课件：真核表达系统分析.ppt

,酵母 丝状真菌 昆虫 哺乳动物细胞 转基因动物 植物反应器,2019,-,1,酵母表达系统的优缺点,遗传背景清楚（基因组是大肠杆菌的3.5倍） 增殖快（90min/代），培养容易，产量较高 易于研究突变与基因功能，如构建酵母人工染色体等 可以进行转录和翻译后修饰加工 提纯工艺复杂，成本高，制品纯度达不到要求，制品免疫原性差，接种剂量大,2019,-,2,酵母载体的基本结构,DNA复制起始区：2质粒和自主复制序列 选择标记：营养缺陷型和显性选择（抗药） 整合介导区：同源重组，决定整合位置和拷贝数 有丝分裂稳定区：帮助载体平均分配 表达盒 转录启动子 终止子 分泌信号序列,2019,-,3,酵母表达系统中载体的种类,按载体在酵母中的复制形式分为： YIp：酵母整合型载体 YRp：酵母自主复制型载体 YCp：酵母含着丝粒片段载体 YEp：酵母附加体型载体 YAC：酵母人工染色体,2019,-,4,昆虫表达系统,杆状病毒基因组：闭环双链DNA，88-166kb 启动子：杆状病毒科核多角体病毒的多角蛋白强启动子 表达系统 杆状病毒表达系统（BEVS） 家蚕核型多角体病毒-家蚕表达系统 宿主：鳞翅目、膜翅目、双翅目、鞘翅目、直翅目、脉翅目、毛翅目的600多种昆虫 克隆基因方法：转移载体共转染同源重组空斑筛选纯化重组病毒,2019,-,5,杆状病毒表达系统优点,容量大：能插入12kb的外源基因 高表达：polh基因启动子是目前所知的最强的真核启动子；产物对宿主影响小；产物可结晶 高效：可同时表达多个基因 安全：杆状病毒对脊椎动物无病原性 具加工修饰功能：昆虫细胞较高等 家蚕易饲养,2019,-,6,哺乳动物细胞表达表达系统,常用宿主细胞 哺乳动物细胞常用载体 真核细胞表达元件 哺乳动物基因转移的遗传标记 基因表达的检测方法,2019,-,7,哺乳动物细胞表达的优点,重组DNA易转染，遗传稳定，可重复 识别和去除内含子 进行翻译后修饰 磷酸化、糖基化、二硫键、寡聚体等的形成、高级结构的正确折叠 产品的构型正确率高，可被改造成类人体源性，免疫源性好 可分泌至培养基，提纯工艺简单，成本低 可用于基因治疗,2019,-,8,常用宿主细胞,2019,-,9,真核细胞表达元件,原核DNA序列 启动子 增强子 拼接信号 终止子和多聚腺苷化信号 筛选标记 动物病毒基因序列,2019,-,10,原核DNA序列,原核复制子 抗生素抗性基因 多克隆位点,2019,-,11,启动子,真核启动子：RNA聚合酶（）结合并起动转录的DNA序列 一般包括转录起始点及其上游约100-200bp序列，包含有若干具有独立功能的DNA序列元件，每个元件约长7-30bp 核心启动子元件：RNA聚合酶起始转录所必需的最小DNA序列，包括转录起始点及其上游-25/-30bp处的TATA盒。单独起作用时只能确定转录起始位点和产生基础水平的转录 上游启动子元件包括通常位于-70bp附近的CAAT盒和GC盒、以及距转录起始点更远的上游元件。与相应的蛋白因子结合改变转录效率。不同基因具有不同的上游启动子元件组成，其位置也不相同，即不同的基因表达分别有不同的调控,2019,-,12,哺乳类RNA聚合酶启动子 中常见的元件,2019,-,13,常用启动子,Rous肉瘤启动子（RSV） 巨细胞病毒启动子（CMV） SV40启动子,2019,-,14,增强子,增强子：是一种能够提高转录效率的顺式调控元件，最早是在SV40病毒中发现长约200bp的一段DNA，可使旁侧的基因转录提高100倍，其后在多种真核生物、甚至在原核生物中都发现了增强子 增强子通常占100-200bp长度，也和启动子一样由若干组件构成，其基本核心组件常为8-12bp，可以单拷贝或多拷贝串连形式存在,2019,-,15,增强子的作用特点,提高同一链上基因转录效率，可远距离起作用，通常距离1-4kb、但远至30kb仍能发挥作用，在基因的上游或下游都能起作用 与其序列的正反方向无关 要有启动子才能发挥作用。