课件：第八组项目一乳酸菌细菌素的制备.ppt

乳酸菌细菌素的制备,2019,-,1,目录,乳酸菌细菌素总概述及其应用 乳酸菌的分离、纯化与鉴定 乳酸菌活性的测定与筛选及其鉴定方法 乳酸菌发酵过程监控（以乳酸菌乳饮料生产为例） 发酵液抑菌物质的分离纯化与鉴定 乳酸菌细菌素的展望,2019,-,2,乳酸菌的概念,乳酸菌（Lactobacillus）是发酵糖类且主要产物为乳酸的一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。凡是能从葡萄糖或乳糖的发酵过程中产生乳酸的细菌统称为乳酸菌。是一种存在于人类体内的益生菌。乳酸菌可用于制造酸奶、乳酪、德国酸菜、啤酒、葡萄酒、泡菜、腌渍食品和其他发酵食品。其形态特征为：乳酸链球菌族，菌体球状，通常成对或成链。乳酸杆菌族，菌体杆状，单个或成链，有时成丝状、产生假分枝。,2019,-,3,相关介绍,早在1928年，L.A.Rogers及其同事在美国首次报道，乳酸链球菌的代谢产物能抑制乳酸菌，在以后的有关研究中发现，此代谢产物是细菌素。细菌素（Bacteriocins）的含义可以这样理解：由某细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽，抑菌范围不仅仅局限于同源细菌，产生菌对其细菌素有自身免疫性。大多数乳酸菌在代谢过程中都能合成这种物质，通称为乳酸菌素，它具有抑制和杀死食品中多数革兰氏阳性致病菌和腐败菌的作用，少数乳酸菌对革兰氏阴性菌有效。,2019,-,4,乳酸菌素的分类,目前主要有2种方法： 一是基于分子量、热敏感性和是否含修饰性氨基酸，将乳酸菌素大致分为4类： 小分子热稳定肽 大分子热不稳定蛋白 羊毛硫抗生素 依赖于2个高度疏水的热稳定小肤分子的协同作用而明显不同于其他乳酸菌 二是根据乳酸菌的种属不同而将其所产的细菌素分为6类：乳酸菌属细菌素、片球菌属细菌素、明串珠菌属细菌素、肉食杆菌属细菌素、其他乳酸菌细菌素、乳酸菌属细菌素,2019,-,5,乳酸菌细菌素的作用,改善胃肠道功能，维持肠道菌群平衡。 提供营养物质，促进机体生长乳酸菌。 改善免疫能力。 帮助吸收营养成分 乳酸菌对一些腐败菌和低温细菌有较好的抑制作用。,2019,-,6,乳酸菌细菌素的应用,乳酸菌细菌素是一种杀菌蛋白或多肽，对革兰氏阳性菌具有光谱抑制作用，尤其是抑制一些腐败菌和病原菌，且与螯合菌结合可以将其活性谱拓宽到革兰氏阴性菌，因而为食品加工和食品保藏提供了一个新的方法。如作为一种安安全、无毒、天然的食品防腐剂个抗菌添加剂已经被50多个国家和地区广泛的应用在乳制品、罐头食品生产中。 细菌素也可以作为发酵剂发酵的副产物存在于成熟奶酪、酸奶、腊肠、泡菜等食品中。许多研究已经证明，具有产细菌素能力的发酵剂在发酵过程中可以防止和控制不良菌丛引起的污染。因此一般认为添加产细菌素的乳酸菌到食品中比直接添加细菌素更可取。细菌素的另一个应用的例子是可以被利用于进行结构基因的克隆和免疫因子的测定上。,2019,-,7,乳酸菌的分离、纯化与鉴定,一、培养基的制备 MRS培养基（pH6.26.4）：蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、乙酸钠5.0g、磷酸氢二钾2.0g、硫酸镁0.58g、硫酸锰0.25g、琼脂粉18.0g（固体培养基，半固体培养基为0.8g）、蒸馏水1000mL、碳酸钙（3%）30g，用于细菌分离 牛肉膏蛋白胨双层培养基（pH7.07.2）：牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl 3g、蒸馏水1000mL(上层琼脂浓度为0.75%，下层为2%)，用于抑菌实验。 