课件：金黄色葡萄球菌检测ppt.ppt

金黄色葡萄球菌,一金黄色葡萄球菌的生物学特性,1、形态与染色：(staphylococcus aureus) 典型的金黄色葡萄球菌为球型， 直径0.8m左右，显微镜下排 列成葡萄串状。 金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛， 大多数无荚膜。 革兰氏染色阳性。,金黄色葡萄球菌的显微照片 典型的金黄色葡萄球菌为球型， 直径0.8m左右，显微镜下排列成葡萄串状。 金黄色葡萄球菌革兰氏染色显微照片 金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛，大多数无荚膜,金黄色葡萄球菌的扫描电镜照片 金黄色葡萄球菌的透射电镜照片,2、培养特性： 金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37C，最适生长pH 7.4。 平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。 金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。,3、生化特性： 可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。 许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。 金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。,二金黄色葡萄球菌的抗原构造和分型,对分型进行简单的了解 、血清学分型： 金葡水解，获得两种抗原成分：蛋白抗原和多糖抗原。 蛋白抗原是凝集抗原，无特异性。 多糖抗原有特异性。 绝大多数金葡含有A型抗原，B型抗原主要存在于凝固酶阴性菌株，C型抗原在致病性和非致病性菌株中都存在。 、噬菌体分型： 、根据肠毒素分型： 、根据血浆凝固酶分型：,三金黄色葡萄球菌的致病性,金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。 金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶： a.溶血毒素：外毒素，分、四种，能损伤血小板，破坏溶酶体，引起肌体局部缺血和坏死； b.杀白细胞素：可破坏人的白细胞和巨噬细胞； c.血浆凝固酶：当金黄色葡萄球菌侵入人体时，该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固，阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关； d.脱氧核糖核酸酶：金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温，可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌； e.肠毒素：金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素，分为A、B、C、D、E及F五种血清型。 当金黄色葡萄球菌污染了含淀粉及水分较多的食品，如牛奶和奶制品、肉、蛋等，在温度条件适宜时，经8-10小时即可相当数量的肠毒素。肠毒素可耐受100C煮沸30分钟而不被破坏,它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。 此外，金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。,四金黄色葡萄球菌的流行病学,金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。作为人和动物的常见病原菌，其主要存在于人和动物的鼻腔、咽喉、头发上，50%以上健康人的皮肤上都有金黄色葡萄球菌存在。因而，食品受其污染的机会很多。 近年来，美国疾病控制中心报告，由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位，仅次于大肠杆菌。 金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点： 季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。 一般说，金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品： 食品加工人员、炊事员或销售人员带菌，造成食品污染；食品在加工前本身带菌，或在加工过程中受到了污染，产生了肠毒素，引起食物中毒；熟食制品包装不严，运输过程受到污染；奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时，对肉体其他部位的污染。 