但增强子对启动子没有严格的专一性，同一增强子可以影响不同类型启动子的转录 增强子的作用机理虽然还不明确，但与其他顺式调控元件一样，必须与特定的蛋白质因子结合后才能发挥增强转录的作用 增强子一般具有组织或细胞特异性，许多增强子只在某些细胞或组织中表现活性，是由这些细胞或组织中具有特异性蛋白质因子所决定的,2019,-,16,常用增强子,LTR：Rous肉瘤病毒基因长末端重复序列 人类巨细胞病毒增强子 SV40病毒增强子,2019,-,17,终止信号和poly A信号,真核基因转录的终止信号与机制还不明确 poly A增加mRNA的的稳定性 多聚腺苷化所需的两种序列 位于poly A下游GU丰富区或U丰富区 位于poly A上游11-30bp处的5-AAUAAA SV40 poly A信号,2019,-,18,遗传性标记,胸苷激酶基因（tk）选择系统 二氢叶酸还原酶基因（dhfr）选择系统 新霉素抗性基因（neo）选择系统 氯霉素乙酰转移酶基因（cat）选择系统,2019,-,19,胸苷激酶（TK）基因选择系统,TK是核苷酸补救合成途径的一个关键酶 内源性缺陷tk的宿主细胞小鼠LMTK细胞 HAT选择法 H：次黄嘌呤；补救合成三种核苷酸的原料 A：氨基喋呤；抑制四氢叶酸合成 T：胸苷；补救合成dTTP的原料 tk细胞的鉴别与获得：5-溴脱氧核糖尿苷（BUdR）筛选,2019,-,20,二氢叶酸还原酶（DHFR）基因选择系统,DHFR：真核细胞生物合成核苷酸的关键酶，功能是催化二氢叶酸还原成四氢叶酸 筛选剂：叶酸类似物氨基喋呤或氨甲喋呤 dhfr缺陷型细胞CHO细胞 正常细胞可通过提高氨甲喋呤浓度筛选 突变型dhfr基因的导入扩大筛选宿主细胞的范围,2019,-,21,新霉素抗性基因选择系统,新霉素（neo）：即G418，一种氨基糖苷类抗生素，影响80S核糖体功能核蛋白质的合成 新霉素抗性基因编码3-磷酸转移酶降解G418 适用于所有的真核细胞,2019,-,22,氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因选择系统,CAT：大肠杆菌Tn9转座子编码的催化氯霉素乙酰化反应的蛋白质 真核细胞缺乏CAT 导入CAT可作为报告基因 常用于瞬时表达研究,2019,-,23,表位标记,表位：抗原决定簇即抗原分子于一特定抗体结合的化学基团，一般由少至几个氨基酸的多肽组成 用于重组DNA技术的示踪、分析、纯化（亲和） 优点 用一种抗体可鉴别不同重组蛋白 不影响蛋白功能 有利于研究蛋白功能 常用表位：6His；FLAG；LZ等,2019,-,24,构建含表位的重组体,使用常用密码子 注意克隆位点（限制性酶切位点）相符 5端加上起始密码子ATG 3端加上终止密码子 可插入蛋白酶切位点基因，以利于产生天然蛋白 其他常规构建载体的注意点,2019,-,25,真核表达载体,质粒：真核表达元件、真核抗性 病毒载体：改建后 SV40病毒 腺病毒 反转录病毒 痘苗病毒,2019,-,26,病毒基因组的结构特点,病毒基因组大小相差较大,与细菌或真核细胞相比，病毒的基因组很小 病毒基因组可以由DNA组成，也可以由RNA组成 多数RNA病毒的基因组是由连续的核糖核酸链组成 基因重叠即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子 病毒基因组的大部分是用来编码蛋白质的 病毒基因组DNA序列中功能上相关的蛋白质的基因或rRNA的基因往往丛集在基因组的一个或几个特定的部位,形成一个功能单位或转录单元 除了反转录病毒以外，一切病毒基因组都是单倍体，每个基因在病毒颗粒中只出现一次 噬菌体（细胞病毒）的基因是连续的；而真核细胞病毒的基因是不连续的,2019,-,27,病毒载体优点,真核细胞可识别的启动子 报告基因 可持续复制（感染周期） 部分载体可整合入基因组 部分载体本身带有完整的复制及表达元件 部分载体具有宿主细胞特异性 识别受体 假病毒颗粒,2019,-,28,猿猴空泡病毒（SV40）,种属分类：乳多空病毒科多瘤病毒属 双链共价闭合环状DNA（cccDNA），5243bp 20面体立体对称结构，直径45nm 以EcoRl内切酶切点作为0点分成100等分，Ori点是DNA双向复制的起绐点 早期编码进程是逆时钟方向，在病毒DNA自制前，编码的蛋白质(大T、小T抗原)与诱发宿主细胞的转化有关 晚期编码区进程为顺时钟方向，是在病毒DNA复制开始以后，编码的蛋白质为三种病毒壳体蛋白VP1、VP2和VP3，这些蛋白是病毒的结构蛋白，不参与细胞的转化过程,2019,-,29,2019,-,30,SV40感染细胞模式,感染形式：随宿主的不同产生的效应不同 许可性细胞裂解性感染（猿猴细胞） 非许可性细胞整合入染色体（啮齿动物细胞） 半许可性细胞既不整合也不裂解（人细胞）,2019,-,31,SV40载体类型,取代型重组病毒 去掉晚期区一段DNA，外源基因可插入 需辅助病毒感染 可形成病毒颗粒 重组病毒-质粒载体 保留病毒复制相关序列 插入细菌质粒序列，可在大肠杆菌种复制增殖 不形成病毒颗粒,2019,-,32,SV40及衍生载体的优点,可在多种细胞中表达 