课件：外源基因表达与基因工程药物.ppt

第十章外源基因表达与基因工程药物,第一节 概 述,外源基因的表达：利用细胞内相关酶系及其调控系统，将外源基因转录成肽链或加工成活性蛋白质的过程。 具体的说，利用分子生物学技术，在体外将编码外源蛋白质的基因重组至适宜的表达载体上，通过相关技术将其导入宿主细胞内，借助宿主细胞的转录、翻译或翻译后修饰酶系及相应的调控系统，在宿主细胞合成或分泌具有原有生物活性的蛋白质。,目的：针对难以或无法从自然界直接提取、分离、纯化所获得的，或制造成本、产量规模等受限制的，或利用化学方法无法合成的多肽，蛋白质、酶这类生物分子药物，利用细胞或组织或器官或生命体的复制、转录、翻译及其调控系统以及翻译后加工、修饰等体系，按人的意愿生物合成这些生物分子，并从中将表达产物分离纯化至预期程度，最终加工成药品。,基因工程概念,基因工程(genetic engineering）是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程，从而改变生物特性或创造新的生物类型的技术,基因工程的发展史,一、基因表达基本原理,基因表达(gene expression)是指储存遗传信息的基因在各种调节机制下经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录和翻译，产生有生物活性的蛋白质过程。,基因工程技术的核心是基因表达技术。,基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达。,基因表达在原核生物与真核生物中的差别,原核生物与真核生物肽链合成过程的主要差别,蛋白质合成的特点,1.真核生物的蛋白质合成与mRNA的转录分开进行 原核生物的蛋白质合成与mRNA的转录偶联在一起同时进行 2.真核生物中的mRNA为单顺反子 原核生物中的mRNA为多顺反子 3.真核生物合成体系中的RNA和蛋白质在结构上与原核生物不同，且其线粒体有独立的蛋白质生物合成体系,阻遏蛋白介导的负调控和cAMP-CAP介导的正调控共同担负着原核生物体内糖源的协调利用 翻译水平的调控是对原核生物转录水平的补充 1.转录与翻译的偶联提高了基因表达调控的有效性 2.SD序列影响翻译起始速率 3.翻译阻遏利用蛋白与自身mRNA的结合实现翻译起始的调控 4.mRNA密码子的编码频率影响翻译的延伸速度,基因表达调控的影响因素,原核生物,（一）真核生物染色质结构影响基因转录 1.转录活化的染色质对核酸酶极为敏感 2.转录活化的染色质的组蛋白发生改变 3.RNA聚合酶结合位点的上游和下游具有不同的超螺旋构象 4.CpG岛甲基化水平降低 （二）顺式作用原件（启动子、增强子和沉默子）直接影响基因表达活性 （三）转录因子的调控 （四）真核生物在转录后仍可控制mRNA的结构和功能，其在转录后层次不同于原核生物,基因表达调控的影响因素,真核生物,二、基因表达基本类型,第二节外源基因表达基本过程,将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达 【四个要素】 工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞,基因工程的基本过程,目的基因的获取：从生物体中分离或人工合成 重组载体的构建：对目的基因和载体DNA进行剪切、修饰，在连接酶的作用下连接形成完整有复制能力的重组体 重组DNA分子导入合适的受体细胞：重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增,基因工程的基本过程,重组体的筛选与鉴定：直接筛选法(如抗药标志选择)和免疫学方法 目的基因的表达及分离纯化：原核与真核表达,一、目的基因的获得,外源基因表达的第一步是获得目的基因 获得目的基因的主要方法包括： 化学合成 RT-PCR从含有目的基因的总RNA或mRNA中扩增 从cDNA文库或基因组文库中PCR扩增 通过杂交技术筛选 利用合适的筛淘技术从各种文库中筛选,聚合酶链式反应(PCR),PCR（polymerase chain reaction）: 在体外由引物介导的、酶促快速合成扩增特定基因或DNA片段的一种方法。