中药常用纯化技术ppt课件

中药常用纯化方法的特点和选用,中药开发研究所,用各种方法得到的提取物是包含诸多成分的混合物，要想得到所需成分或单体化合物，须经反复分离精制。 提取液一般体积较大，所含成分浓度较低，因此须对提取液通过蒸发或蒸馏进行浓缩，进行进一步的分离和精致。,一、水提醇沉法 二、醇提水沉法 三、盐析法 四、酸碱法 五、透析法 六、分馏法 七、 萃取法 八、系统溶剂分离法,目 录,含义：先以水为溶剂提取药材有效成分，再用不同浓度乙醇沉淀除去提取液中杂质的方法。 原理：利用中药中的大多数成分易溶于水和醇的特性，用水提出，并将提取液浓缩，加入适当的乙醇或水反复数次沉降，除去其不溶解的物质，最后制得澄明的液体。,一、水提醇沉法,工艺依据 通过水和不同浓度的乙醇交替处理 可保留生物碱盐类、苷类、氨基酸、有机酸等有效成分。 去除蛋白质、糊化淀粉、黏液质、油脂、脂溶性色素、树脂、树胶、部分糖类等杂质。 药材成分在水和乙醇中的溶解性。 含醇量50%-60% 除淀粉、多糖等杂质 75% 除蛋白质等杂质 80% 除全部蛋白质、多糖、无机盐等杂质 根据工业生产的实际情况。,水提醇沉法的操作要点,药材水提浓缩至1:1或1:2加95%乙醇冷藏去除杂质。 （1）药液的浓缩：浓缩至约1ml相当于原药材12g。最好减压低温浓缩，不宜用直火加热 （2）加乙醇的时间：药液冷却后加乙醇 （3）醇沉浓度：颗粒剂、合剂一般使含醇量达50%-60%，口服液为提高澄明度含醇量可达60%-70% （4）加醇方式：一为分次醇沉，二为梯度递增法醇沉。边加边搅拌（注意慢加快搅） （5）冷藏与处理：含醇药液慢慢降至室温后，再移置冷库中，于510下静置1224小时（加速胶体杂质凝聚）,生产中：称重法 Cg/g%=0.7958Cml/ml/d+（0.7958-d)Cml/ml100% d: 醇沉温度下浓缩药液的密度 加回收乙醇后：C=C2V/（12） = （12） （C-C） /（C1-C）,操作要点举例： 取丹参饮片200g a 煎煮2次：810倍水，浸泡30min，煎煮1h，纱布过滤滤液1。药渣加68倍水，煎煮1h，纱布过滤滤液2。 b 浓缩：滤液1 滤液2浓缩至100mL c 第一次醇沉：加醇至含醇量70，静置冷藏2天 过滤除杂质，滤液减压浓缩至40mL（1：5）。 d 第二次醇沉：加醇至含醇量85，静置冷藏2天 过滤除杂质，减压浓缩至20mL（1：10）。 醇沉浓度要先低后高，有利于除杂质，减少杂质对有效成分的包裹，防止其一起沉出。 乙醇加入方法：要边加边搅拌。,二、醇提水沉淀法 先用适宜浓度的乙醇提取药材成分，再用水除去提取液中杂质的方法。 适用于有效成分为醇溶性或在醇水中均有较好溶解性的药材。,常用方法：渗漉法、回流法。 可保留生物碱盐类、苷类、有机酸等有效成分。 去除脂溶性色素、树脂等杂质。 含醇量 40%-50%提取：强心苷、单宁、蒽醌及其苷、苦味质等 60%-70%提取：苷类 更高浓度乙醇提取：生物碱、挥发油、树脂、叶绿素等,乙醇浓度的选择：杂质少、浓度高 95%乙醇 防止“串味”或混溶，造成污染 配制适合浓度 乙醇用量的计算（前面已讲） 浓缩液相对密度的测定： 通常：1:1 特殊：1.201.25g/ml（50-60） 醇沉的评判标准： 具明显分界线、沉淀物呈板块状（好） 无明显分界线、沉淀物呈稀糊状或蛋花状（不好）,水提醇沉法和醇提水沉法注意事项,三、盐析法 含义：在含某些高分子物质的溶液中加入大量无机盐，使其溶解度降低沉淀析出，而与其他成分分离的一种方法。 