实验一制霉菌素发酵、提取与效价测定.doc

实验一 制霉菌素发酵、提取与效价测定1. 实验目的与要求(1) 了解抗生素发酵的一般过程及发酵过程中一些重要理化指标检测方法；(2) 学习抗生素（制霉菌素）的提取纯化工艺；(3) 了解制霉菌素化学效价测定的原理；(4) 掌握抗生素生物效价测定的常规方法管碟法的原理与操作。2. 实验原理2.1制霉菌素制霉菌素(nystatin, mycostatin or fungicidin)是由诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei)产生的一种多烯大环内酯类(polyene macrolides) 抗真菌抗生素。此类抗生素的结构特点是在分子中既有经内酯化作用而闭合的大碳环，又有一系列的共轭双键。制霉菌素存在于菌丝体中，其纯品为淡黄色微细晶体；不溶于水、氯仿和丙酮等；稍溶于低级醇等；溶于吡啶、冰醋酸和NaOH溶液，但均能使其破坏而失效；对较高和较低的pH以及光和热均不稳定。临床上使用的制霉菌素，其主要成分为制霉菌素A1，化学结构式如下图所示：它的氨基糖部分是氨基海藻糖，即3-氨基-3,6-二脱氧-D-吡喃甘露糖，非糖部分为38员的多烯大环内酯。制霉菌素对各种真菌如白色念珠菌、隐球菌、荚膜组织胞浆菌及球孢子菌等有抑制作用。主要用于白色念珠菌感染，如消化道念珠菌病、鹅口疮、念珠菌性阴道炎及外阴炎等。但口服治疗全身性真菌感染或深部真菌感染则无效。制霉菌素的作用机理是与真菌细胞膜上的特异甾醇相结合，导致原生质膜破坏，通透性改变，以致重要的细胞内容物外漏而死亡，从而杀灭真菌。由于细菌原生质膜上不含甾醇，故本品对细菌无效；对肠道正常菌丛也无作用。2.2 抗生素发酵生产工艺简介抗生素液体发酵共分为三大工序：菌种、发酵和提取。配合三个工序进行分析化验和有关产物测定。具体而言，其过程为菌种孢子制备种子制备发酵发酵液预处理提取与精制成品包装。菌种一般采用液氮超低温保藏或沙土管保藏。一般生产用菌种经多次转接往往会发生变异而退化，故必须经常进行菌种选育和纯化，以提高其生产能力。生产用的菌株须经纯化和生产能力的检验，若符合规定，才能用来制备种子。制备孢子时，将保藏的处于休眠状态的孢子，经过严格的无菌程续，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养基上，在一定条件下培养至孢子量符合生产需要，必要时可用大茄子瓶在固体培养基上扩大培养。种子制备的目的是使孢子发芽、繁殖，以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中。种子制备可用摇瓶培养后再接入种子罐进行逐级扩大培养；或直接将孢子接入种子罐后就、逐级放大培养。种子扩大培养级数的多少，决定于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。扩大培养级数通常为二级。发酵过程的目的是使微生物大量分泌抗生素。发酵接种量一般为10%或10%以上，发酵周期视抗生素品种和发酵工艺而定。发酵期间，每隔一定时间应取样进行生化分析、镜检和无菌检验。分析或控制的参数有菌丝形态和浓度、残糖量、氨基氮、抗生素含量、溶解氧、pH、通气量、搅拌转速和液面控制等。发酵液的过滤和预处理的目的不仅在于分离菌丝，还需将一些杂质除去。尽管对多数抗生素品种在生产过程中，当发酵结束时，抗生素存在于发酵液中，但也有个别品种当发酵结束时抗生素大量存在于菌丝之中，在此情况下，发酵液预处理目的包括使抗生素从菌丝中析出转入发酵液或使菌丝体与发酵液分离。提取的目的是从发酵液（和/或菌丝体）中制取高纯度的、符合药典规定的抗生素成品。在发酵液中抗生素浓度很低，而杂质的浓度相对较高。杂质中含有无机盐、残糖、脂肪、各种蛋白质及其降解物、色素、热源质或有毒性物质等。此外还可能有一些杂质，其性质和抗生素很相似，这就增加了提取和精制的困难。由于多数抗生素不很稳定，且发酵液易被污染，故整个提取过程要求：时间短、温度低、pH宜选择对抗生素较稳定的范围、勤清洗消毒。