课件：酶组织化学概论.ppt

1,酶组织化学,Enzyme Histochemistry,2,概 述,1、酶（enzyme)：由活细胞产生，能在体内起催化作用的一类特异性蛋白质生物催化剂。,物质,E,A,B,D,C,酶 促 反 应,E,3,概 述,2、酶的命名：习惯命名法,4,概 述,3、酶的分类：按酶促反应的性质，国际生物化学 酶学会（EC）将酶分为六类，如下表：,EC编号 酶名 1 氧化还原酶（oxidoreductases) 2 转移酶（transferases) 3 水解酶（hydrolases) 4 裂解酶（lyases) 5 异构酶（isomerases) 6 连接酶或合成酶 （ligases or synthetases),5,一、组织化学显示酶的方法,（一）免疫组织化学（immunohistochemistry),胰岛B细胞,6,一、组织化学显示酶的方法,(二）酶组织化学（enzyme histochemistry),1、定义：酶组化是用组织化学的方法证明酶的存在的一门学科，其目的在于阐明组织细胞内的化学反应、功能及其生物学意义。,探讨其在生理或病理状态下形态与机能相结合的一门学科,7,2、研究化学物质的方法：,（1）将组织、细胞完全破坏和捣碎，进行检查。 生物化学方法。,（2）提取组织细胞内特殊组成成分或细胞器、膜系统以探讨其中存在的化学物质及其功能。 组织化学方法。,（3）不破坏组织细胞，保持其完整结构，使其中的化学物质在原位变成可见物质，了解其存在和功能。 细胞化学方法（酶组化）,8,二、酶组织化学的基本理论,（一）酶的定位 localization of enzyme,在一定组织细胞及细胞器的超微结构中存在着特定的酶，其存在的特定部位称为酶的定位。,细胞内酶的定位因酶的种类及细胞器不同而有差异，它们都有自己固定的位置。因此所采用的定位检查法必须准确。,酶 亚细胞部分 DNA核苷酸转移酶 核 SDH、CCO 线粒体 G-6-P 内质网 ACP 溶酶体 5-核苷酸 质膜 LDH 胞液,9,10,二、酶组织化学的基本理论,（二）酶反应,是在一定条件下，组织细胞内的酶作用于底物，将底物的分解产物作为反应产物，在作用部位进行捕捉，使其具有可见性。这种酶促反应称为组织化学酶反应（enzyme reaction of histochemistry),11,S：底物，酶具有只作用于该底物的性质称底物特异性 IRP（initial reaction product)：初级反应产物，指底物被酶直接分解的物质，不溶于水、脂类最为理想，以免发生扩散。 FRP(final reaction product)：最终反应产物，指不溶性IRP被偶联而显色。,12,三、光镜酶组织化学证明法,（一）金属-金属盐法（metal precipitation method),1、定义：指金、银、铜、铁、铝、钴等金属，其盐和化合物或其本身都具有颜色，容易发生呈色反应。而且酶的反应产物和金属多半可以结合。因此，捕捉酶反应的分解产物，使其与金属结合，利用其呈色反应，再现出酶反应的部位，以证明酶的存在。这类方法总称为金属-金属盐法或金属沉着法。大部分水解酶用此方法证明。,13,2、方法：三种,（1）第一种方法：Gomori和高松（1939）,14,如：证明碱性磷酸酶方法,用钴置换硫化钴法（CoS method) 用银置换硝酸银法或银反应法（silver method),15,（2）第二种方法： 是酶作用于酶底物后生成的分解产物与底物孵育液中的金属离子相结合，直接沉着于酶的反应部位，然后使其显色。反应式如下：,使用此种方法的条件是底物溶液中H+浓度为中性或弱酸性，常常利用易获得的硝酸铅或醋酸铅。因此本法常被用于ACP和在中性附近起作用的磷酸酯酶类。本法称为硫化铅法（PbS method),16,（3）第三种方法： 与使用天然底物的前两种方法不同，本法使用的是人工合成底物，在酶的作用下，底物的分解产物与特定的金属结合，立即显色，或通过显色操作使其显色，然后进行观察。