葡枝根霉木聚糖酶酶学性质的初步研究本科毕业设计(论文)开题报告.doc

安徽工程大学毕业设计（论文）毕业设计（论文）材料之二（2）本科毕业设计(论文)开题报告题目：葡枝根霉木聚糖酶酶学性质的初步研究 课 题 类 型： 设计 实验研究 论文 学 生 姓 名： 邹军 学 号： 3112106128 专 业 班 级： 生物工程2111学 院： 机电学院指 导 教 师： 张庆庆（教授）开 题 时 间： 2015年3月 日2015年 3月 日开题报告内容与要求一、本课题的研究意义、研究现状和发展趋势（文献综述）二、研究方案及工作计划（含工作重点与难点及拟采用的途径）三、阅读的主要参考文献（不少于10篇，期刊类文献不少于7篇，应有一定数量的外文文献，至少附一篇引用的外文文献（3个页面以上）及其译文）四、指导教师意见（签名）2015年3月 日第1章 研究内容及研究意义1.1 研究意义木聚糖（xylan）存在于各种陆生植物的几乎所有部位，是植物细胞壁的主要成分之一，占植物碳水化合物总量的三分之一，在自然界中含量仅次于纤维素。木聚糖是一种杂合多聚分子，主链由多个吡喃木糖基通过-1，4-糖苷键相连，侧链上连着多种不同的取代基：O-乙酞基、4-O-甲基-D-葡萄糖醛酸残基、L-阿拉伯糖残基等。这些侧链与植物细胞中其他几种结构性多糖（如木质素、纤维素、果胶、葡聚糖等）以共价或非共价键连接，组成细胞重要的结构-细胞壁。木聚糖主要存在于次生细胞壁中，处于木质素及其他多聚糖之间，起着连接作用。也正是由于这些侧链的不同，使得木聚糖的结构变化范围很大。自然界中的木聚糖多为异聚多糖，主链和侧链糖基上有多种取代基团，主要是乙酰基、葡萄糖醛酰基和阿拉伯糖酰基，可进一步与香豆酸、阿魏酸等酚酸相连，使得木聚糖以共价键与木质素相连。木聚糖同其他碳水化合物的结合除通过化学键连接之外，还可能通过其他相互作用如氢键等相互连接。同型木聚多糖分布很少，仅见于茅草、烟草和某些种子的外壳中。一般将木聚糖分为硬木（针叶）木聚糖和软木（阔叶）木聚糖两种。硬木木聚糖由O-乙酰-4-O-甲基葡萄糖醛县木糖聚合而成，含70个以上的吡喃型木糖残基，以-1，4-葡萄糖苷键相连，聚合度（degree of polymerization,DP;多聚物中所含单体数）为150-200.每隔10个木糖残基就有1个4-O-甲基葡萄糖酰酸基团位于C2位。硬木木聚糖高度乙酰化，每2mol木糖残基就含有1mol的乙酰基，乙酰基团的存在与木聚糖的部分溶解性有关。通常情况下，乙酰化主要发生在木糖残基的C3位上，在C2位取代的情况很少，也有两个位置均被乙酰化的，三者之间的比例为4:2:1:2:2:1或3：3：1。在提取木聚糖的过程中，乙酰基团能够在C2位和C3位之间转移，在碱性抽提条件下很容易被除去。木聚糖是半纤维素（地球上位居第二的可再生资源）的一种，主要存在于植物体内，将木质素和纤维素连接起来起到了稳定植物组织结构的重要作用!同时，木聚糖也是除纤维素以外的自然界中最为丰富的多糖，结构十分复杂，单体为ZU木糖，主链和侧链上都连接有大小不同的取代基团!在化石能源越来越紧缺环境污染越来越严重的。当代，科研工作者们广泛关注可再生资源的合理利用，因此，木聚糖的充分利用吸引了很多眼球，但因为木聚糖化学结构的复杂性，要想完全将木聚糖降解必须借助于一套复杂的,具有不同功能和作用方式的水解酶系!这一套负载的木聚糖降解酶系主要有-1.4-内切木聚糖酶,-1.4-木 糖苷酶,麹呋喃阿拉伯糖苷酶,葡萄糖醛酸酶和乙酰木聚糖酯酶等，研究表明这些完整的酶系在微生物中广泛存在-1.4-内切木聚糖酶是木聚糖水解过程中最要的一种酶类，其特异性作用于木聚糖主链上的-1.4-D-木糖苷键的糖苷键，将木聚糖彻底水解为木糖,木二糖及木二糖以上的木寡糖。