目前常用的抗生素提取方法有溶媒萃取法、离子交换法和沉淀法等。精制是抗生素生产的最后步骤，对产品精制、烘干和包装的阶段要符合“药品生产管理规范”（即GMP）的规定。抗生素精制可选用的步骤有：脱色和去热源质、结晶和重结晶、共沸蒸馏法、柱层析法、盐析法、中间盐转移法和分子筛等。2.3 抗生素的效价与测定通常用效价来衡量抗生素发酵液中抗生素含量。抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。生物效价测定法有稀释法、比浊法和扩散法三大类。管碟法是扩散法的一种，是最常用的测定抗生素效价的方法。据此，效价即可视为用抗菌效力表示的抗生素的有效含量。管碟法就是在接种有敏感实验菌的琼脂平板上放上牛津杯，然后向杯内加满抗生素溶液，保温培养一定时间后，抗生素渗透到一定的范围，抑制敏感菌的生长，产生透明圈。抑菌圈的半径与抗生素在管中的总量（单位）、抗生素的扩散系数（cm2/h）、扩散时间（即抗生素溶液注入牛津杯至出现抑菌圈所需的时间）、培养基的厚度(mm)和最低抑菌浓度(U/mL)等有关。抗生素总量的对数和抑菌圈直径的平方呈直线关系。因此，抗生素的效价可以由抑菌圈的大小来衡量。将已知效价的制霉菌素标准液制成标准曲线，比较已知效价标准液与未知效价的被检溶液的抑菌圈的大小，就可算出样品中抗生素的效价。3. 实验材料3.1 菌种诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei ) A-94：制霉菌素产生菌；黑曲霉（Aspergillus niger）：制霉菌素敏感菌。3.2 培养基（1）孢子斜面培养基：牛肉膏0.28%，饴糖3.5%，蛋白胨0.4%，琼脂2.0%，pH7.5，121 灭菌30min，制成斜面。37培养2d证明无菌后继续在37放置直至斜面冷凝水干后取出备用。（可用PDA培养基代替）（2）肉汤培养基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，牛肉膏0.6%，NaCl0.5%，pH7.2，每升培养基加1%酚红溶液0.3mL，121灭菌30min，经37培养2d证明无菌备用。（种子瓶无菌检查用）（3）细菌琼脂斜面培养基：葡萄糖1%，蛋白胨1%，牛肉膏0.6%，NaCl0.5%，琼脂2%，pH7.2，121灭菌30min，经37培养2d证明无菌备用。（种子瓶无菌检查用）（4）液体种子培养基：淀粉1%，葡萄糖1%，花生饼粉2%，蛋白胨0.2%，豆油0.3%，MgSO4.7H2O0.05%，CaCO30.6%，(NH4)2SO40.2%，KH2PO40.02%，pH7.2，121灭菌20min，28时接种。250mL三角瓶分装50mL。（5）液体发酵培养基：葡萄糖5.5%，黄豆饼粉2.5%，蚕蛹粉0.2%，蛋白胨0.3%，豆油0.1%，MgSO4.7H2O0.05%，CaCO31.0%，(NH4)2SO40.3%，KH2PO40.002%，pH7.2，121灭菌20min，28时接种(10%)。500mL三角瓶分装80mL。（6）黑曲霉培养基：2.5-3.00Be麦芽汁加1.5-1.8%琼脂，pH5.6-5.8，每支茄子瓶内分装40mL，121灭菌30min。（可用PDA培养基代替）（7）管碟法测定制霉菌素效价用菌层培养基：蛋白胨2%，麦芽糖4%，NaCl0.3%，琼脂2%，pH7.0-7.2 ，121灭菌30min。3.3 主要试剂Tween-80，DNP试剂（或用DNS试剂），1mg/mL标准葡萄糖溶液，工业盐酸、工业碱、碘液、蒽酮试剂，18%中性甲醛、酚酞指示剂、甲基红指示剂、0.1N HCl、0.2N NaOH标准溶液、邻苯二甲酸氢钾、80%乙醇、磷酸、98%乙醇、1：3（W/V）的乙酸乙酯、生理盐水(pH6.5)、pH8.0磷酸缓冲液。3.4 主要仪器定糖管，721分光光度计，水浴锅，碱式滴定管，离心机、牛津杯、冷冻干燥机、旋转蒸发器等。4. 