,原理 在适当缓冲液（Mg2+）反应体系中，根据碱基配对原理利用DNA聚合酶催化和dNTPs的参与下，引物依赖于DNA模板特性指导DNA合成,基本步骤,变性：双链DNA解离成为单链(90以上) 退火(复性)：引物与模板DNA单链的互补序列配对结合（50 左右） 延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对原则，合成一条新的互补链 （70 左右）,PCR反应五要素,引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ PCR反应的特异性决定因素： 引物与模板DNA特异正确的结合 碱基配对原则 Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性 靶基因的特异性与保守性,PCR的应用,研究基因克隆；DNA测序；分析突变 诊断细菌、病毒、寄生虫检测及诊断 人类基因组工程遗传图谱的构建；DNA测序；表达图谱 法医犯罪现场标本分析 肿瘤各种肿瘤检测 其他,二、目的基因与表达载体的重组,重组载体的构建：对目的基因和载体DNA进行剪切、修饰，在连接酶的作用下连接形成完整有复制能力的重组体。,（一）载体,对于外源基因的表达，第二个问题就是选择合适的表达载体并将目的基因重组至表达载体上。 表达载体主要包括：质粒载体、噬菌体或病毒载体。 表达载体是目的基因在宿主细胞中遗传、转录、翻译以及可能的翻译后修饰加工的保障。,基因工程载体的基本条件,能在宿主细胞中复制繁殖 容易进入宿主细胞 有合适的限制性核酸内切酶位点，容易插入外来核酸片段，插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制 有容易被识别筛选的标志 容易从宿主细胞中分离纯化出来,基因工程载体分类,根据载体的分子生物学特性划分 质粒型载体环状dsDNA分子，自主复制 病毒型载体环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒 混合型载体具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性,根据载体功能划分： 克隆载体质粒、噬菌体、粘性质粒、M13噬菌体 表达载体大肠杆菌表达载体、哺乳动物细胞表达载体,常用载体,质粒(plasmid) 独立于细菌染色体以外的遗传物质，能够自我复制的双链闭合环状DNA分子,质粒的特点,大多数质粒DNA是是环状双链的DNA分子 复制类型分为严紧型和松弛型 有共价闭合环形、开环和线性三种构型 泳动速度：SCDNA LDNA OCDNA 质粒具有不相容性 具有转移现象和迁移作用,pBR322质粒,分子量较小。 两种抗菌素抗性基因 较高的拷贝数，且经氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积10003000个拷贝 对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点,pUC质粒,多克隆位点； 松弛复制； 氨苄青酶素抗性； 可通过化学显色筛选, 噬菌体载体,特点 双链DNA分子（线性或环形） 两端具有12个nt单链互补粘性末端 具非必需区（中间区约1/3长度） 可在E.Coli中大量繁殖 可克隆15Kb左右的外源基因,载体类型 （两种） 插入型载体：外源DNA克隆到分子上，使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即插入失活效应 取代型载体（替换型载体）：提高了克隆外源DNA的能力,M13噬菌体(M13 phage),只感染有F性菌毛的大肠杆菌噬菌体 基因组DNA全长6.5kb（单链） 感染后，可复制成双链DNA（RF，DNA） RF只有（+）链复制，相当于质粒载体,M13噬菌体载体,优点： 既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。 缺点：插入大的DNA片段后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之内，克隆300-400bp的片段十分稳定。