课件：第十八章临床标本的细菌学检验.ppt

第十八章,临床常见标本的细菌学检验,常见临床标本,1、血液 2、尿液 3、粪便 4、 4、脓汁 5、痰 6、穿刺液（胸水、腹水、心包液、关节液、脑脊液） 7、胆汁 8、咽拭子,标本采集的基本原则,尽早采集 病程早期、急性期、症状典型时、抗生素治疗前 无菌采集 标本容器须灭菌处理，但不得使用消毒剂 选择合适方法采集 适量采集 肠热症患者，病程第1周采集血液、第2周粪便、 第3周尿液 安全采集 注意防止污染、避免自身感染 标本的运送 采样后立即送检，一般不超过1h 痰、尿标本应保存在4；脑脊液、滑膜液应25保存,检验的基本程序,初次分离选用的培养基类别,血液、骨髓 先增菌后接种血、巧、中 胸腹水 先增菌后接种血、巧、中 脑脊液 先增菌后接种血、巧、中 胆汁 先增菌后接种血、中 尿液 接种血、中 粪便 接种SS、中 痰 、咽拭子 接种血、巧、中 脓、伤口分泌物 接种血、巧、中 白喉棒状杆菌 接种血、胱氨酸亚碲酸钾血琼脂 淋病奈瑟菌 接种血、MTM 真菌 沙保罗琼脂,检验的报告方式,初步报告方式 涂片染色、直接镜检 从染色性、基本形态、排列方式几方面报告 阳性结果： 检出XX性XX菌，形似XX菌 找到XX性XX菌 找到真菌菌丝和孢子 阴性结果：未找到或未检出细菌 未查到抗酸杆菌 未发现真菌菌丝或孢子,检验的报告方式,确定报告方式 经分离培养、生化反应及血清学试验后 报告 阳性结果：培养出XX细菌 有XX细菌生长 检出XX群XX菌 培养XX天有XX菌生长 阴性结果：未培养出细菌 未检出细菌 培养XX天无细菌生长,第一节、 血液标本的细菌学检验,血液标本的细菌培养是诊断菌血症或败血症的基本方法。 如从患者血液中检出细菌，一般应视为病原菌。 常见的病原菌主要有： 1、革兰阳性菌： 金黄色葡萄球菌、A群链球菌、B群链球菌、肺炎链球菌、肠球菌 草绿色链球菌 产单核细胞李斯特菌、结核分枝杆菌 2、革兰阴性菌 脑膜炎奈瑟菌、卡他莫拉菌 伤寒及副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌 3、其他病原菌：念珠菌、新型隐球菌,血培养最佳的采血时机？,最佳采血时机,一般于病人发热1-2天内采集血液标本。 尽可能在未使用抗菌药物前采集。 对已经使用抗菌药物的患者，则在下一次使用抗菌药物之前采集。 尽可能在寒战或发热前0.51h内采集。,血培养瓶的消毒,取下顶部保护性的弹性帽盖。 注意：内部的橡皮塞并非无菌的，必须进行消毒。 75%酒精消毒血培养瓶橡皮塞子60s。 将标本注入培养瓶内。,采血套数及采血量,应在不同部位采集23套血培养。 应在10min内完成采血。 成人每瓶血培养应采8 10ml。 儿童每瓶采3 5ml。 新生儿0.5ml。 婴幼儿1 2ml，采血量不能超过全血量的1%。 增菌培养液与血液的比例为10：1。 婴幼儿不需常规做厌氧菌血培养。,感染性心内膜炎对血培养检测的特殊要求,血培养套数：建议起始采集3套血培养，如果24h内报告阴性，则继续采集2套血培养，共采集5套血培养。 解释：采集多套血培养， 其一，可以帮助判断阳性血培养是真性菌血症，还是由污染菌引起， 因为由污染菌引起的往往在多套血培养中仅有一套报阳性； 其二，多套血培养可以提供更充足的采血量，而血量是影响血中微 生物检出的非常重要的因素； 其三，多套血培养可帮助判断是否为持续性菌血症。 