二、乳酸菌的分离纯化 实验仪器：三角瓶、试管、移液管、培养皿、搪瓷杯、电炉、天平、玻璃棒、量筒、无菌操作台、高压灭菌锅、恒温培养箱,2019,-,8,实验步骤： 1）、预处理：将MRS培养基加热融化后，放入水浴锅内保温，以防凝固；将除去样品及培养基以外的东西放入无菌操作台内，打开紫外灯，灭菌30min,后关闭紫外灯，打开风机，点燃酒精灯，调整风速至火焰约折过45。用酒精棉球擦手、台面、样品、试管口、整理桌面、平板倒置。松试管塞，然后标记试管、平皿（试管标记在试管口1/5处，平皿标记要有平板稀释度、日期及操作人）。 2）将样品以10倍稀释法稀释至10-7,取其10-7、10-6两个稀释度的稀释液各0.10.2mL,分别置于上述各营养平板上，用无菌涂布器依次涂布2至3个皿，置43C培养48h。如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基亦为黄色者初步定位乳酸菌。 3）将典型菌落转至脱脂乳发酵管，43C培养824h，若牛乳管凝固，无气泡，呈酸性，镜检细胞杆状或链球状，革兰氏染色呈阳性，则将其连续传代若干次，43C培养，挑选出在34h能凝固的乳管，保存备用。,2019,-,9,乳酸菌活性的测定与筛选,乳酸菌活性的测定采用牛津杯定量扩散法（又称管碟法）。选用9.0cm平皿，将指示菌培养物与15mL融化且冷却至50C左右的检测培养基混匀（指示菌最终为1.0107CFU/mL）,倾入已放置好牛津杯的无菌平皿中，待琼脂凝固后用无菌镊子将牛津杯取出。调整乳酸菌发酵液pH值至2.0，离心后取上清液，100C加热5min，去100uL该处理液，加入到检测平皿牛津杯形成的小孔中。在指示菌生长的最适温度下进行培养，观察并测定抑菌圈直径，并以此表示乳酸菌素的活性。此外，为便于与Nisin进行比较，将乳酸菌素的活性单位定义如下：以藤黄八桑球菌1.880为指示菌，乳酸菌素溶液每产生1mm2抑菌圈而积称为1个活性单位；比活性定义为单位体积的乳酸菌素的活性单位。利用管碟法筛选出具有较高抑菌活性的乳酸菌。,2019,-,10,乳酸菌的鉴定方法,（1）菌落形态和培养特征观察：主要利用MRS培养基培养。 （2）生长条件试验： 1）耐盐性试验（Nacl浓度：0.85、1.20和1.71mol/L）； 2）耐酸碱试验（PH：4.3、5.7、6.8、8.4、8.6和8.7）； 3）温度梯度试验（温度：10C、30C、40C、50C、55C、60C和65C）。 （3）生理生化试验：其中又包括过氧化氢酶测定、葡萄糖产酸产气实验、明胶液化实验、甲基红（M.R）试验、乙酰甲基甲醇V-P实验、柠檬酸盐实验、酪素水解试验、厌氧生长测定、厌氧硝酸盐产气、石蕊牛奶的反应和糖发酵实验； （4）16S rDNA序列分析； （5）生长曲线测定。