基因组DNA、cDNA均可表达 SV40的复制起始点 广泛宿主范围的启动子 多聚A信号 DNA拼接供体和信号（剪接内含子） 部分载体含有报告基因,2019,-,33,感染宿主范围有限 复制只能在猿猴细胞中 载体DNA分子量小，容量小 在用辅助病毒混合感染时，有野生化危险,SV40及衍生载体的缺点,2019,-,34,2019,-,35,痘苗病毒,双链DNA病毒 180kb，编码200种左右的蛋白 可独立的在细胞质中复制转录,2019,-,36,痘苗病毒载体优越性,宿主范围广泛 容量大插入的外源基因可达25kb 瞬时表达 无致癌性本身即需接种 可作为重组活疫苗的载体,2019,-,37,痘苗病毒载体的缺点,分子量大，操作较困难 无剪接功能不能插入含内含子的基因 外源基因必须插入非必需区,2019,-,38,构建重组痘苗病毒流程,tk基因插入质粒 tk基因内插入痘病毒早期启动子 接上多克隆位点 接上外源基因 野毒株感染细胞 导入重组载体 同源重组含外源基因的tk基因取代 筛选含外源基因的重组病毒 感染敏感宿主细胞表达外源基因,2019,-,39,腺病毒,Ad病毒颗粒的直径为70-90nm，呈20面体立体对称型，核心外层的壳体由252个壳粒亚单位组成 双股线型DNA，DNA约占病毒重量的11-14% 不同亚型Ad病毒的DNA的G+C%含量不同，与其致瘤性能强弱有关 Ad2基因组的早期转录区有6个独立的区域: IA(EIA)、EIB、E2(E2A和E2B)、E3、E4 Ad2基因组约长36kb，EIA和EIB与Ad2的启动和转化细胞密切有关 腺病毒虽然分布广泛，其中某些亚型对动物具强致瘤性，但是从A组到E组，迄今尚未证明与人类肿瘤有病因学上的联系,2019,-,40,腺病毒载体,容量较大：可插入7kb 易培养、纯化 复制与转录依赖与宿主聚合酶 不整合 释放壳体蛋白，引起免疫反应,2019,-,41,基因的导入方法,光穿孔法：激光；悬浮细胞 冲击波：活体局部的基因转移 基因枪法：即微粒轰击；动物细胞，更适用于植物细胞 穿孔法：脉冲电场；Cytomix缓冲液；70%细胞死亡时效率最高 磷酸钙共沉淀法 脂质体法：Lipofectin；阳离子 抗体转染法：抗CD3，CD34或表面免疫求蛋白 其他：超声波法；微注射法原生质体融合法；反转录病毒感染法,2019,-,42,表达产物的检测技术,Western印迹法免疫学方法抗原-抗体反应 荧光显微镜法表位标记的抗体与直接抗体进行荧光标记免疫学方法,2019,-,43,Western印迹法,蛋白样品制备 SDS-PAGE（按分子量大小）电转移一抗（特异性）二抗显色 敏感度：1-5ng,2019,-,44,样品的制备,裂解细胞 电泳加样缓冲液裂解细胞（煮沸5-10min） 抽提细胞蛋白（超声）,2019,-,45,SDS-PAGE,丙烯酰胺和N，N-亚甲双丙烯酰胺交联，形成一定孔径的分离介质，孔径大小由浓度决定，具有分子筛效应 在不连续的缓冲系统，具有浓缩效应 蛋白质本身的电荷效应 SDS：阴离子去污剂，与蛋白质结合 SDS浓度大于0.05%时，使样品中的蛋白质带同样密度的电荷 电泳时使蛋白迁移只与分子量有关，且呈线性（对数分子量与迁移率），可测定分子量,2019,-,46,电转移,支持介质：重氮苄氧甲基纸（DBP纸）、阴离子化尼龙膜、硝酸纤维素膜（NC） 蛋白质带负电，向正极迁移 凝胶考马斯亮兰染色，检查转移是否完全 膜丽春红染色 标记分子量位置,2019,-,47,靶蛋白的免疫学检测,封闭非特异性结合位点，脱脂奶粉或血清白蛋白 第一抗体：具有特异性，最好氏多抗或抗血清 标记的第二抗体：同位素标记；碱性磷酸酶（AKP）标记；辣根过氧化物酶（HRP）标记 注意封闭非特异性位点 注意抗体浓度：尤其是一抗浓度,2019,-,48,显色反应,AKP催化5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸与氮蓝四唑发生反应，产生深蓝色 HRP催化3,3-二氨基联苯胺与H2O2反应产生棕色条带，易褪色，注意保存结果,2019,-,49,转基因动物,概念：以动物个体为基因受体的基因表达技术，并由于这种外源基因的导入而产生可以遗传的变异 这些遗传改变包括： 外源DNA至少整合到一条染色体上 由于外源DNA的插入使任一基因发生改变 由于外源DNA的插入使染色体发生重排 有意识的导入可以持久存在的遗传实体,2019,-,50,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料