主要适用于有效成分为蛋白质的药物的分离纯化。 盐能使蛋白质分子表面的电荷被中和、蛋白质胶体的水化层脱水 凝聚沉淀 常用盐：硫酸铵、硫酸钠、氯化钠等,三七的水提液中加硫酸镁至饱和状态，三七皂苷乙即可沉淀析出。 原白头翁素、麻黄碱、苦参碱等水溶性较大，在萃取分离时，也往往先在水提取液中加入一定量的食盐，再用有机溶剂萃取。,四、酸碱法 在溶液中加入适量酸或碱，调节pH值至一定范围，使单体成分溶解或析出，以达到分离的目的的方法。 方法： 酸溶碱沉法：生物碱 加酸 碱溶酸沉法：黄酮和香豆素类 加碱 等电点法：蛋白质（羧基和氨基） 一些具有内酯结构的化合物遇热碱开环生成羧酸盐而溶于水，加酸后，又重新形成内酯环从溶液中析出。 本分离法适用于酸或碱性成分，以及内酯类成分的分离。,五、透析法 利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而高分子物质不能通过的性质，借以达到分离的一种方法。 小分子化合物：氨基酸、无机盐、单糖、双糖等 高分子化合物：皂苷、蛋白质、多肽、多糖等 膜类型：动物膀胱膜、火棉胶膜、羊皮纸膜、再生纤维素膜、玻璃纸膜、蛋白胶膜 透析法的分离速度较慢，为了加快透析速，可用电透析法，电透析可使带电离子的透析速度增加10倍以上。,六、分馏法,分馏法是利用各成分沸点的差异进行提取分离的方法，用于分离液体混合物。 在天然药物有效成分研究中，挥发油及一些液体生物碱的分离常用此法。,七、萃取,（一）液液萃取,溶剂萃取又称为液液萃取 ，在中药研究中，萃取分离法主要用于有效成分的分离和富集。 如果被萃取组分是有色化合物，则可以取有机相直接进行光度测定，这种方法称为萃取光度法。 萃取光度法具有较高的灵敏度和选择性。,杂质,溶质,原溶剂,萃取剂,Light phase,Heavy phase,实验室液液萃取过程,一般萃取3-4次即可,液液萃取优点：溶剂萃取具有选择性好、回收率高、设备简单、操作简便、快速，以及易于实现自动控制等特点，因此一直受到广泛重视。 缺点：费时费工，萃取溶剂易挥、易燃、有毒。,应 用： 分配系数： 利用成分在溶剂中溶解性能差异 改变pH值：游离或成盐（生物碱、黄酮等） 洗涤：极性溶剂亲脂性溶剂，亲脂性溶剂-极性溶剂，去除杂质。 萃取操作 1简单萃取 2.逆流连续萃取 3.pH值梯度萃取法 4.逆流分溶法 5.液滴逆流分配法,1简单萃取法 两相溶剂萃取法是分离天然药物化学成分的常用方法。少量样品的萃取用分液漏斗操作。 萃取的基本原理是利用混合物中各种成分在两相互不相溶的溶剂中分配系数的差异而达到分离的目的。 分配系数()可以下式表示： u/L,乳化现象,液-液萃取中常遇到乳化现象。产生的原因有：溶剂的组合、成分的种类等。操作中出现乳化现象，可采用下列破乳方法： 久置； 用一金属丝在乳化层中搅动使之破坏； 将乳化层抽滤； 将乳化层热敷或冷冻； 分出乳化层，再用新溶剂萃取； 加少量氯化钠，解决两相比重相差较小及两相溶剂部分互溶的问题； 滴加数滴醇类如乙醇或磺化蓖麻油等破乳类物质,2逆流连续萃取法,（二）固相萃取,原理：选择性吸附和选择性洗脱的色谱分离原理。利用固相吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用洗脱液洗脱，达到分离和和富集的目的。 分离：杂质保留或目标化合物保留。 保留机制：被洗脱物与吸附剂表面的活性基团；化合物极性与吸附剂极性越接近，保留越强。 分离机理：利用杂质或目标化合物与样品基体溶剂和吸附剂之间亲和力的相对大小（分子间作用力）。