,各种细胞大都以蛋白质作为其分子识别介质，其中主要基于整联蛋白与ECM中配体的相互识别,实现信号传递。黏着斑是接触表面与肌动蛋白微纤接触的主要位点,它的形成与细胞延展过程有关,所以黏着斑是细胞黏附和运动协同作用的位点。整联蛋白与黏附分子配体和细胞骨架蛋白及一些细胞内信号分子相连,有效地传导由ECMs 到细胞内的信号,从而影响细胞的生物学行为。因此,设计具有特定功能的蛋白质或其多肽片段及诱导已有蛋白质功能的演变是探索、模仿细胞识别的两条途径。根据组织工程对生物材料的基本要求,需要抑制非特异性相互作用而构建特异性识别位点,以诱发细胞和组织响应。一种策略是通过表面改性,提高生物材料表面性能,创造惰性表面,如材料表面接枝聚氧化乙烯(PEO)；另一种策略是优化提升生物材料与细胞的特异性相互作用,可在材料表面引入化学信使,使其和细胞膜表面的相应受体形成配合物,实现分子的特异性识别。组织工程中将多肽固定在生物材料表面,制成受体专门性材料,可促进受体介导的细胞对材料的黏附来提高其生物相容性,促进细胞黏附、扩展和细胞骨架的形成,实验证明RGD 多肽修饰的材料能显著增加细胞运动的持续时间。3 材料表面的拓扑结构生物材料表面的拓扑结构无论在生物相容性还是在人工ECM 中都起着重要作用。小到原子、分子、细胞,大到组织,它们的空间结构构建都遵循着应力平衡原则。也就是说,细胞通过自身协调胞体内张力和压力的分布和平衡达到总体力学平衡。因此,人工ECM 的拓扑结构直接改变表面的应力分布, 从而改变细胞的形态。研究表明,不同细胞在具有不同粗糙度的材料表面的黏附行为有很大差异。而Kieswetter 等运用扫描电镜观察成骨细胞在不同粗糙度生物材料表面的形态证实,细胞在光滑、平整的材料表面较粗糙的材料表面上更容易伸展成连续的细胞层。4 生物材料表面的亲水/ 疏水平衡材料表面的亲/ 疏水平衡是调节蛋白质吸附、影响细胞黏附的一个重要因素。一般讲,亲水性表面对细胞黏附有促进作用,疏水性表面对蛋白质的吸附功能较强。蛋白质与生物材料表面接触和吸附过程中,常伴随水/ 蛋白质的吸附交换,而异种蛋白质间的吸附交换常有Vroman 效应产生。细胞与材料间的黏附是以蛋白质为介导而发生的,过于良好的亲水性表面不利于蛋白质的吸附,因此适宜细胞黏附、生长的表面有一最佳的亲水/ 疏水平衡值,此值因不同种类细胞而异。5 生物材料的表面能大量体外实验证明,细胞的黏附、增殖直接和与之接触的材料表面生物特异性相关,基材的表面能量影响哺乳动物细胞的粘连。一般认为,能量较高的表面较能量较低的表面更有助于促进细胞在生物材料表面的黏附,这主要是由于材料的表面能会影响到血清中的蛋白质在材料表面的吸附,进而介导细胞的粘连【62】。同时,材料表面的粗糙度与材料的表面能大小具有密切关系,随着表面粗糙度的提高,材料表面非极性组分的表面能显著增大。Satriano 等采用52keV 氩离子束照射聚羟基甲基硅氧烷和聚对苯二甲酸乙二酯,优化了基体材料的表面自由能参数,促进了人真皮成纤维细胞在改性材料上的黏附和增殖。6 生物材料的表面电荷哺乳动物细胞膜表面荷负电,一般讲,荷正电的材料表面与荷负电的细胞由于静电吸附而利于细胞黏附,荷负电的材料表面与荷负电的细胞由于静电排斥,不利于细胞黏附。研究表明,血清中的蛋白质在材料表面的正电荷区和负电荷区的吸附行为差异很大,在正电荷区吸附的玻连蛋白对细胞的粘连具有积极影响,因此,材料表面正电荷区吸附玻连蛋白对骨样细胞的黏附、铺展及迁移至关重要。通过固定含有丰富带正电基团的氨基酸(如赖氨酸) 在材料表面,可以提高材料的表面电荷浓度,增加黏附细胞的数量和增强细胞的黏附力。7 生物材料表面的化学基团聚合物材料表面的化学结构是影响细胞的黏附、生长的另一重要因素。一般认为,砜基、硫醚、醚键等对细胞生长影响不大;刚性结构如芳香聚醚类不利于细胞黏附;羧基、磺酸基、胺基、亚胺基及酰胺基等基团则可促进细胞的黏附和增殖。由于磺酸基能模拟肝素的生理活性而显示出较好的促进细胞黏附和生长的性质。含氮基团不仅能使材料表面带一定的正电荷(胺的阳离子化) ,调节表面的亲/疏水性,而且可以与蛋白质肽链发生功能团间的相互作用, 能促进细胞黏附。材料表面如果具有可供反应的化学基团,可与配基共价连接,固定一些生物活性分子在材料表面,如细胞黏附因子等,从而促进细胞的黏附。这已成为材料表面修饰促进细胞黏附的一个重要措施。11.2.2 生物材料表面修饰的理化方法【6364】生物材料表面的理化性质对材料的组织相容性有着重要影响。因而对材料表面进行改性,在保持材料物理、力学性能的前提下引入可促进细胞黏附、生长的生物活性分子,可显著改善材料的细胞相容性。表面修饰是指在不改变材料本体性能的前提下,赋予其表面新的性能。组织工程用生物材料作为植入材料,使用时主要考虑其生物相容性,即材料表面与宿主间界面上的相互作用,因此对植入材料的改性主要是对其表面的修饰。