金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多，占45%，我国每年发生的此类中毒事件也非常多。肠毒素形成条件： 存放温度，在37C内，温度越高，产毒时间越短； 存放地点，通风不良氧分压低易形成肠毒素； 食物种类，含蛋白质丰富，水分多，同时含一定量淀粉的食物，肠毒素易生成。,五金黄色葡萄球菌的检验,我们以SN标准中的最近似值(MPN)测定法来进行讲解： 这种方法适用于检测认为带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的食品中的少量金黄色 葡萄球菌。 1、样品制备： 固体或半固体食品: 以无菌操作称取25g样品,放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌均 质杯内,于8000r/min均质12min,制成1:10样品匀液。 液体食品: 用灭菌吸管吸取25mL样品,放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内 (瓶内预置适当数量的玻璃珠),经充分振摇制成1:10样品匀液。 供计数检验时,可按十进位递增稀释法将样品匀液再进行适当稀释。 2、选三个连续稀释度，从每个稀释度分别取1 mL稀释样品液，接种3管含10氯化钠why? 胰蛋白胨大豆肉汤。样品的最高稀释度必须达到能获得阴性终点,置361培养48 h。 3、用3 mm接种环,从有细菌生长的各管中移取1 环,划线接种于表面干燥的Baird- Parker琼脂平板,置361培养4548h。 4、从有细菌生长的每一平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落,移种到肉汤培养基中,置361培养2024 h。 5、取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆于8mm100mm试管内充分混合,置 361培养,定时观察是否有凝块形成,至少观察6 h,以内容物完全凝固,使试管倒置或 倾斜时不流动者为阳性。试验中需同时做巳知阳性和阴性对照。对可疑结果,应进行革兰氏染色、镜检和其他辅助试验如耐热核酸酶试验等 加以证实。 6、报告结果：根据凝固酶试验结果查最近似值(MPN)表,报告金黄色葡萄球菌 的MPN/g (mL)。,SN标准中的最近似值(MPN)测定法 这种方法适用于检测认为带有大量竞争菌的食品及其原料和未经处理的食品中的少量金黄色 葡萄球菌。 1、样品制备： 固体或半固体食品: 以无菌操作称取25g样品,放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌均 质杯内,于8000r/min均质12min,制成1:10样品匀液。 液体食品: 用灭菌吸管吸取25mL样品,放入装有225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶内 (瓶内预置适当数量的玻璃珠),经充分振摇制成1:10样品匀液。 供计数检验时,可按十进位递增稀释法将样品匀液再进行适当稀释。 2、选三个连续稀释度，从每个稀释度分别取1 mL稀释样品液，接种3管含10氯化钠why? 还记得么？ 金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10-15%NaCl肉汤中生长。 因此，这事实上是一种选择性的增菌。胰蛋白胨大豆肉汤。样品的最高稀释度必须达到能获得阴性终点,置361培养48 h。 3、用3 mm接种环,从有细菌生长的各管中移取1 环,划线接种于表面干燥的Baird- Parker琼脂平板,置361培养4548h。 4、从有细菌生长的每一平板上至少挑取1个可疑金黄色葡萄球菌菌落,移种到肉汤培养基中,置361培养2024 h。 5、取肉汤培养物0.3mL同0.5mL凝固酶试验兔血浆于8mm100mm试管内充分混合,置 361培养,定时观察是否有凝块形成,至少观察6 h,以内容物完全凝固,使试管倒置或 倾斜时不流动者为阳性。试验中需同时做巳知阳性和阴性对照。对可疑结果,应进行革兰氏染色、镜检和其他辅助试验如耐热核酸酶试验等 加以证实。 附：金黄色葡萄球菌血浆凝固酶试验 6、报告结果：根据凝固酶试验结果查最近似值(MPN)表,报告金黄色葡萄球菌 的MPN/g (mL)。,六金黄色葡萄球菌肠毒素的检测（简介）,一、动物学试验：主要用幼猫和猴。 二、血清学试验： 肠毒素作为抗原，可以和特异性抗体发生结合性反应，产生可见沉淀。 用血清学反应检验金黄色葡萄球菌肠毒素，方法主要有： 免疫琼脂扩散法 反向间接血凝试验 免疫荧光法 酶联免役吸附法,血清学试验简介,血清学反应是指：相应的抗原与抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集现象。在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到的细菌，以最终确认检测结果。 