,固相模式,1.反相萃取 2.正相萃取 3.离子交换萃取 洗脱模式：取决于 与固相的亲和力 被洗脱物溶剂（水、醇等），采用亲和力强于固相的溶剂洗脱。 被洗脱物环己烷四氯化碳甲苯苯无水乙醚氯仿二氯甲烷四氢呋喃乙酸乙酯丙酮乙腈异丙醇甲醇水乙酸,1. 反相萃取（Reversed-Phase),反相：吸附剂是非极性或弱极性的，如硅胶键合C18,C8, C4，C2,-苯基等. 应用：可以从强极性的溶剂中吸附是非极性到中等极性的化合物。 作用机理:非极性-非极性相互作用 范德华力或色散力,硅胶键合C18（ODS）,ODS: octadecyl-silica (硅胶键合C18) ENVI-C18:键端封尾处理,去除硅胶表面残留的硅醇基,改善其对碱性或酸性化合物的吸附或拖尾.碳含量增大,对非极性化合物的保留容量增大. 应用：中等极性到非极性化合物,如抗生素、咖啡因、药物、染料、芳香油、脂溶性维生素、杀菌剂、除草剂、农药、碳水化合物、苯酚、 类固醇、表面活性剂、茶碱等 洗脱溶剂：甲醇、乙腈、 丙酮及乙酸乙酯等,HLB柱,HLB: hydrophilic-lipophillic balance，亲脂的二乙烯基苯和亲水的N-乙烯基吡咯烷酮按比例聚合 和硅胶键合C18（ODS)比较： pH适用范围1-14 柱子不怕抽干，碳链不会塌陷 可以调节样品溶液的pH值来选择性的保留酸性、中性和碱性化合物。 高保留性,其他反相吸附剂,C8：与C18相似，适合于非极性到中等极性的化合物，对非极性化和物的保留较C18稍弱。 -苯基：与C8类似 -C4：疏水性弱，适合于多肽和蛋白质的 萃取。 聚合物吸附剂：如苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，用来保留含有亲水基团的疏水性物质，如芳香族化合物等。 化合物的极性和吸附剂的极性越接近，产生的吸附越强。,2. 正相萃取(Normal-Phase),吸附剂： 极性键合相，如硅胶键合NH2、CN，-Diol（二醇基）； 极性吸附剂，如silica、florisil、(A-,N-,B-)alumina、硅藻土等 作用机理： 1）极性-极性相互作用 2）表面硅羟基、铝羟基与极性化合物的极性官 能团之间相互作用，包括氢键，-键等。 3）偶极-偶极相互作用 4）偶极-诱导偶极相互作用 应用：从非极性溶剂样品中吸附极性化合物,硅胶柱(silica),表面SiOH,中等强度的吸附剂，适用于从非极性基体中吸附极性化合物。 硅胶是一种酸性吸附剂，可以吸附酸性（有机酸类）或中性的极性化合物，由于表面的硅醇基可以释放出弱酸性的氢离子，又作为一种弱酸性阳离子交换剂，吸附碱性化合物（生物碱类，胺类）。 活性（吸附性）与硅胶的含水量有关，根据其中含水量不同分为不同的活性等级。 硅胶的活化：加热到100-110度，除去表面吸附的水份，当温度升到500度，表面的硅醇基脱水变成硅氧烷键，从而丧失吸附性。 硅胶极亲水：分析的样品溶液必须无水。 备注：硅胶净化时，一般杂质保留在柱上，目标化合 物流出。,氧化铝(Alumina),表面含有铝羟基，一种强极性吸附剂，通过与极性化合物和不饱和化合物形成氢键而产生吸附 根据形成条件不同分为酸性、中性和碱性氧化铝。 1）酸性：用1%盐酸浸泡后，用蒸馏水洗至氧化铝的悬浮液pH为4，用于分离酸性物质或对酸稳定的中性物。 2）中性：水洗至中性 ，用于分离中性物。如醛、酮、酯、醌等类有机物质 3）碱性：用于胺或生物碱的分离。 根据含水量的不同，分为不同的活性等级。 