,粘尾质粒(cosmid),由DNA的两端粘性末端区域(COS区)与质粒构建的环状双链DNA 特点: 含质粒的抗性标记如Amp，Tet 带COS区，可进行体外包装 一个或多个酶切位点 加入特异性启动子利于双向转录 分子量小，容量大 /筛选AP平板 粘性DNA质粒接上能在真核细胞生活的元件则能在真核中转染及筛选,大容量载体,细菌人工染色体(BACs): E.coli F质粒，供体DNA300kb,用于大基因组分析 P1人工染色体(PACs)：噬菌体P1，需要体外包装盒转导，供体DNA约100kb,用于大基因组分析 酵母人工染色体(YACs)：酿酒酵母着丝粒、端粒和自主复制序列，供体DNA2000kb,用于大基因组分析和YAC转基因动物,质粒的构建策略,质粒载体必需的三个部分 复制区：含有复制起点； 选择标记：抗性基因； 克隆位点：便于外源DNA的插入,质粒的构建策略,缩短载体长度，扩充载体容纳能力 合理增加酶切位点数目，形成多克隆位点 引入多用途辅助序列，提供质粒新特 设计具有特殊选择标记，最好是能够赋予宿主易于检测的表型,穿梭载体(shuttle vector),能在两种不同的生物中复制的载体,具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因 有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状 具有多克隆位点 在细菌中用于扩增克隆的基因 在真核生物中用于基因表达分析,穿梭载体(shuttle vector),表达载体 （Expression vectors）,真核细胞载体,哺乳动物细胞的病毒载体 含有原核基因序列即：复制子和抗性基因 含有哺乳动物细胞启动子和增强元件使外源基因有效转录 转录终止信号和poly(A)信号 含有可选择的剪切信号 含有一个以上的限制性酶切位点,真核细胞载体,酵母载体 组成遗传标记；调控序列（ARS、环状质粒DNA、启动子）；由质粒DNA与酵母DNA重组的穿梭质粒 杆状病毒载体昆虫细胞多角病毒载体 具有蛋白修饰、加工和转运体系 产物可溶性表达 适于克隆大片外源DNA 不侵染脊椎动物,（二）重组,体外重组技术的建立是建立在一系列可以在体外应用的DNA限制性内切酶和DNA连接酶，以及PCR技术的推广。 目的基因和载体DNA分子的体外重组关键在于：选择合适的重组位点、剪切位点；以及剪切后适当的条件将目的基因和载体DNA分子连接获得重组分子。,基因工程相关酶学,限制性核酸内切酶,具有识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶,型：修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性 型：内切酶活性和修饰酶活性，专一性强。既具有切割位点的专一性, 也具有识别位点的专一性, 一般在识别序列内切割 型：作用方式同型,命名方式,型限制性核酸内切酶,基本特性 识别ds-DNA中含-8个相连的碱基对组成的特定回文序列 断裂后形成的DNA片段具有互补碱基的单链延伸末端（粘性末端）或平末端,5 C T G C A G 3 3 G A C G T C 5,5 G G A T C C 3 3 C C T A G G 5,5 G A T C 3 3 C T A G 5,5 G G C C 3 3 C C G G 5,Hae,Mbo,BamH,Pst,II型限制性内切核酸酶,几种II型限制性核酸内切酶的 酶切位点,同裂酶(isoschizomer)来源不同, 识别和切割位点相同 同尾酶(isoaudamers)来源、识别序列和切割方式均不相同，但产生的限制性片段却是相同的粘性末端,限制性内切酶对DNA的消化作用及其片段化 消化作用以同型二聚体形式与靶DNA序列作用，所识别的靶序列大小决定着DNA片段的大小 片段化:单酶切、双酶切、一部分酶切 具有粘性末端DNA片段的连接 不同的DNA片段通过互补的粘性末端配对连接分子间连接 同一片段的两个互补末端之间碱基配对形成环形分子内连接,载体与目的片段连接,影响限制性内切酶活性的因素 DNA的纯度 DNA甲基化程度 底物DNA的分子构型 反应温度 反应系统组成 酶量、反应体积、酶切时间,限制酶的用途 DNA重组与构建新基因组文库 组建DNA物理图谱 DNA 分子杂交 制备DNA放射性探针 DNA序列分析,DNA连接酶,封闭DNA链上缺口酶，借助能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。用于DNA重组和质粒的构建,大肠杆菌DNA连接酶：只能连接具粘性末端DNA分子，以NAD作辅助因子 T4 DNA连接酶：连接粘性末端，高浓度可连接平末端，要求3-OH和5-PO4 。