方法与步骤4.1 种子制备（1）母瓶制备：从保藏的沙土管菌种中无菌操作接种适量沙土于处理好的斜面上，28培养7-10d。孢子成熟后立即放入4冰箱备用，保存期不可超过1个月。（2）子瓶制备：无菌操作从母瓶中选取深灰色、孢子丰满的菌落5-7个，放置3mL加有1-2滴Tween-80的无菌水中制成悬液，然后取1满环孢子悬液接种于已处理好的斜面上，28培养7-8d，孢子成熟后即可使用。子瓶菌落要求成片，孢子布满整个斜面。4冰箱中存放不能超过1个月。（3）无菌检查：母瓶和子瓶的每个瓶都要做无菌试验，证明无菌方可使用。检查方法即在每接种一个母瓶（子瓶）的同时将接种环经无菌手续对号插入肉汤培养基中，然后37培养6-8h后取出，对号接种于细菌琼脂斜面上，置37培养18取出检查，若无杂菌，该母（子）瓶方可使用；若发现有杂菌，则按瓶号相对应之母（子）瓶淘汰掉。4.2 发酵先从子瓶接种液体种子培养基，28摇床振荡培养（200r/min）20h，确证无污染后按10%接种量接入28的液体发酵培养基，28摇床振荡培养（200r/min）60h。4.3中间检测4.3.1 糖含量的测定（1） 还原糖的测定DNS法(测定方法参考实验一，标准曲线绘制自行设计)样品预处理：取9mL发酵液摇匀后置100mL三角瓶中，加工业盐酸2mL，水3mL。塞上具直型冷凝管的橡皮塞，沸水浴中水解40min。冷却，加2滴酚酞指示剂，以工业碱中和至微酸性，过滤，定容至25mL，摇匀，用该溶液测定总糖量。若样品不经水解，直接将发酵液抽滤，用过滤液进行显色测定（550nm测定），其含量即为发酵液中还原糖含量。（2） 蒽酮法测定糖含量原理：糖类遇浓硫酸脱水成糖醛或其衍生物，后者在浓硫酸作用下能与蒽酮反应生成蓝绿色化合物，其颜色深浅（625nm测定）与糖浓度成正比。4.3.2 氨基氮的测定（甲醛法）(1) 原理：蛋白质和氨基酸中的-NH3+基的PK值常在9.0以上，不能用一般的酸碱指示剂（包括酚酞），以氢氧化钠作滴定测量。但可以用甲醛滴定法测量。在甲醛滴定法中，甲醛可以与氨基酸中的氨基相互作用，使滴定终点移至 pH 9.0左右，在该过程中指示剂酚酞不与甲醛作用。pH 9.0正是酚酞的变色范围，因此，可以用酚酞作指示剂，以氢氧化钠来滴定-NH3+上的H+。反应如下： R-NH3HRNH2 R-NH22HCHOR-N（CH2OH）2 如此滴定的结果表示-氨基的含量，并准确度仅达氨基酸理论含量的90%。 甲醛滴定法，一般所采用的甲醛浓度是2.03.OM，即滴定后最终浓度为69%。(2)主要试剂:9%中性甲醛溶液：将甲醛（3637%）用蒸馏水稀释到约9%，然后调到 pH7（用 pH计检查），或是在其中加入1毫升0.1酚酞乙醇水溶液，然后用0.2N氢氧化钠溶液滴定到微红。（需临用前配制，若放置一些时间后，在使用前要重新中和。）(3)测定方法：取3个50 mL的锥形瓶，编号。向第1、2号瓶内各加入5 mL的标发酵液和10mL蒸馏水，混匀。向3号瓶内加入15mL蒸馏水。然后向3个瓶中各加入3滴酚酞指示剂，混匀后各加10mL中性甲醛溶液，再混匀，分别用02 NL标准氢氧化钠溶液滴定至溶液显微红色。重复以上实验2次，记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的mL数。取平均值。(样品-水)NNaOH14.008W氨基氮(mg/mL)=式中： 样品为滴定待测液耗用标准氢氧化钠溶液的平均mL数。 水为滴定对蒸馏水照液（3号瓶）耗用标准氢氧化钠溶液的平均mL数。NNaOH为标准氢氧化钠溶液的真实当量浓度。W为样品溶液体积(mL数)。14.008为1mL0.1N NaOH相当的氨基氮毫克数。4.4 制霉菌素化学效价的测定（1） 将发酵液搅拌均匀后立即用破口移液管吸取5mL放入离心管，另加5mL或更多的蒸馏水，搅拌均匀，低速离心10 min。弃上清，再加蒸馏水至离心管4/5，反复离心洗涤3次。最后弃上清。（2）用80%乙醇10-15mL，加入上述弃上清的离心管内，用玻璃棒搅拌菌丝片刻，离心5min，将上清倒入棕色的50mL容量瓶中。