目前,高分子生物材料的表面修饰大致有如下几条途径:1 物理包被法通过一个能连续循环浸渍的装置,将溶液中的化学成分通过物理吸附力(范德华力、静电作用、亲/ 疏水相互作用等) 的作用引入生物材料最外层表面。该法简易可行。吸附不牢固、易脱落,是其一大缺点。在对吸附质量要求不高的领域,仍有其一定的应用价值。Yang 等物理包被RGD 多肽修饰聚乳酸赖氨酸( PLAPLL) 三维支架材料,体外培养骨细胞,发现骨细胞迁移、扩增和分化良好。2 物理截留法( entrapment)溶胀是高聚物特有的现象。控制溶剂相和非溶剂相(如水) 比例,可以使高聚物表面溶胀而不溶解,原本紧密缠绕着的分子链处于相对松弛状态。加入改性组分(常溶解在非溶剂相中) ,其链段通过分子运动可进入高聚物表面链段之间。然后用非溶剂相浸泡,使高聚物表面链段收缩,溶胀现象消失。改性组分分子链段与高聚物分子链相互缠结,形成表面互穿网络结构,从而达到固定的目的。与其它方法相比,截留法具有独特的优势,它几乎在所有化学实验室就可进行,工艺简单,效果颇佳。Zhu 等先将聚乳酸(PLA) 膜浸泡在溶解了海藻酸钠和氨基酸衍生物接枝产物的水/ 丙酮( V (水) / V (丙酮) = 70/ 30) 溶液中,再转移到CaCl2 溶液中,在PDLLA 表面形成不溶于水的凝胶网络结构。培养软骨细胞后发现,细胞的黏附、增殖和活性明显提高。3 表面化学接枝法在聚合物表面接枝带有对细胞的黏附和生长具有促进作用的功能基团,是实施生物材料表面改性的另一途径。将生物活性分子中的某些基团与基质表面的反应性基团化学键合,使其牢固地固定在生物材料表面是获得长期组织相容性的有效方法。它克服了物理吸附中生物活性分子不能长期作用于材料表面、易脱落的缺点。大量的研究集中在材料表面接枝亲水性单体,以改善材料表面的亲水性,提高其细胞亲和力。因此,通过表面改性使材料表面具有这些基团是固定化的前提。对于生物活性分子的化学键合,研究者们更注重于材料的表面设计,即根据生物活性物质特点设计可与其反应的表面基团。表面化学接枝一般仅限于材料表面发生的非均相反应。为达到只在表面层进行选择性接枝,必须控制自由基的数量和浓度及单体的扩散与渗透仅限于表面层发生。生物材料的表面接枝通常分两步进行:聚合物表面活化及活化基团与蛋白质的反应。可通过两种方法实现: 通过偶联的方法将一种聚合物接枝到另一聚合物表面; 将带反应性功能团单体通过聚合反应接枝到聚合物表面。偶合接枝是一种简单可行的方法,化学键共价固定生物分子通常以双官能团交联剂为中介,交联剂的一端通过COOH、OH、NH2 等官能团连接在基体材料表面,另一端有一可变的悬吊基团用于结合单体分子。要求材料表面及要偶合接枝上去的单体两者都有可能发生偶合的官能团,否则要设法引入活性官能团。Klee 等将单体4氨基二聚对二甲苯邻甲酸650 减压条件下化学蒸气沉积,18 下浓缩在聚偏二氟乙烯(PVDF) 表面,环己二异氰酸酯(HDI) 活化表面氨基,接枝上纤连蛋白(FN) ,培养成骨细胞,发现细胞的增殖能力大大提高。Cui 等采用氢氧化钠溶液表面水解聚乳酸(PLA) ,水溶性碳二亚胺(EDC/ NHS) 活化表面羧基,共价键合壳聚糖(CS) 分子,提高了材料表面的亲和性,在其表面培养牛软骨细胞,发现细胞活性和增殖率均比未改性PLLA 显著提高。Ito等【65】在表面水解的聚甲基异丁烯酸表面固定胰岛素或表皮生长因子(EGF) , 结果发现改性后的表面促进了细胞的生长。不仅固定的生物信号分子具有活性, 而且其活性比游离的生物信号分子更高, 如固定的胰岛素的促有丝分裂作用比天然的胰岛素更强。这可能是因为固定的胰岛素抑制了由于细胞内在化引起的下调作用, 因此它的作用时间更长。4 高能辐射法高分子材料表面辐射改性的放射线源有射线(60Co) 、射线(85 Kr) 、射线(210 Po) 及X 射线和电子射线等。由于放射线能量比化学键能高,利用它照射材料表面后,聚合物表面经离子化,激发产生自由基,自由基与单体接枝聚合,达到改性目的。辐射接枝是由射线引发,不需要向体系添加引发剂,与化学接枝相比,可得到非常纯的接枝聚合物,是改性医用高分子的有效方法。Kwon 等采用预辐射接枝技术,将甲基丙烯酸环氧丙酯(EPMA) 接枝到聚丙烯(PP) 表面,引入磷酸官能团并且在表面固定肝磷脂,实验表明黏附血小板数量减少,血栓形成降低,提高了材料的血液相容性。高能辐照会改变材料表面微观结构,导致拓扑形貌、湿润性和生物相容性的变化。Mirzadeh 等采用CO2 和KrF 受激准分子脉冲激光束照射聚对苯二甲酸乙二酯(PET) 表面,发现表面形貌变化较大,体外培养L929 成纤维细胞,细胞黏附和扩展能力有所提高。5 光化学法光化学法利用紫外线或可见光照射产生一系列光化