催化过程需要ATP和Mg,聚合酶,以DNA(RNA)为模板，催化DNA(RNA)的体外合成,特点： 以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA 需要模板和引物的存在 不能起始合成新的DNA链 催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端 催化DNA合成的方向是53,聚合酶的分类及特点,大肠杆菌DNA聚合酶： 53的聚合作用 3 5 的外切酶活性 53外切酶活性 Klenow 聚合酶： 53聚合酶活性 3 5 外切酶活性 没有53外切酶活性 用于填补DNA单链末端成为双链,聚合酶的分类及特点,T4-DNA聚合酶 ：无53外切酶活性 、需要一条有引物的单链DNA作模板 、 3 5 外切酶活性 Taq DNA 聚合酶： 53聚合酶活性 53外切酶活性，有链置换合成能力 不具有3 5 外切酶活性，没有校正功能 良好的热稳定性 用于DNA序列分析和PCR反应,逆转录酶（reversetranscriptase）,两类：禽类成骨细胞性白血病病毒逆转录酶(AMV) moloney小鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV) 作用： 以RNA为模板合成DNA,构建cDNA文库 RT-PCR 制备杂交探针,以RNA为模板合成DNA的酶( RNA指导的DNA聚合酶),碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）： 去除DNA /RNA 5-P，制备载体时可防止载体自身连接， 提高重组效率 末端脱氧核苷酰转移酶： 在DNA的3-OH上，加上 dNTP,DNA和RNA的修饰酶,载体DNA与目的基因的连接,粘性末端连接 平末端连接 同聚物接尾连接 接头连接法,宿主系统,用于基因转移的受体菌或细胞 受体细胞应具备的条件 各种基因工程受体的特性 实验室常用的基因工程受体,受体细胞应具备的条件,限制性缺陷型 外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-） 重组整合缺陷型 用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-） 具有较高的转化效率 具有与载体选择标记互补的表型 感染寄生缺陷型 防止重组细菌扩散污染，生物武器除,对于表达用宿主细胞还应该有： 有较好的翻译后加工机制 蛋白水解酶基因缺陷或表达水平低，以减少外源蛋白的降解实现高效表达,各种基因工程受体的特性,大肠杆菌 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子 产结构复杂、种类繁多的内毒素 适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌,各种基因工程受体的特性,枯草杆菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全，生长迅速，培养简单，不产内毒素 遗传欠稳定，载体受体系统欠完备 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌,各种基因工程受体的特性,链霉菌 抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素 主要用于抗生素生产菌株的改良 遗传不稳定，生长相对缓慢,各种基因工程受体的特性,酵母菌 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定 内源性蛋白产物种类繁多且含量高 适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌,各种基因工程受体的特性,昆虫细胞（家蚕） 具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定 DNA重组操作系统欠完善 适用于真核生物基因的高效表达,各种基因工程受体的特性,哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞CHO） 与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统 细胞培养条件苛刻，生长缓慢 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体,各种基因工程受体的特性,植物细胞（拟南芥菜、烟叶） 农作物的经济意义重大，转基因植物细胞易于分化，细胞培养简单且成本低廉，具有光合作用 遗传操作繁琐 适用于高等植物基因表达调控的研究、基因药物的生产，农作物品质的改良,Types of host