如此反复用80%乙醇抽提3次，上清全部倒入上述容量瓶中，最后用80%乙醇定容至50mL，充分摇匀。（3）取乙醇抽提液2mL，移入25mL刻度试管，再加入10mL磷酸，浸入沸水浴中6min，取出迅速冷却，然后加磷酸至25mL。（4）用2的比色杯在470nm下测光密度，以磷酸作空白对照，测得光密度查标准曲线，计算每mL发酵液含制霉菌素单位。化学效价标准曲线的制备：将制霉菌素标准品用乙醇配制成1000U/mL的母液（置于棕色瓶中）， 按下表量在各25mL刻度试管中加入母液和磷酸：管号 制霉菌素母液（1000U/mL）(ml) 磷酸(mL)1 0 102 0.2 103 0.4 104 0.6 105 0.8 106 1.0 1071.21081.41091.610101.810112.010同时将各试管置于沸水中沸水浴6min，取出后立即冷却，最后以磷酸将各管定容至25mL，混匀后于470nm比色测定，读取光密度值并绘制标准曲线。4.5 制霉菌素的提取和精制制霉菌素存在于菌丝体中，用含水乙醇可以提取出来。但粗制品中尚含有放线菌酮，所以粗制品要用醋酸乙酯洗涤并用水洗去水溶性杂质方可得到纯品。步骤如下：（1）离心获得菌丝体。（2）乙醇萃取：用湿菌体2.5-3倍(W/V)的98%乙醇进行抽提，温度20-25，搅拌40 min过后离心，抽提液含乙醇70%左右，菌渣再用乙醇抽提2次。（3）浓缩：合并滤液，减压浓缩（700mmHg下）至原体积的15%以下。（4）精制：浓缩液5存放6-12h，使结晶完全，离心去母液，结晶用1：3（W/V）的乙酸乙酯洗涤，再用生理盐水(pH6.5)洗涤，最后用乙酸乙酯洗一次后抽干。4.6 制霉菌素成品生物效价的测定4.6.1 黑曲霉孢子悬液的制备将黑曲霉接种、26培养7d至长出黑色孢子，置6保存。使用时将一只茄子瓶的孢子制成20mL孢子悬液，取0.6mL于冷却至48的20mL菌层培养基内，混匀，于26-27培养14-18h，滴定到80u/mL的制霉菌素的抑菌圈直径为20-22mm止。4.6.2 生物效价的测定（1）用pH8.0 PBS配置80u和40u/mL的标准溶液。（2）供试样品溶液将抽干的晶粉按化学效价测定单位稀释成80u和40u/mL。（3）测定：在90mm培养皿中先倒好底层培养基（同菌层培养基）15mL，另按0.5-0.6mL黑曲霉孢子悬液每20mL培养基的比例将孢子悬液混入已熔化并冷却至48的菌层培养基，取4mL涂布于底层培养基上。置水平台上冷却后，每个平皿放4个牛津杯，于对角二管中加入80u和40u/mL的标准溶液，另两对角管中加入80u和40u/mL的供试品溶液（各杯中加液量务必一致！）。26-27培养14-18h（培养时用陶瓷皿盖！）后用卡尺量取抑菌圈直径，计算其效价。设：S1低剂量标准品所致抑菌圈直径， S2高剂量标准品所致抑菌圈直径， T1低剂量供试品所致抑菌圈直径，T2高剂量供试品所致抑菌圈直径，M1标准品低剂量，M2标准品高剂量，M1供试品低剂量，M2 供试高剂量，Ilg(高剂量/低剂量)为样品效价/标准品效价，则5.实验报告6.思考题（1）制备双碟（测效价用菌层培养基底层和涂布的含菌层）时为什么必须在水平面上、并选择平底的培养皿？（2）敏感指示菌的生长时间和菌液浓度对抑菌圈直径有何影响？（3）为什么各牛津杯中的加液量必须一致（液面高度相同）？培养时为什么用陶瓷皿盖而不用玻璃皿盖？附录：附DNS试剂配方称取酒石酸钾钠182.0g，溶解于500ml蒸馏水中，加热（不超过50），于热溶液中依次加入3,5-二硝基水杨酸6.3g，氢氧化钠21.0g,苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5.0g，搅拌均匀至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，储存于棕色瓶中，室温保存，7-10天后使用。附蒽酮试剂配方0.2g蒽酮加入100mL浓硫酸（现用现配或备用）。氢氧化钠标准溶液配制与标定一、 配制：将氢氧化