课件：胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆、表达及免疫原性研究.ppt

胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,研 究 生： 富 亮 指导教师： 赵玉军 教授 徐福洲 博士 专业名称： 预防兽医学 研究方向： 动物传染病学 所在学院： 畜牧兽医学院,胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆、表达及免疫原性研究,第一章 前 言,第二章 apxA基因的克隆与原核表达,第三章 apxA表达蛋白的免疫原性研究,猪传染性胸膜肺炎概况,猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的猪的呼吸道疾病，其病理特征是引起肺脏广泛的纤维素性渗出、坏死、出血、胸膜粘连，中性细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞的浸润，血管栓塞，纤维素沉积等。各种年龄猪对该病均易感，新疫区常急性爆发，急性感染尤其是2425日龄仔猪感染后表现出极高的发病率和死亡率，发病仔猪迅速死亡，死亡率达到20以上，最急性型可达80100 ，并且长期带菌而成为传染性胸膜肺炎再次爆发和流行的潜在传染源，给本病的控制和根除带来困难。同时本病在临床上常与副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒等混合感染，给养猪业造成巨大的经济损失。该病是国际上公认的危害现代养猪业的重大疫病之一。,胸膜肺炎放线杆菌概述,胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae APP），属于巴氏杆菌科（Pasteurellaceae）放线杆菌属（Actinobacillus）。APP是一种革兰氏阴性小球杆菌，有荚膜，有菌毛，不形成芽胞，无运动性，最近还发现该菌有鞭毛。胸膜肺炎放线杆菌分两个生物型，即生物型和生物型，生物型为辅酶（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD）依赖型，生物型为非NAD依赖型。血清型是根据APP表面荚膜和脂多糖抗原性的不同来划分的，现已发现15种血清型，1型-12型、15型属于生物型，13、14型属于生物型。,APP菌体形态（G）,APP主要毒力因子,溶血素（Apx毒素） 脂多糖（LPS） 荚膜多糖(CPS) 外膜蛋白(OMP) 尿素酶(Urease) 转铁结合蛋白（Tbp） 粘附素,溶血外毒素 （Apx毒素）,APP产生的溶血外毒素Apx被认为是APP最重要的毒力因子。在APP的15个血清型中，目前已发现产生四种不同的溶血毒素（Repeats in the structural toxin，RTX），称为Apx（Actinobacillus pleuropneumoniae- RTX-toxin，Apx），即Apx、Apx、Apx和Apx。,Apx的毒性最强，表观分子量为105-110kDa，具有很强的溶血活性和细胞毒性作用，分泌Apx的血清型有1、5、9、10和11。毒素型的操纵子包括：毒素激活基因apxC，毒素结构蛋白基因apxA，两个分泌基因apxB和apxD，其中apxC负责编码毒素激活蛋白，apxA编码毒素结构蛋白，apxB和apxD与毒素的分泌有关。 apxA基因的N端疏水区是Apx的免疫原区， apxA基因的C端是Ca2+结合区只对毒素发挥毒性产生作用。,Apx毒素的表观分子量为103kDa105 kDa，除血清型10以外，其他血清型都可以分泌此毒素。Apx具有弱的溶血活性，它对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞也有细胞毒性作用。,Apx毒素的表观分子量为120 kDa，是由2、3、4、6、8型APP菌分泌的，Apx没有溶血活性，但对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞有很强的细胞毒性作用。,Apx毒素是新近发现的。研究人员发现任何血清型都能在体内分泌Apx毒素蛋白，但体外培养的细菌却不能分泌该毒素。当apxA与表达载体上的开放阅读框1（ORF1）在大肠杆菌中表达时，它有微弱的溶血活性和协同溶血作用（cAMP）。,不同Apx毒素的生物学特性,Apx操纵子基本结构,毒素分泌基因,胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆与原核表达,技术路线：,apxA基因的克隆与测序,重组表达质粒的构建与鉴定,诱导表达,诱导表达条件的优化,PCR鉴定,双酶切鉴定,Western Blotting,不同时间,不同IPTG浓度,不同温度,apxA基因的扩增,引物设计,参照GenBank中apxA核酸序列（D16582），应用Primer5.0软件设计1对引物，其上下游引物中分别含有EcoR和Xho酶切位点，预期扩增长度为3158bp，由北京三博远志生物技术有限公司合成。 上游引物： AGC GAA TTC ATG GCT AAC TCT CAG CTC G 下游引物： AGC TCG AGA TCC ATT TGC TCC TCC AT,apxA基因的PCR扩增结果,PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳显示大小约为3.2kb，与预期大小一致 。,重组质粒pTA的PCR和酶切鉴定结果,对重组质粒pTA进行PCR和酶切鉴定：PCR扩增出约3.2kb的目的条带；EcoRI和 XhoI双酶切后切出大小分别为3.0kb和3.2kb的两条带，结果表明目的片段已克隆到质粒载体上。