如病人已实施治疗，应在增菌培养液中加入相应拮抗剂： 磺胺类药物对氨基苯甲酸5mg/100ml. 青霉素2u青霉素酶/ml 氨基糖苷类、多粘菌素类聚回香脑磺酸钠 其他抗生素MgSO4 5mg/100ml,血标本采集的注意事项,应从静脉采血，不建议采集动脉血。 血培养不宜从静脉导管或静脉留置装置取血。 血培养瓶常温保存，不应冷藏；采集血标本后请立即送到检验科进行检测，如果是夜班采集标本，可以放室温保存（不要冷藏或者放到孵箱内，第二天交班请立即送到检验科。,血液标本细菌学检验方法和操作流程,3. 报告方式 培养7d无菌生长者报告“培养7d无菌生长”。 查见细菌报告菌名和药敏结果。,2. 培养瓶中有细菌生长时的不同表现。,第二节 脑脊液标本,脑脊液的细菌学检查对于细菌性脑膜炎的诊断有重要价值。 正常人的脑脊液是无菌的，检出细菌提示有细菌性（急性化脓性、结核性等）脑膜炎。,标本中常见的病原菌,一、革兰阳性菌 金葡菌 A群（化脓性）链球菌 B群（无乳）链球菌 新生儿 肺炎链球菌 成人 结核分枝杆菌 产单核细胞李斯特菌 二、革兰阴性菌 脑膜炎奈瑟菌 成人 流感嗜血杆菌 儿童 三、真菌 新型隐球菌 白色念珠菌,（一）标本的采集,由临床医师以无菌操作腰椎穿刺(图5一3)，抽取脑脊液3一5ml,盛于无菌容器中立即送检，一般不能超过1h。 脑膜炎奈瑟菌离体后能产生自溶素、迅速自溶;肺炎链球菌及流感嗜血杆菌也易死亡。因此脑脊液无论涂片或培养、必须于采集后立即送检或床旁接种，不宜将其置于冰箱保存、否则影响检出率。 第一管作微生物学检验、第二管生化和免疫学检验、第三管脑脊液常规。,脑脊液标本细菌学检验方法和操作流程图,(1)一般细菌涂片检查: 化脓性脑膜炎脑脊液大部分明显混浊，可直接涂片，无色、透明的脑脊液3000r/min ,离心10-15min后涂片，革兰染色后镜检。 根据染色及形态特征,常可初步提示细菌的种类例如，革兰阴性、凹面相对的球菌，可能是脑膜炎奈瑟菌；链状排列的革兰阳性球菌，可能是链球菌；长丝状等多形态性的革兰阴性杆菌，可能是流感嗜血杆菌。 结核分枝杆菌涂片检查: 取脑脊液的离心(3000r/min ,30min)沉淀物作抗酸染色，发现红色杆菌，报告“找到抗酸杆菌”。如有纤维团，直接取纤维团涂片。镜检必须非常仔细，因为往往在一张玻片上只能找到1一2个结核菌。 (3)新型隐球菌涂片检查 取脑脊液的离心沉淀物作墨汁负染色，加盖片后高倍镜检，黑色背景中见有菌体和较宽的荚膜，可能为“新型隐球菌”。,1、涂片检查,（二）检验方法和操作流程,（二）检验方法和操作流程,2. 分离培养 标本离心后接种血平板、巧克力平板，5-10 CO2 35 培养18-24h，进一步鉴定。 血平板 CO2 环境培养，易于识别溶血链球菌和肺炎链球菌 巧克力平板CO2 环境培养，有利于检出肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌。 3. 报告方式 培养48小时，仍无菌生长者报告“培养2天无细菌生长”。 查见细菌报告细菌，报告菌名和药敏结果。,第三节 痰标本,下呼吸道的痰液是无细菌的，而经口腔咳出的痰带有多种上呼吸道的正常寄生菌（如草绿色链球菌）。若从患者痰标本中查见致病菌或条件致病菌，提示有下呼吸道感染。 