牛病毒性腹泻病毒的检测反转录聚合酶链反应法（RT-PCR）编制说明.doc

广西地方标准牛病毒性腹泻病毒的检测 反转录聚合酶链反应法（RT-PCR）（征求意见稿）编制说明1 项目背景和意义牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是引起牛（水牛、黄牛和奶牛等）的病毒性腹泻疾病重要病原体，是导致集约化牛场严重亏损的重要原因。BVDV造成牛腹泻、生产性能下降、繁殖障碍、持续感染等，发病率为2%50%，腹泻导致的黏膜病致死率几乎为100%，已经严重阻碍养牛业的发展，但目前我国对BVDV还没有很好的防控措施。在养牛业中这种病毒的感染常有发生，不但给它们之间的鉴别诊断和有效防治增加困难，也给养牛业造成了严重的经济损失。广西养牛业发展十分迅速，拥有占全国第5位的牛存栏量，其中水牛存栏数达438万头，占全国水牛总数的/，居全国之首，世界第二位，但在检测和防治BVDV方面十分薄弱，由此给广西造成严重的经济损失。因此开展牛病毒性腹泻病毒快速检测技术的研究势在必行。快速准确地检测BVDV是有效防制该病的前提，而仅依靠临床症状和病理变化不能对该病确诊，传统的病原分离和血清学方法不仅操作繁琐费时，而且其特异性差、敏感性低，无法对BVDV感染进行快速准确地鉴别诊断，已不适应现代集约化养牛业发展的需要。PCR病原检测方法具有特异性强、敏感度高、诊断快速等传统诊断方法所无法比拟的优点，在发达国家已被广泛应用于动物疫病的诊断中。广西兽医研究所在国际上率先研究建立的BVDV RT-PCR检测技术，其特异性强、敏感性高。既可以对分离培养物的BVDV RNA进行检测, 也可以对直接从临床样品中取样抽提的BVDV RNA进行检测，而且整个操作过程不超过8小时。为了使这一先进的病原检测技术能更好地为生产服务，特制定本技术操作标准。这一标准的制定，对现代养牛业中BVDV的有效防制及海关检疫都将具有十分重要的实用意义。2 项目来源本标准是根据广西壮族自治区质量技术监督局下达文件关于下达2010年第二批广西地方标准制订项目的通知（桂质监函2010342号）附件的编写任务通知，由广西壮族自治区兽医研究所承担。广西兽医所内“牛病毒性腹泻病毒的检测反转录聚合酶链反应法(RT-PCR)操作规程”编写小组，按中华人民共和国国家标准GB/T1.1 2000标准化工作导则第1部分“标准的结构和编写规则”的要求组织编写的。计划于2011年完成。3 编制过程为了方便广大使用人员，满足我区养牛生产发展需要，进一步加强动物检疫手段标准化，顺应我国加入WTO后与国际接轨的形势。现在有关部门的大力支持下，由广西壮族自治区水产畜牧局提出，广西壮族自治区兽医研究所按照标准研制要求和编写工作的程序，及时组成了由单位专家和专业技术人员参加的编写小组，制定了编写方案，并就编写工作进行了任务分工。编制小组根据任务分工进行了资料收集和调查研究工作。一方面，去南宁、柳州、来宾等广西养牛业发展较快的地区及相关牛场企业进行考察和调研，实地进行检疫，了解BVDV的发病症状，传播途径等流行病学调查。二是查阅相关聚合酶链式反应法的技术要领，分析BVDV保守序列5端非编码区，并设计引物，上网比对，制定BVDV RT-PCR标准操作规程。广西壮族自治区兽医研究所组织编写，力争通过广泛征求国内有关大专院校、研究所著名专家、学者的意见后，形成推荐性地方标准。科学是迅速发展的，本规程也必将随着科技进步和生产水平的提高不断修改补充。由于时间仓促，水平有限，不妥及不足之处在所难免，恳请各位专家、学者提出宝贵的修改意见。4 标准的编制原则及标准项目和主要技术内容4.1 编制原则本标准的编制主要遵循以下原则：一是科学性原则。在尊重科学、亲身实践、调查研究及广泛征求意见的基础上，根据BVDV保守序列5端非编码区，并设计引物，上网比对，制定BVDV RT-PCR标准操作规程。二是可操作性原则。本标准无论是从样品采集，处理，RNA抽提，均操作简单，仅需8小时既可完成。实验仪器仅需一台PCR仪和离心机。具有可操作性和实用性。三是协调性原则。以切实提高我区养牛业过程中病腹泻病防治的技术水平为核心，符合我国现行有关法律、法规和相关的标准要求。4.2主要技术内容本标准根据广西壮族自治区兽医研究所反转录聚合酶链反应(RT-PCR)和核酸探针检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的研究项目所取得的成果，针对牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的5端非编码区保守序列，设计了一对特异性引物，优化建立可以快速检测BVDV的 RT-PCR，并对其特异性和敏感性进行了测定。结果表明，该RT-PCR可检测出不同基因型的BVDV，而对其它牛病病原的检测结果为阴性；其最低可检测出1pg的BVDV RNA。5 本规程的一些有关说明本规程在“4 操作方法”的“4.1 待检样品的准备”中给出了3种不同材料的准备方法。其中：4.1.1和4.1.2给出了从临床样品直接取样进行病原核酸抽提的材料准备方法；4.1.3给出了从病原分离培养物中取样进行病原核酸抽提的材料准备方法。在操作时可根据具体情况选择其中一种或多种方法进行。因本技术直接针对病原基因进行检测，敏感性非常高，所以在操作过程中要特别注意，避免样品之间交叉污染而出现的假阳性结果。另外，RNA酶在环境中无处不在，抽提好的待检RNA在保存过程中极易降解，会由此而导致假阴性结果。因此