,17,3、金属-金属盐法的优缺点,（1）优点： 底物、捕捉剂价格便宜。 金属离子容易反应， 沉着颗粒微细，反应色调 鲜明，反差比较明显。 （2）缺点： 易退色。 组织细胞中有些成分可吸附金属离子，产生假阳性反应。,铅法显示ACP,18,三、光镜酶组织化学证明法,（二）偶联偶氮色素法（coupling azo dye method) 或称偶氮色素法,1、定义：是用人工合成的酶底物，在酶的作用下，产生分解产物，后者与重氮盐结合，引起偶联偶氮反应，形成不溶性的偶氮色素，以此证明酶的定位。,S,E,P,+,N,偶联偶氮反应,偶氮色素,19,偶氮色素的颜色由重氮盐的种类所决定。 如：坚牢蓝B蓝色 坚牢红TR红色 坚牢蓝VB褐色,肾小管中的碱性磷酸酶,20,3、偶联偶氮色素法优、缺点 （1）优点： 正常组织细胞中无此底物。 作用时间短，不易发生酶的丢失。 不易褪色。 （2）缺点： 底物价格昂贵。 底物的分解产物有不同程度的扩散。 重氮盐有不同程度的抑制酶活性作用。故必须选用抑制作用最弱的种类使用。,肝细胞中的ACP,21,4、方法： （1）同时偶联法：这种偶联法，是在底物混合液中，通过酶的分解作用所得到的沉着物，立即形成重氮化合物和偶氮色素。 （2）后偶联法：该方法是为了防止重氮盐对酶的抑制作用，先使酶在底物内发生作用，使分解产物沉着，然后再浸渍于重氮盐液中，使其形成偶氮色素。 以上两种偶氮色素形成的原理完全相同。 由于偶氮色素法的开展，某些用金属-金属盐法不能证明的酶，现在能够证明了。此法已被广泛使用。,22,三、光镜酶组织化学证明法,（三）色素形成法（pigment formation method),这是一组显示酶定位的证明法，它与偶氮色素法不同，在酶的作用下，使无色的化学物质在局部形成色素而沉着。这种方法统称色素形成法。,23,1、四唑盐法 tetrazolium method,（1）定义：在含有四唑盐或双四唑盐的底物混合液中，在脱氢酶的作用下，从底物分离出来的氢原子与无色四唑盐或双四唑盐结合形成红色或蓝色的甲簪（formazan）或二甲簪（difomazan）色素。这种色素沉着于酶作用的所在部位因而得知酶的定位。该法主要证明各种脱氢酶 。,24,（2）四唑盐的种类 三苯四唑氯化物（TTC） 蓝四唑盐（BT） 新四唑盐（NT） 硝基蓝四唑盐（Nitro-BT) 四氯四唑蓝氯化物（TNBT）,是脂溶性的，能共染组织细胞中的脂肪。,25,肾小管中的SDH,心肌中的LDH,26,2、靛酚蓝法 indophenol blue method,Nadi反应,是用于检测氧化酶的方法。把二甲基-对-苯二胺和-萘酚加入底物混合液中，由酶作用而释放的氧与此二者结合，形成靛酚蓝，而显示出酶的定位。 有人使用的新的Nadi法，既以4-氨基-N、N-二甲基萘胺（AND）代替二甲基-对-苯二胺。本法也适用于证明细胞色素氧化酶和过氧化物酶。,27,肾小管中的细胞色素氧化酶,28,本法主要是以酯型吲哚酚化合物为酶的底物，在酶的作用下，分解出吲哚酚；在氧存在的情况下形成蓝色靛蓝，于酶所在部位显色。此法又称吲哚酚法（indoxyl method）。,酯型吲哚酚化合物: 磷酸吲哚酚 醋酸吲哚酚 丁酰吲哚酚,验证磷酸酶、酯酶等。,3、靛兰形成法（靛蓝法）indigo formation method:,29,肾间质细胞中的酯酶,30,四、酶组织化学的基本条件,用组织化学方法在组织细胞内证明酶，重要的是要具备三个条件： 第一：保存细胞结构（preservation of structure)。 第二：保存酶（preservation of enzyme)。 第三：保存定位（preservation of localization)。,31,（一）生物化学方面的要求,酶组织化学的基础是组织化学，而化学反应又是组织化学的基础。所以化学反应的各种条件和影响化学反应的各种因素都要考虑到。 