cell used for gentic engineering,重组分子引入受体细胞,转化(transformation):将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞的过程 转染(transfection):由噬菌体或病毒介导外源DNA进入宿主细胞的过程 感受态(competence):细胞在一定生理状态时可摄取外源性遗传物质，并使受体细胞产生新的遗传性状,重组DNA导入哺乳动物细胞,显微注射 DNA-磷酸钙转染法 DEAE葡聚糖转染法 阳性脂质体及其介导的基因转染 电穿孔法,重组体的鉴定和分析,生物学方法：表型筛选、抗药性、缺陷基因的功能互补表型、噬菌斑的变化、报告基因 免疫学方法：放免、化学方法、显色反应 核酸杂交法：Southern, Northern、菌落原位杂交 PCR技术 限制性酶切鉴定 测序,目的基因表达,一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响,绝大多数的基因工程研究是以获得基因表达产物为目标。在构建重组体DNA分子和选择宿主细胞时，还须考虑外源基因表达的问题。 要求外来的基因在宿主细胞中能够准确地转录和翻译，所产生的蛋白质在宿主细胞中不被分解，而且最好还能分泌到细胞外。,不论基因工程的研究目的如何，最终均涉及到目的基因的表达问题。,当基因工程的目的为研究基因结构与功能的关系时，需将天然的或人工突变的基因片段插入含有一定报告基因的载体的适当部位，比较天然基因与突变基因对表达水平的影响，从而分析目的基因的结构与功能的关系。,外源基因是否插入在正确的阅读框架； 目的基因的有效转录（如启动子的作用）； mRNA的有效翻译（如SD序列等作用）； 转录后，翻译后的适当的修饰和加工过程。,制约目的基因表达的因素,一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响,阅读框架是由每三个核苷酸为一组联接起来的编码序列。外源基因只有在它与载体DNA的起始密码相吻合时，才算处于正确的阅读框架之中。 构建一组载体，使每个载体与相对于起始密码ATG的转译位相的位点不同，分别与外源目的基因拼接，即可获得所有可能的三位位相，其中必有一种位相可以保证外源基因处于正确的阅读框架中。,用人工接头可以调节阅读框架。市售的同一酶切点的人工接头一般都有三种长度，经与DNA片段连接，并切割成黏性末端后，各相差一个核苷酸。 因此，选择适当的人工接头，就可使外源基因处于正确的阅读框架中。,为了使外源基因表达，需要在基因编码顺序的5端有能被宿主细胞识别的启动基因顺序以及核糖体的结合顺序。 两种常用的方法能用来使外源基因在宿主细胞中顺利地表达： 1) 在形成重组体DNA分子时，载体的启动基因顺序和核糖体结合顺序后面的适当位置上连接外源基因。 2) 将外源基因插入到载体的结构基因中的适当位置上，转录和翻译的结果将产生一个融合蛋白。这种融合蛋白质被提纯后，还要准确地将两部分分开，才能获得所需要的蛋白质。,一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响,原核细胞的转录过程中，决定外源基因表达的关键因素是外源基因必须在载体DNA的启动子控制之下，而且启动子又能被宿主细胞中的RNA聚合酶有效识别。,Roberts等(1979)构建了一系列重组质粒，各种质粒之间的区别仅在于启动子和结构基因cro之间的距离不同。将这些不同的重组质粒转化大肠杆菌后，发现cro蛋白质的水平在重组质粒间相差悬殊，最高值比最低值大2000倍。,启动子与结构基因之间的距离在蛋白质翻译上有巨大作用。,启动子有强弱之分，强启动子指导产生较多量的mRNA，弱启动子指导下转录合成的mRNA很少。启动子的强度主要决定于启动子的结构。 在原核生物表达系统中，通常使用的可调控的强启动子有lac(乳糖启动子)、trp(色氨酸启动子)、PL和PR(噬菌体的左向和右向启动子)以及tac(乳糖和色氨酸的杂合启动子)等。 为了在原核细胞中表达真核基因，必须将其克隆在原核启动子的下游，才能在原核表达系统中被转录。,一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响,若干非必须的转录本的合成，会使细胞消耗巨大的能量用于制造大量非必须的蛋白质； 在转录本上有可能形成一些不期望其出现的二级结构，从而降低了转译的效率； 偶然会出现启动子阻塞现象，即克隆基因启动子所开始的转录干扰另一个必要的基因或调节基因的转译。