第2章 研究现状和发展趋势2.1匍枝根霉概述匍枝根霉（拉丁名：Rhizopus stolonifer）亦称黑面包霉，是一种常见的霉菌，由土壤或空气中都很容易分离得到，是接合菌纲、毛霉目、毛霉科、匍枝根霉属。它即是根霉属中具代表性的种类。这属真菌的特征是具有细长菌丝，不分隔，呈多核狀态。无性生殖藉形成孢子繁殖，有性生殖则形成厚壁之接合孢子。分布很广，全世界均可见，长在各种有机物上，除面包、馒头、米饭等淀粉质外，也常长在甜熟的水果上。最常见的是匍枝根霉(R. stolonifer (Ehrenb.ex Fr.)Vuill)，又称黑根霉、面包霉。 多生于面包、馒头和富含淀粉质的食物上，使食物腐烂变质。黑根霉由分枝、不具横隔的白色菌丝组成。在基质表面横生的菌丝叫匍匐菌丝，匍匐菌丝膨大的地方向下生出假根，伸入基质中以吸取营养；向上生出数条直立的孢子囊梗，其顶端膨大形成孢子囊。孢子囊内形成具多核的孢囊孢子。孢子囊成熟后破裂，黑色的孢子散出落于基质上，在适宜的条件下，即可萌发成新的菌丝体。本菌种之生长适温可由2030，而以2530为最佳。菌丛于25下，在PDA（马铃薯培养基）上生长快速，3天即长满整个培养皿，起先白色，后变灰白色，一个月以后则呈黑褐色。反面起先白色，后变灰白色。匍匐茎起先白色，后变褐色。假根分枝多，发育良好。孢子囊柄直立，不分枝，起初白色，后变褐色，1-5枝丛生成一簇，长在假根对侧，9002700微米（m）长，直径2232微米，无分隔，细胞壁平滑。孢子囊圆形，直径173-235微米，未成熟时白色，成熟后黑色，孢子囊壁平滑，成熟时溶解。中轴圆形，直径153-163微米，当孢子散出后，中轴多数下陷成半圆形。孢子多数橄榄型或有稜角，表面有沟纹，灰色，7.5-9.64.3-7.5微米。雌雄异株，其接合孢子，为黑色而有厚壁，亚球形，直径140-180微米，成熟时黑色，上有疣状突起。木聚糖水解酶系(xylanolyticenzymesystems)是一类降解木聚糖的酶系，包括-1,4-内切木聚糖酶、-木糖苷酶、-L-阿拉伯糖苷酶、-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤维素。在木聚糖水解酶系中，-1,4-内切木聚糖酶是最关键的水解酶，它通过水解木聚糖分子的-1,4-糖苷键，将木聚糖水解为小寡糖和木二糖等低聚木糖，以及少量的木糖和阿拉伯糖。-木糖苷酶通过水解低聚木糖的末端来催化释放木糖残基。另外，参与彻底降解木聚糖的还有-L-阿拉伯呋喃糖苷酶、-葡萄糖醛酸苷酶、乙酰木聚糖酯酶，以及能降解木聚糖中阿拉伯糖侧链残基与酚酸(如阿魏酸或香豆酸)形成的酯键的酚酸酯酶等侧链水解酶，它们作用于木糖与侧链取代基之问的糖苷键，协同主链水解酶的作用，最终将木聚糖转化为它的组成单糖。2.2 研究现状饲料工业是较早应用木聚糖酶的领域。小麦、大麦、黑麦、燕麦等麦类饲料中含有大量的木聚糖,木聚糖具有较强的持水性、小分子吸附活性和表面活性,造成麦类基础饲料对单胃或无胃动物具有强烈的抗营养作用。木聚糖酶作为饲料添加剂使用,可以有效解除木聚糖的抗营养作用。木聚糖酶可以破碎植物细胞壁,提高养分利用率。饲料中添加木聚糖酶可以把聚合度较高的木聚糖降解为聚合度较低的小分子片段,破坏细胞壁的结构,将细胞壁束缚的营养物质释放出来,和动物消化道内的消化酶充分接触,从而提高各种养分的消化率。木聚糖酶可以降低食糜粘度,提高表观代谢能。澳大利亚和欧美的动物营养学家指出,木聚糖酶的主要作用机制是降低消化道食糜粘度。