血清学反应的一般特点： 1)抗原体的结合具有特异性，当有共同抗原体存在时，会出现交叉反应。 2)抗原体的结合是分子表面的结合，这种结合虽相当稳定，但是可逆的。 3)抗原体的结合是按一定比例进行的，只有比例适当时，才能出现可见反应。 4)血清学反应大体分为两个阶段进行，但其间无严格界限。第一阶段为抗原体特异性结合阶段，反应速度很快，只需几秒至几分钟反应即可完毕，但不出现肉眼可见现象。第二阶段为抗原体反应的可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合反应等。反应速度慢，需几分、几十分以至更长时间。而且，在第二阶段反应中，电解质、PH、温度等环境因素的变化，都直接影响血清学反应的结果。 习惯上将经典的血清学反应分三种类别：凝集反应、沉淀反应和补体结合反应。 、凝集反应 颗粒性抗原（细菌、红细胞等）与相应抗体结合，在电解质参与下所形成的肉眼可见的凝集现象，称为凝集反应（Agglutination reaction）。其中的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。在该反应中，因为单位体积抗体量大，做定量实验时，应稀释抗体。 ）直接凝集反应 颗粒性抗原与相应抗体直接结合所出现的反应，称为直接凝集反应(Direct agglution reaction)。 a.玻片凝集法。是一种常规的定性试验方法。原理是用已知抗体来检测未知抗原。常用于鉴定菌种、血型。如将含有痢疾杆菌抗体的血清与待检菌液各一滴，在玻片上混匀，数分种后若出现肉眼可见的凝集块，即阳性反应，证明该菌是痢疾杆菌。此法快速、简便，但不能进行定量测定。 b.试管凝集法。是一种定量试验方法。多用已知抗原来检测血清中有无相应抗体及其含量。常用于协助诊断某些传染病及进行流行病学调查。如肥达氏反应就是诊断伤寒、付伤寒的试管凝集试验。因为要测定抗体的含量，故将待检查的血清用等渗盐水倍比稀释成不同浓度，然后加入等量抗原，37或56，24小时观察，血清最高稀释度仍有明显凝集现象的，为该抗血清的凝集效价。 ）间接凝集反应 将可溶性抗原（抗体）先吸附在一种与免疫无关的，颗粒状微球表面，然后与相应抗体（抗原）作用，在有电解质存在的条件下，即可发生凝集，称为间接凝集反应(Indirect agglutination)。由于载体增大了可溶性抗原的反应面积。当载体上有少量抗原与抗体结合。就出现肉眼可见的反应，敏感性很高。 、沉淀反应 可溶性抗原与相应抗体结合，在有适量电解质存在下，经过一定时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应（Precipitation）。反应中的抗原称为沉淀原，抗体为沉淀素。由于在单位体积内抗原量大，为了不使抗原过剩，故应稀释抗原，并以抗原的稀释度作为沉淀反应的效价。 ）环状沉淀反应：是一种定性试验方法，可用已知抗体检测未知抗原。将已知抗体注入特制小试管中，然后沿管壁徐徐加入等量抗原，如抗原与抗体对应，则在两液界面出现白色的沉淀圆环。 ）絮状沉淀反应：将已知抗原与抗体在试管（如凹玻片）内混匀，如抗原抗体对应，而又二者比例适当时，会出现肉眼可见的絮状沉淀，此为阳性反应。 ）琼脂扩散试验：利用可溶性抗原抗体在半固体琼脂内扩散，若抗原抗体对应，且二者比例合适，在其扩散的某一部分就会出现白色的沉淀线。每对抗原抗体可形成一条沉淀线。有几对抗原抗体，就可分别形成几条沉淀线。琼脂扩散可分为单向扩散和双向扩散两种类型。单向扩散是一种定量试验。可用于免疫蛋白含量的测定。而双向扩散多用于定性试验。由于方法简便易行，常用于测定分析和鉴定复杂的抗原成分。 、补体结合反应 补体结合反应(Complement fixation reaction)是在补体参与下，以绵羊红细胞和溶血素作为指示系统的抗原抗体反应。补体无特异性，能与任何一组抗原抗体复合物结合而引起反应。如果补体与绵羊红细胞、溶血素的复合物结合，就会出现溶血现象，如果与细菌及相应抗体复合物结合，就会出现溶菌现象。因此，整个试验需要有补体、待检系统（已知抗体或抗原、未知抗原或抗体）及指示系统（绵羊细胞和溶血素）五种成份参加。其试验原理是补体不单独和抗原或抗体结合。如果出现溶菌，是补体与待检系统结合的结果，说明抗原抗体是相对应的，如果出现溶血，说明抗原抗体不相对应。此反应操作复杂，敏感性高，特异性强，能测出少量抗原和抗体，所以应用范围较广。,七金黄色葡萄球菌快速检测方法（简介）,目前，随着研究的深入，一些快速和采用现代技术的检测方法不断出现，这些新的快速方法，一般都缩短了传统检测方法的时间，能够较快地得到检测结果，并且操作相对简单。 比如：法国梅里埃公司生产的RPF试剂盒、API检测系统等。梅里埃公司生产的miniVIDAS利用荧光免疫的方法检测葡萄球菌肠毒素，在仪器上45分钟可以得到结果。 比如：美国3M公司生产的金黄色葡萄球菌快速检测试片，可以直接计数产生耐热核酸酶的金黄色葡萄球菌，操作简单，缩短了时间。,八金黄色葡萄球菌污染的控制,防止金黄色葡萄球菌污染食品