,克隆基因末端的转录终止区的存在，可避免以下几种不利现象：,有些强启动子会通读，干扰质粒的复制，结果使质粒的拷贝数反而下降。 所以，在基因内部的适当位置上存在着转录的终止区，就能够保证使质粒的拷贝数（也就是基因的表达效率）控制在一个正常的水平上。,一、制约目的基因表达的因素 二、阅读框架 三、启动子的影响 四、终止子的影响 五、翻译过程对表达的影响,原核细胞在翻译水平上的调控是不严格的，只有RNA和核糖体的结合才是蛋白质合成的关键。,影响翻译效率的因素主要有：,1) SD序列与rRNA的16S亚基3端序列的互补程度，是影响翻译效率的主要因素。,2) 起始密码AUG与SD序列之间的距离以及SD序列的核苷酸组成也影响翻译能力。,连接在SD序列后面的4个碱基成分的改变也会对转译效率发生很大的影响。如果这个区域是由4个A(T)碱基组成，其转译作用最为有效；而当这个区域是由4个C碱基或4个G碱基组成，其转译效率只及最高转译效率的50或25。,3) 起始密码之后的一个核苷酸对mRNA与核糖体的结合也有影响；直接位于起始密码子AUG左侧的密码三联体的碱基组成，同样会对转译的效率发生影响。,例如-半乳糖苷酶的转译，当AUG左侧的密码三联体为UAU或CUU时，其转译最为有效；而如果是UUC，UCA或AGG，那么它的转译水平将下降20倍。,4)翻译的起始包括活化的30S核糖体亚基和mRNA5末端区域间的互作，这时mRNA的5末端已折叠成特殊的二级结构，基因表达水平的改变是mRNA二级结构的反映。,翻译的起始是决定翻译水平高低的一个重要因素。由于紧随起始密码下游的几组密码子不同，可使基因的表达效率相差1520倍。这主要是改善了翻译的起始和mRNA的二级结构。,5) 基因末端的转录终止区的影响。 外源末端除要安装好的启动子，还要注意终止区的设置。,第二部分,重组基因工程药物,一、重组人胰岛素及其突变体,1921年，Banting FG等从胰脏中分离 1955年，Sanger F测序 1965年，我国完成结晶牛胰岛素全合成 1979年，Rutter W等克隆了胰岛素基因 1982年，第一个重组人胰岛素批准上市,胰岛素种类,（一）按来源不同分类 1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。 2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。 3、生物合成人胰岛素：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。,（二）按药效时间长短分类 1、超短效：注射后15分钟起作用，高峰浓度1-2小时。 2、短效（速效）：注射后30分钟起作用，高峰浓度2-4小时，持续5-8小时。 3、中效（低鱼精蛋白锌胰岛素）：注射后2-4小时起效，高峰浓度6-12小时，持续 24-28小时。 4、长效（鱼精蛋白锌胰岛素）：注射后4-6小时起效，高峰浓度4-20小时，持续24-36小时。 5、预混：即将短效与中效预先混合，可一次注射，且起效快（30分钟），持续时间长达16-20小时。市场有30%短效和70%中效预混，和短、中效各占50%的预混两种。,（三）按胰岛素纯度分类 1、结晶胰岛素：纯度为95%。含有较多的胰岛素原、胰多肽、生长激素、胰蛋白酶等杂质，因而具有致敏性与抗原性，久用后可引起过敏反应，胰岛素抗体等。主要是从动物胰腺提取经结晶方式产生的胰岛素。 2、单峰胰岛素：将结晶胰岛素进行层析，剔除含胰蛋白酶的A峰与胰岛素原的B峰，仅取含胰岛素的C峰，使纯度达98%。 3、单组分胰岛素：将单峰胰岛素再经离子交换树脂处理而取得更纯的胰岛素为单组分胰岛素，纯度在99%以上。 4、人胰岛素：不论半合成人胰岛素或生物合成胰岛素，其结构、功能与人体内生胰岛素完全一致。故免疫原性最小，效果更好 。,胰岛素的结构及生物合成 胰岛素原与胰岛素 人胰岛素的生产方法 产人胰岛素大肠杆菌工程菌的构建策略,(a) AB链分别表达法 体外折叠成功率低，通常只有1020 (b) 人胰岛素原表达法 由于C肽的存在，胰岛素原在复性条件下能形成天然的空间构象，为三对二硫键的正确配对提供了良好的条件，使得体外折叠率高达80以上 目前Ely Lily用这种工艺路线年产几十吨的重组人胰岛素，其经济效益相当可观。 (c) AB链同时表达法,速效胰岛素,特点： 起效快，皮下注射后15分钟起效。 达峰快，注射后15分钟起效，3060分钟达到药效高峰。 药效维持时间短，大约在3小时左右（24小时）。,药代动力学