常见的病原菌主要有： （1）革兰阳性菌 肺炎链球菌、A群链球菌、金黄色葡萄球菌 结核分枝杆菌、白喉棒状杆菌 （2）革兰阴性菌 卡他布兰汉菌、脑膜炎奈瑟菌 流感嗜血杆菌、肠杆菌科细菌 铜绿假单胞菌、嗜肺军团菌 （2）其他病原菌 放线菌、奴卡菌、真菌、肺炎支原体,（一）痰标本的采集,标本采集方法 (1) 自然咳痰法 (2) 支气管镜采集法 (3) 气管穿刺法 (4) 结核分枝杆菌标本收集法：收集24h痰液 以提高阳性检出率。,呼吸系统标本细菌学检验方法和操作流程,（二）检验方法和操作流程,1. 肉眼观察 包括颜色、粘度、有无血丝或脓。 2. 涂片检查 其一、确定标本是否适合作培养，在低倍镜下观察白细胞和上皮细胞的数目多少来评定(如表)； 其二、初步判定是否有病原菌存在。,痰标本镜下分类,注：A、B两种情况的痰标本适合做培养，C不合适，应重新留标本,（1）一般细菌涂片 挑取脓性或血性痰液制成薄而均匀的涂片， 革兰染色后镜检。 （2）结核分枝杆菌涂片 挑取脓性或血性痰液制成薄而均匀的涂片，作抗酸染色镜检。 浓集法菌检 根据所见结果报告“找到(或未查到)抗酸杆菌”。 （3）放线菌及诺卡菌涂片 将痰液用生理盐水洗涤数次，挑取黄色颗粒或不透明的着色斑点，置载玻片上、覆以盖玻片、轻轻挤压，置高倍镜下观察其结构、如见中央为交织的菌丝，末端呈放线状排列，然后揭去盖玻片。干燥后作革兰和抗酸染色镜检。 如查见中间菌丝部分为革兰阳性，四周放射菌丝为革兰阴性，而抗酸染色阴性，可报告为“找到染色、形态疑似放线菌”; 如查见革兰染色结果与放线菌相同，而抗酸染色弱阳性者，可报告为“找到染色、形态疑似奴卡菌”; 肉眼观察未见黄色颗粒，革兰染色与抗酸染色均为阴性，报告为阴性。,结核分枝杆菌,奴卡菌,3. 培养 （1）培养标本的选择：应选择粘液脓痰作涂片，排除不合格的标本。 （2）痰标本培养前处理：用无菌生理盐水将痰洗涤3次，加入等量的1%胰酶溶液（PH7.6)，35C水浴90min，使痰液均质化后备用。 （3）分离培养 处理后痰液接种于血琼脂平板、巧克力琼脂平板和麦康凯(或EMB ，中国蓝)琼脂平板，置5%-10%二氧化碳环境中，35培养18-24h,根据菌落及形态特点，作出初步判断然后按各类细菌特征进行生化鉴定，并同时作药物敏感测定。 4. 报告方式 痰标本培养48小时后仅有草绿色链球菌生长而无致病菌生长，报告“正常菌群”。查出致病菌，报告菌名和药敏结果，同时报告细菌的量化指标(表5-3)，如“少量、中等或多量”。,表5-3 痰标本在平板上的菌落量化指标,第四节 尿标本,中段尿培养加计数对于泌尿道感染的诊断有重要 价值。 细菌培养必须结合菌落计数辨别是否为病原菌。 正常人中段尿细菌数103 cfu/ml,（一）尿液标本的采集,1.中段尿采集法 最常用 2.直接导尿采集法 易造成逆行感染，尽量不用 3.留置导尿管收集尿液法 注意不能从尿液收集袋中采集标本 4.膀胱穿刺法,（二）尿液标本中常见的病原菌,细菌中80为革兰阴性杆菌，20为革兰阳性菌,（三）检验方法和操作流程,【涂片检查 】 取离心沉淀物涂片 （1）一般细菌 革兰染色、镜检、报告 （2）淋病奈瑟菌 革兰染色、镜检，如发现肾形双球 菌，可报告“检出革兰阴性双球菌，位于细胞内 （或外），形似淋病奈瑟菌” （3）念珠菌 革兰染色、镜检，如发现芽生孢子和假 菌丝，且革兰染色阳性时，可报告“检出念珠菌”。 （4）结核分枝杆菌 抗酸染色、镜检，如在蓝色背景中 查见红色杆菌，报告“找到抗酸杆菌”。,尿液标本细菌检验方法和操作流程,（三）检验方法和操作流程,【细菌培养】 1.