,目的片段序列测定,pTA的测序结果与GenBank中发表的APP标准10型apxA基因（D16582） 进行同源性分析，结果表明，两端的同源性分别为99.4%和99.6%。表明apxA基因已经成功克隆到pGEM-T easy vector克隆载体 中。,重组表达质粒pETA的PCR 和酶切鉴定结果,对重组质粒pETA进行PCR和酶切鉴定：PCR扩增出约3.2kb的目的条带； EcoRI和 XhoI双酶切后出现5.9kb的空载体和3.2kb的插入片段两条带。鉴定结果表明目的片段以正确方向插入原核表达载体pET-32a中。,不同时间诱导表达的 SDS-PAGE电泳图,含有重组质粒的BL21（DE3）经IPTG诱导后，可表达一相对分子量约120kDa的融合蛋白，与实际预测大小相符，不同诱导时间显示诱导后56h表达量最高。,不同浓度IPTG诱导表达的 SDS-PAGE电泳图,将不同IPTG浓度诱导的样品进行SDS-PAGE ，结果表明，IPTG浓度为0.6mmol/L的蛋白表达量最高。,不同温度IPTG诱导表达的 SDS-PAGE电泳图,将不同温度诱导表达的样品进行SDS-PAGE ，结果表明，在25条件下表达的蛋白表达量最高。,重组质粒pETA表达产物Western blotting检测结果,表达蛋白经SDS-PAGE电泳后转印至PVDF膜上，用兔胸膜肺炎放线杆菌免疫血清作一抗，羊抗兔IgG作二抗进行免疫印迹检测。结果可见一条特异性的抗原抗体结合带，分子量大小与目的蛋白相同，从而证明表达的目的蛋白是apxA蛋白。,裂解后SDS-PAGE电泳图,超声裂解后进行SDS-PAGE：经超声波裂解后离心，分别对上清和沉淀进行SDS-PAGE。结果表明，目的蛋白在沉淀物中，故可判定目的蛋白以包涵体形式存在。,apxA表达蛋白的免疫原性研究,技术路线：,三种表达蛋白的纯化 及Western blotting分析,天然Apx毒素蛋白的提取,免疫原浓度的测定与免疫小鼠,用间接ELISA方法检测 免疫后小鼠的抗体水平,APP1型菌和APP10型菌 半数致死量（LD50）的确定与攻毒,三种蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图,纯化后的蛋白经过SDS-PAGE，结果如图所示，三种蛋白的大小分别为120kDa、58kDa、79kDa。纯化后比较显示杂带减少，表明纯化效果良好。,三种蛋白的Western blotting检测结果,用APP10型菌免疫兔的阳性血清作一抗，用HRP标记的羊抗兔IgG作二抗，进行Western blotting分析，结果如图所示，三种蛋白都与阳性血清反应，说明都具有免疫原性。,APP10型菌所提取的天然Apx,经过SDS-PAGE，如图所示，用饱和硫酸氨（NH4）2SO4）沉淀法提取天然ApxI毒素蛋白的大小为105110kDa。,免疫原浓度的测定结果,经BCATMProtein Assay Kit测得apxA表达蛋白浓度为2.5mg/ml、apxAN表达蛋白浓度为3mg/ml、apxAC表达蛋白浓度为2.4mg/ml、提纯的天然Apx毒素蛋白浓度为5 mg/ml。,实验动物分组,免疫程序与剂量,将提取的天然Apx毒素蛋白和三种表达蛋白乳化后分别免疫小鼠，共免疫三次，每次间隔两周。 一免：将纯化的三种表达蛋白与提纯的天然Apx毒素用PBS稀释，与等量的弗氏完全佐剂乳化制成疫苗，每0.2ml疫苗中含有蛋白100g，进行多点皮下注射免疫。 二免：将四种蛋白用PBS稀释，与等量的弗氏不完全佐剂乳化制成疫苗，每0.2ml疫苗中含有蛋白150g，进行多点皮下注射免疫。 三免：将四种蛋白用PBS稀释，与等量的弗氏不完全佐剂乳化制成疫苗，每0.2ml疫苗中含有蛋白200g，进行多点皮下注射免疫。 对照组用PBS与等量佐剂乳化后，对小鼠进行多点皮下注射免疫。,小鼠免疫后的抗体效价,APP10型半数致死量（LD50）的确定,根据事先估计10型和1型的LD50，我们分别利用三个梯度的10型菌和1型菌对小鼠进行腹腔注射攻毒。,APP10型菌小鼠腹腔攻毒结果,根据攻毒结果，我们确定APP10型菌的半数致死量（LD50）约为4106CFU。,注：分子为存活小鼠数;分母为试验小鼠数。,APP1型半数致死量（LD50）的确定,APP1型菌小鼠腹腔攻毒结果,注：分子为存活小鼠数；分母为试验小鼠数。,根据攻毒结果，我们确定APP1型菌的半数致死量（LD50）约为1106CFU。,攻毒结果,注：分子为存活小鼠数；分母为试验小鼠数。,三免十天后试验组和对照组分别用APP10型菌和APP1型菌5LD50的剂量进行攻毒。24h内观察小鼠死亡情况及状态。,结 论,1.本试验成功的从胸膜肺炎放线杆菌血清10型基因组DNA中扩增出了编码Apx毒素结构蛋白的apxA基因，经克隆测序显示其长度为3158bp。与GenBank中发表的APP标准10型apxA基因（D16582） 进行同源性分析，结果表明同源性达到了99.4%以上。 2.apxA基因在原核表达载体pET-32a中进行了高效融合表达，表达产物分子量约为120kDa，最终确定的理想诱导表达条件为：诱导温度为25、IPTG浓度为0.6mmol/L、诱导时间为5h，且Western blotting分析显示可与APP免疫血清发生免疫结合反应。,3. 纯化了apxA、apxAN和apxAC三种表达蛋白，apxA具有与天然Apx毒素类似的免疫原性，且N端免疫原性显著高于C端。 4. 提取了天然的Apx毒素蛋白，试验证明其具有免疫原性和交叉保护力。,谢谢大家！,请各位老师批评指正！,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考，实际情况实际分析,主要经营：课件设计，文档制作，网络软件