木聚糖在降解时需要多种酶协同作用才能完成，主要包括以下几种类型的酶：1) 内切-1，4-D-木聚糖酶（endo-1，4-D-xylanase）EC 3.2.1.8，又称木聚糖酶，降解木聚糖后生成木二糖和木三糖等寡糖，主要水解产物为低聚木糖和少量木糖。内切-1，4-D-木聚糖酶作为木聚糖酶系中最重要的酶，主要用来降解木聚糖主链糖苷键，它也是目前木聚糖酶研究的重点；2) -D-木糖苷酶（-D-xylosidases）EC 3.2.1.37，是一种外切酶，它主要对寡聚木糖的还原端起作用，降解并生成木糖；3) -L-呋喃阿拉伯糖苷酶-(L-arabinofuranosidases)，分为两种类型，一种是外切型的-L-呋喃阿拉伯糖苷酶EC3.2.1.55，作用于-硝基酚-呋喃型阿拉伯糖苷或者分支阿拉伯聚糖；另一种是内切-1,5-L-阿拉伯聚糖酶EC 3.2.1.99，只对阿拉伯聚糖侧链有活性；4) -D-葡萄糖醛酸苷酶(-D-glucuronidases)EC3.2.239，主要作用于4-O-甲基葡萄糖醛酸与木糖之间的-1,2-糖苷键，在木聚糖降解过程中与木聚糖酶相互促进，促进低聚木糖的产生；5) 乙酰木聚糖酯酶(acetylxylan esterases)EC 3.2.72，作用于木糖残基的C-2和C-3位上的乙酰基；6) 酚酸酯酶(phenol aid esterases)主要包括阿魏酸酯酶(furulic acid esterases )EC 3.2.73和香豆酸酯酶(p-coumaric acid esterases) EC 3.2.-，前者可切除阿魏酸与阿拉伯糖残基之间的酯键，后者则主要作用于香豆酸和阿拉伯糖残基之间的酯键。 通常所说的木聚糖酶即内切-1，4-D-木聚糖酶，它主要负责木聚糖主链骨架的降解，是木聚糖降解酶系中最关键的酶，也是当前木聚糖酶研究的重点。414近来，国内外学者对木聚糖酶活力测定的主要研究为：1) 在传统方法的基础上，对木聚糖酶酶活测定方法进行改进，并在一定的条件下对各种方法进行比较；2) 研究木聚糖酶活测定条件；3) 研究测定木聚糖酶单一酶活力和总酶活力；4) 研究影响木聚糖酶活测定的因素及空白试验对木聚糖酶活测定的影响；5) 研究测定不同酶源的木聚糖酶活力；通过基因工程和蛋白质工程改良木聚糖酶的性质, 研制出符合不同应用领域要求的木聚糖酶产品。影响木聚糖酶活性因素的研究 王丹丹等10利用正交实验法研究了Pichia pastoris G12（毕赤酵母）在摇瓶发酵条件下产木聚糖的表达规律，发现pH、接种时间、甲醇体积分数、诱导时间等因素对酶活力具有显著的影响。研究表明在pH5.5时酶活力随pH的增大而增大且在pH=5.5时达到最大值，pH超过5.5时酶活力开始降低并趋于稳定。将菌种接种于发酵培养基中观察时间对酶活的影响，发现酶活力从11h起开始升高并在19h时达到最高，之后又下降。在发酵培养基接种前分别按一定比例加入甲醇观察甲醇体积分数的大小对酶活力的影响，得出在甲醇分数低于1.50%时酶活力随体积分数增加而增加，并在1.50%时达到最高值，高于1.50%时酶活力逐渐下降。王丹丹等人还研究了甲醇诱导时间对产酶活力的影响得出在诱导前期酶活力呈现出对数上升趋势，在120h后开始趋于平缓，在168h达到最高酶活力水平，之后开始出现下降的趋势。2.3 发展趋势 中国木聚糖酶行业发展趋势分析与预测报告依托多年对木聚糖酶行业的研究，结合木聚糖酶行业历年供需关系变化规律，立足国内市场，兼顾全球市场环境，对木聚糖酶行业内企业群体进行了深入的调查与研究。同时，中国木聚糖酶行业发展趋势分析与预测报告也针对木聚糖酶行业及其上下游行业的特点，从不同角度切入行业，为木聚糖酶行业企业提供了强大的数据支持与专业级的市场导向。