一般细菌培养 如培养2d无细菌生长，即可弃去。 尿培养的步骤： （1）收集中段尿 （2）用10l标准接种环取尿液接种血平板（连续划线）和中国 蓝平板（分区划线） （3）35 培养24h （4）菌落计数 计数血平板上生长菌落，乘以稀释倍数（100） 得出cfu/ml。 若整个平板菌落多得无法计数，可报告“菌落 数105/ml”。 （5）若2种菌生长对每种菌进行鉴定和药敏；若2种菌生长 报告“混合菌群”。,2.特殊细菌培养 （1）淋病奈瑟菌培养 （2）厌氧菌培养 （3）结核分枝杆菌培养 3.报告方式 培养48h无细菌生长，报告“2天无细菌生长”。 查见细菌，报告菌名及其菌落计数（菌落数/ml） 和药敏结果。,第五节 粪便标本,正常情况下肠道中有多种细菌。 引起感染性腹泻的病原微生物有： （1）细菌性：产毒素型腹泻、侵袭型腹泻、食物中毒、 慢性腹泻。 （2）真菌性 （3）病毒性,粪便标本细菌学检验方法和操作流程,（一）标本采集 1.自然排便法 挑取黏液脓血或夹杂假膜部分的粪便 2.直肠拭子法 直肠拭子标本先增菌2-6h后转种。 粪便标本直接转种SS、中国蓝等选择培养基。 培养基选用原则上是一强一弱搭配。,（二）检验方法和操作流程,1.涂片检查 粪便标本因各种正常菌群含量甚多，仅以染色性和形态无法分辩是否为病原菌。因此，粪便标本一般不作涂片检查。 2.培养 判断粪便培养出的细菌是否为致病菌，看其是否分解乳糖： 致病菌一般不分解乳糖（SS平板上生长无色菌落）； 条件致病菌除变形杆菌外，均能分解乳糖（SS平板上生长红色菌落） （1）沙门-志贺菌培养： 粪便接种于SS平板和中国蓝平板； 挑选SS平板上不发酵乳糖菌落，分别接种于三糖铁琼脂（KIA)和动力-吲哚-尿素培养基； 生化反应，A-F多价“O”血清或因子血清进行鉴定。,（2）致病性大肠埃希菌培养 （3）霍乱弧菌培养 （4）副溶血弧菌培养 （5）小肠结肠炎耶尔森菌培养 （6）空肠弯曲菌培养 （7）葡萄球菌培养 （8）艰难梭菌培养 （9）真菌培养 3. 报告方式 报告菌种名称+药敏试验结果,第六节 脓液及病灶分泌物标本,化脓性感染可由单种或多种细菌引起。 常见病原菌主要有 革兰阳性菌：金黄色葡萄球菌、化脓性链球菌、炭疽芽胞杆菌、 破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、结核分枝杆菌 革兰阴性菌：大肠埃希菌、变形杆菌、铜绿假单胞菌、腐败谢瓦菌， 以及梭杆菌和拟杆菌等。 其他病原菌：诺卡菌、放线菌、念珠菌,脓液和创面分泌物标本细菌学检查方法和操作流程,（一）标本采集 1.开放性脓液 先以无菌生理盐水冲洗溃疡表面，再用2支灭菌棉拭取溃疡底部或边缘的分泌物，插入斯氏(Stuart)运送培养基内送检。一支为涂片检查用，一支作培养用。 2.封闭性脓肿 消毒局部皮肤或粘膜表面后、用无菌注射器穿刺抽取，将脓液注入无菌试管内送检。疑为厌氧菌感染时，应作床边接种或置厌氧运送培养基内送检。 3.大面积烧伤的创面分泌物 用灭菌棉拭子取多部位创面的脓液或分泌物。置灭菌试管内送检。 4.放线菌标本 可以用抽吸和拭子，对于瘘管可将无菌纱布置于其内数小时后取出检验。,（二）检验方法和操作流程,1.涂片检查 脓液及分泌物涂片作革兰染色境检，根据形态和染色特点，可报告“查见革兰X性菌，形似XX菌”或报告“末查见细菌”。 泌尿、生殖道标本中发现革兰阴性细菌，应注意寻找是否有细胞内双球菌（形似淋病奈瑟