,2019,-,11,（三）乳酸菌的发酵与过程监控（以乳酸菌乳饮料生产为例）,关键点：发酵乳的制作，包括原料奶收购、原料奶热处理、菌种选择、发酵控制 关键点：稳定剂选择及溶解，包括稳定剂的选择、稳定剂的溶解 关键点：调酸，包括酸的浓度、加酸的温度、加酸的速度 关键点：杀菌及保藏，原料奶的质量必须合格并保证杀菌条件；所有设备、管路必须保证杀菌合格；生产环境的空气细菌数应300 个m-3，酵母菌、霉菌50个 m-3；注意个人卫生并定期检查、检验；各种原辅料在与混合前应尽可能做到商业无菌状态，所经过的管路杀菌必须合格；包装材料在进厂之前要按要求严格检验，确保包材质量合格。同时，活性乳酸菌饮料必须在冷链下销售、储存。而杀菌型乳酸菌饮料为了达到常温销售并达到一定保质期的目的必须在均质后进行超高温杀菌（110130，310秒）然后无菌灌装，或灌装后进行二次杀菌（85，维持1530分钟）。,2019,-,12,发酵液抑菌物质的分离纯化与鉴定方法,一、抑菌物质的粗分 （1）发酵上清液盐析沉淀样制备取菌株发酵上清液，用饱和度为8的硫酸铵，4 盐析沉淀24 h，然后4000 rpm，离心20 min，收集沉淀，用蒸馏水将沉淀溶解。将MD44(DM-27)透析袋制成15 cm 的小段，将透析袋放置于2% NaHCO3和1mmol/L pH8.0 EDTA 的沸水浴中煮20 min，然后用蒸馏水或者去离子水浸泡透析袋，然后将其置入1mmol/L pH 8.0 EDTA中煮10 min，并在4 条件下贮藏备用。使用前用蒸馏水冲洗透析袋。取10 mL硫酸铵盐析沉淀物水溶液，在装有蒸馏水的容器中进行透析，透析工作温度为4 。每隔半小时换一次蒸馏水。将2mL BaCl2（10%）溶液放入一试管中，并在试管中滴加23 滴透析液，如果有白色沉淀出现，则表明表明SO4-2尚未除净，仍需要透析；如果未出现沉淀，则表明已经完全透析。 （2）发酵上清超滤浓缩液制备取15mL超滤离心杯，加入发酵上清液，进行二次离心。3000rmp 离心20min，后调转速至3500 rmp，离心20 min。先后用10 KDa、3 KDa 超滤离心杯进行二次离心超滤，取截留液及10倍浓缩滤过液进行抑菌实验,2019,-,13,二、半制备高效液相色谱分离纯化抑菌物质 （1）超滤液半制备型液相色谱条件由半制备型液相色谱（VARIAN Prostar 218，美国）测定。 色谱制备液中有机酸检测利用离子色谱（D20 NEX ICS-3000）测定。 将第4 部分进GC-MS，仪器条件如下：色谱仪岛津（SHIMADZU）GCMS-QP2010-plus色谱柱：RTX-5MS(30m*0.25mm*0.25m)；进样口温度260；载气He，1.0mL/min；色谱柱温度：50（1min），以5/min 速度升温至275（3min）；进样量：1.0L，分流比10:1，恒流模式；接口温度280，离子源温度230；EI 电子能量：70eV，质量扫描范围：35amu。,2019,-,14,乳酸菌细菌素的展望,综上所诉，乳酸菌细菌素有很多特点，已经引起广大从事乳酸菌、食品添加剂、益生素及开发新药等领域研究人员的极大兴趣，出现了研究热潮，近年来新的乳酸菌细菌素不断出现，报道乳酸菌细菌素的文献资料和专利数量也越来越多。目前的研究主要集中于心菌株和高产菌株的筛选以及对已知乳酸菌细菌素遗传因子的鉴定及结构基因的克隆和排序上。我国是一个乳酸菌资源非常丰富的国家，但是对乳酸菌细菌素额研究起步较晚，大力进行乳酸菌细菌素的研究尤其是生化/遗传特性及基因调控方面的研究不仅具有重要犯人理论意义，而且具有关阔的应用