酶是一种催化剂，但其并不参与化学反应本身，只是起到加强酶组织化学反应，显示出酶活性的高低的作用。影响酶活性的因素有多种，如底物的浓度、反应产物的强弱、温度、pH值和试剂质量等。同一种酶，在不同条件下，所显示酶的活性可以相差悬殊。因此，在进行酶组织化学研究时，应极其重视化学反应的良好程度，严格控制实验条件，这样才能对获得的结果作出科学的判断和分析。,32,（二）形态学方面的要求,1、尽可能保持组织细胞生活时的形态和结构。 2、尽可能保持组织细胞生活时的化学成分和酶的活性。 3、染色法是已知的化学反应，各种条件均可控制。 4、反应产物是一种有色的沉着物， 颗粒要细，并能保留在原位。其颜 色深度与物质含量或酶活性具有一 定量效关系。 5、显示的可视物质必须具有稳定性， 以利于反复观察。 6、反应产物要具有特异性。,肿瘤细胞SDH：四唑盐法,33,（三）酶组织化学的局限性,1、定位方面的局限性： 酶组织化学要求是使某一物质在原位上显示出来。但由于吸附、弥散和溶解等现象，其定位的改变或假定位是多见的，给分析结果带来很大困难。在进行酶组化染色反应时，用恒冷箱切片法、控制孵育条件、温度、pH值和时间可防止反应产物扩散。,34,影响酶定位的因素,35,2、定性方面的局限性：,由于组化是利用已知的化学反应来显示细胞内化学成分的性质，所以它具有特异的定性的优越性。但同样有局限性。,（1）非特异性的问题：有些方法的原理是根据某些特殊基团或某些特性，不可避免地造成一些非特异性染色。 （2）定位的不精确：如PAS法显示糖原。 （3）有些物质被掩盖，不能全部显示出来。如隐式脂肪。 为了确切定位，组化染色反应中，必须有对照试验。可以极大的提高定性的可靠性。,36,3、定量方面的局限性：,（1）原因：定量不精确是酶组化的最大局限性，它不同于试管中的化学分析，而是在极复杂的细胞微环境内进行化学反应，所要研究的物质或酶的活性，均受到细胞内其他物质和细胞外各种因素的影响。有些因素的性质不明，难以控制。组化反应产物都呈现可视的有色沉着物，存在于细胞内不均匀的复杂结构中，不可能像化学反应在试管中得到的均质的产物，也不可能进行精密的光谱吸收分析。,37,常用的组化定量方法使用加号与积分法表示的。以中性粒细胞中碱性磷酸酶活性的评级说明。,（2）定量方法：,38,ALP活性可以用阳性率或阳性强度表示。但阳性率不能鉴别两种不同状态。因此需用积分法表示阳性强度，才能作出准确判断。见下表：,用阳性率表示时，无区别；用积分法表示后，发现呈显著区别。此法是估量法半定量技术。,0,20,39,（3）发展趋势：,一是更精确的定位：电镜细胞化学 二是更专一的定位：免疫组织化学 三是更准确的定量：定量细胞化学,（4）定量细胞化学目前常用的仪器与技术： 显微分光光度计、显微荧光光度计、流式细胞光度计、电镜X射线显微定量分析技术、激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）以及图像分析技术等。,40,五、影响酶活性的基本条件,酶组织化学方法的四个步骤： 第一 ：酶的固定(fixation)。 第二：酶的特异性反应（specific reaction)。 第三：在最适条件下，酶反应产物沉着(pricipitation)。 第四：使沉着产物具有可见性(visualization)。,41,组织、细胞标本的制备步骤,42,(一）固定和切片标本的制作,1、固定剂的性质： （1）既要保持组织细胞的微细结构又要保持酶的活性。 （2）既不能溶解酶也不能使酶活性部位发生移位。 （3）既不能抑制酶反应也不能 和其它步骤使用的试剂发生反应， 引起人为的产物。 因此要根据酶的不同性质 选择固定液的种类。酶对任何固定 液都是敏感的。,43,2、固定对酶活性的影响：,44,3、切片厚度对酶活性的影响,切片厚度：60m时容易出现人工假象，浸透速度减慢。切片的厚度在40m以下时，反应液在切片内部渗透均匀，并较为彻底，切片也能得到充分的漂洗。 （2）孵育液的扩散常数与浓度决定着从组织外向组织内的渗透速度，如捕捉剂Pb2+在50m厚的切片孵育时，需时1分钟才能达到内部，因此切片宜薄不宜厚。,45,（二）缓冲液的选择和调节机制,1、缓冲液的作用： 缓冲液具有缓冲机体外来少量强酸和少量强碱而不易引起溶液pH值改变的作用。所以组织化学孵育液或染液都必须用缓冲液配制，以保证其适宜的pH值。 缓冲液之所以具有缓冲作用，是因为它同时含有足量的对抗外来强酸和强碱的组分。这种成对的物质组分，合称为缓冲系或缓冲对。缓冲液就是由缓冲对组成的液体，例如磷酸二氢钠和磷酸氢二钠这组缓冲对组成了磷酸缓冲液。,46,2、缓冲液的种类与选择,酶组织化学所需缓冲液种类很多，常用的有醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、Tris缓冲液和二甲砷酸缓冲液等。 使用时可根据所要显示的酶类，选择使用不同的缓冲液。如有钙离子存在时，最好不用磷酸缓冲液，不然易发生非酶反应；Tris是属于氨基的缓冲液，因氨基与醛基易发生化学反应，故二者不能在一起使用。,-CHO,Ca2+,47,（三）温度对酶反应速度的影响,酶促反应也有一个最适温度，在最适温度的两侧其反应速度都比较低。人体组织细胞中最适温度一般为37左右。部分酶反应在430之间仍存有酶活性反应，但其反应速度常是缓慢的。,48,（四）pH值对酶反应的影响,1、最适pH值：pH值在酶反应过程中有着极其重要的影响。在一定pH值下，酶促反应具有最大速度，称此pH值为酶促反应最适pH值 （optimal pH）。,以最适pH值为中心，高于或低于最适pH值时，酶反应速度均下降。,49,最适pH值有时可因底物种类、浓度及缓冲液的类型的不同而产生改变，最适pH值不是一个常数。大多数酶的最适pH值是在内环境的pH值范围内。,2、几种酶的pH值：,50,3、pH值影响酶活性的原因,（1）pH过低或过高均会影响酶分子的构型，甚至使酶变性、失活。 （2）酶的活性中心一般只有一种离解状态最有利于底物结合，在此pH值下，酶活性最高，是最适pH值。 （3）pH值会影响底物、酶底物复合物的离解状态。,51,（五）捕捉剂 capture,在酶组织化学反应过程中，捕捉剂对酶反应结果具有极其重要的作用。捕捉剂是十分严格的，没有捕捉剂就不能形成最终产物，而且它既能促使高效率地进行反应，又不剧烈地损害酶的活性。捕捉剂有Pb2+、Cu2+、Ba2+等，Pb2+已广泛应用于磷酸酶、酯酶和转移酶等酶反应中。,52,Pb2+作为捕捉剂的优缺点,53,（六）激活剂 activator,凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。激活剂的种类较多，可分为三大类： 1、离子：多为金属离子。有时一种激活剂对某种酶能起激活作用，对另一种酶可能起抑制作用；有时离子间也有拮抗现象。如Na+ 抑制K+的激活作用；Mg2+激活的酶则常被所Ca2+抑制。 2、小分子化合物：某些还原剂，如半胱氨酸、还原型谷胱甘肽等能使酶分子中的双硫键还原成硫氢基，从而提高酶活性。 3、激活酶：这类激活剂是指可使某些无活性的酶原，变成有活性的酶。,54,(七）抑制剂 inhibitor,是指某些物质在不引起酶蛋白变性的情况下，使酶活性减弱，抑制酶的活力，甚至消失，这样的物质称为抑制剂。抑制剂一般可分为三种： 1、特异性抑制剂：作用于酶分子中的活性基团，如毒扁豆碱，对乙酰胆碱酯酶的抑制作用。 2、非特异性抑制剂：大多数的抑制作用是基于使酶蛋白变性，如加热对所有酶均有一定的破坏作用。 3、常用的抑制剂：有氟化钠、氰化钠、叠氮钠、硝酸镧、硫化钡、半胱氨酸、EDTA等。,55,六、对照实验,1、用抑制剂确认酶活性对照实验：用酶活性的抑制剂确认酶活性受到抑制，这是对照实验的一种重要方法。 2、除去底物对照实验：用去底物的孵育液进行反应，确认反应消失或明显减弱。这是一种常用的酶组织化学反应的对照方法。 3、