化合物的吸附性与其极性成正比，各种化合物对氧化铝的吸附性顺序为：酸和碱 醇、胺、硫醇 酯、醛、酮 芳香族化合物 卤代物、醚 烯 饱和烃 注意：样品溶液中不含水,极性键合固定相,-NH2（氨基）：较强的氢键结合能力，对某些多官能团化合物如甾体、强心甙等有较好的分离能力。 a)正相萃取:适用非极性样品溶液中吸附极性化合物。 b)弱阴离子交换萃取:适用于水溶液样品中碳水化合物、弱阴离子和有机酸化合物。 -CN（氰基）： a)正相萃取：适用非极性样品溶液中吸附极性化合物，如酚类，类固醇、 b) 反相萃取：适用于水溶液样品中等极性的化合物。 -Diol(二醇基): 正相萃取，适用于分离有机酸、甾体和蛋白质。 形成氢键的强弱:-NH2-CNDiol,正相或反相选择原则,总目的：杂质和待分析物分离 1、受样品基体提取溶剂，要分离的杂质和目标化合物的性质制约 a)物质在柱上的保留（或洗脱）取决于其与吸附剂和样品基体溶剂（或洗脱溶剂）之间亲和力的相对大小。 样品基体是强非极性溶剂，如正己烷，二氯甲烷等，一般要选用正相柱分离。 样品基体是强极性溶剂，如水和甲醇，乙腈及丙酮的混合液，要选用反相柱分离。,3. 离子交换分离法,按键合的离子基团的性质分类： 阳离子交换柱 阴离子交换柱 按在水溶液中解离的程度： 强酸性(SCX, Strong cation exchange) 弱酸性(WCX,Weak cation exchange) 强碱性(SAX, Strong anion exchange) 弱碱性(WAX, Weak anion exchange),强酸性阳离子交换树脂,指在交联结构高分子基体上带有磺酸基（SO3H）的一类树脂 反应式： RSO3H+Na+ RSO3Na+H+ 在碱性、中性、甚至酸性介质都显示离子交换功能 对强阳离子吸附较强, 一般用一种含高浓度阳离子的洗脱液洗脱。 对弱阳离子（弱碱离子）的吸附可以用一种碱溶液洗脱，中和弱阳离子的电荷。,弱酸性阳离子交换树脂,指含有羧酸基（COOH）、磷酸基（PO3H2）、酚基（ OH）的离子交换树脂 离解如下： R-COOH R-COOH 在接近中性和碱性介质中显示离子交换功能 对强阳离子吸附可以通过酸性洗脱液中和硅胶表面的羧基而洗脱，或者用一种高浓度阳离子洗脱。 对弱阳离子（弱碱离子）的洗脱可以用一种碱性洗脱液中和弱阳离子而洗脱，或用一种酸性洗脱液中和硅胶表面的羧基洗脱，或用一种高浓度的阳离子洗脱。,强碱性阴离子交换树脂（SAX),所带来的功能团常见的碱性基团有： 在水中解离： 在酸性、中性、碱性解介质中都显示离子交换功能 对强阴离子的吸附较强，难用调节洗脱液pH值洗脱，一般用一种高浓度阴离子洗脱。 对弱阴离子（弱酸根离子）的吸附可以用一种酸性洗脱液来洗脱，中和弱阴离子。,弱碱性阴离子交换树脂,指以伯胺（NH2）或仲胺(-NHR)、叔胺（NR2）为交换基团的离子交换树脂。 离解： R-NH2+H2O R-NH3+OH 只有在中性及酸性介质中才显示离子交换功能 对强阴离子的吸附可以用一种碱性洗脱液中和硅胶表面的氨基而洗脱，或高浓度的阴离子洗脱 对弱阴离子（弱酸根离子）的吸附可以用一种酸性洗脱液中和弱阴离子洗脱，或用一种碱性洗脱液中和硅胶表面的氨基而洗脱，或一种高浓度的阴离子洗脱。,离子选择吸附顺序,吸附：离子浓度相近时，电荷高，半径小的离子易被吸附。如下： 强酸性 Fe3+Cr3+Al3+Ca2+Mg2+K+NH4+Na+H+Li+ 弱酸性： H+ Fe3+ Cr3+ Al3+ Ca2+ Mg2+ K+ NH4+ Na+ Li+