并为企业制定发展战略、进行投资决策和企业经营管理提供权威、充分、可靠的决策参考。中国木聚糖酶行业发展趋势分析与预测报告侧重官方统计数据，采用定量及定性的科学研究方法撰写而成。因此，在对木聚糖酶活力及性质进行描述时，必须清楚注明测定条件中所有参数，不同研究所获得的结果进行比较时，应避免与采用不同底物、不同条件或不同测定方法所得的结果进行比较。同时，还应在测定过程中对所用方法和测定条件进行严格限定，力求准确、全面地反映木聚糖酶的性质及作用机制。 第3章 研究方案及工作计划3.1. 试验主要内容 3.1.1 培养基的配置及各种试剂的配置配制PDA固体培养基，以及种子培养基和发酵培养基，并采用高压蒸汽灭菌锅进行灭菌（121，20min）。 3.1.2葡枝根霉的培养及其形态的观察（1） 将葡枝根霉菌丝接种在液体培养基，待长出菌种后，取菌丝在显微镜下观察葡枝根霉的形状；（2） 涂平板观察菌落形态；（3） 接种斜面作为保藏用。 3.1.3 木聚糖酶活力的测定51） 配置DNS试剂及木糖标准曲线的绘制；2） 取匍枝根霉发酵培养后的固态培养物制备粗酶液；3） 采用DNS法测定木聚糖酶活力；4） 酶活力定义：在规定条件下，每分钟分解木聚糖产生1umol木糖所需要的木聚糖酶量为1个单位酶活力（U）。3.2. 实验重点与难点 （1）葡枝根霉极易染菌；防止染菌是本实验的重点难点问题，在接种和倒平板的过程中要注意无菌操作，液体培养要讲瓶口扎紧，接种后放到培养箱中培养。（2） 配置适宜葡枝根霉发酵生产木聚糖酶的最佳培养基组成，并对条件进行优化，并测定其酶活；3.3. 实验结果 3.3.1 做好实验前期的准备工作（1）实验之前查找、阅读文献，做好相关准备工作（2）培养基的配制及灭菌，实验相关仪器及试剂的准备 3.3.2 实验成果（1）实验过程中相关实验记录及实验之后的数据处理。（2）实验之后，将相关数据转化成图表的形式记录。 3.3.3 实验总结（1）通过实验，了解、熟悉培养基的配制及灭菌的流程。（2）学习实验室中各种仪器设备的使用，达到熟练使用的目的。（3）熟练掌握微生物的接种、培养，以及通过染色观察其形态（4）学习并掌握微葡枝根霉活性的最佳测定。 3.4 工作计划第01周3月2日-3月8日查文献并阅读文献，英文翻译及准备工作第02-03周3月9日-3月22日翻译外文文献及准备工作，熟悉实验主要内容。绘制木糖标准曲线第04周3月23日-3月29日完成开题报告第05周3月30日-4月5日完成实验初期的准备工作，熟悉微生物培养的各个操作第06-07周4月6日-4月20日测定相应酶活曲线第08-09周4月21日-5月5日确定葡枝根霉木聚糖酶活最佳条件第10-11周5月6日-5月20日对酶活的酶促反应时间、酶促反应温度、pH三个影响因素进行了研究第12-13周5月21日-5月25日底物酶活的酶促反应时间、酶促反应温度、pH三个影响因素进行了研究第14-15周5月26日-6月08日整理数据，得出结论、查缺补漏，及撰写毕业论文第16-17周6月09日-6月22日提交论文初稿，准备答辩主要参考文献1方洛云，邹晓庭，许梓荣木聚糖酶基冈的分子生物学与基因工程J中国饲料，2002, (7): 11-14.2 李雄彪，张金忠半纤维素的化学结构和生理功能植物学通报，1994, 1l(1): 27-33.3 木聚糖酶 1234 基因序列分析及表达载体构建。常桂英，王俊玲，徐亚维，杨 闯，刘盼想( 吉林农业科技学院生物工程学院，吉林大学分子酶学工程教育部重点实验室，吉林长春) 4 谢建华，李小明，罗文华。高