粘细菌多糖提取纯化及活性测定-开题报告.doc

河北大学本科生毕业论文（设计）开题报告装订线（学生用表）课题粘细菌胞外多糖提取纯化及其生物活性检测学院生命科学学院专业生物工程学科工学学生王娜指导教师张利平教授一 课题来源及意义1.1 课题来源本课题来源于科技部基础微生物资源平台建设项目。1.2 研究意义多糖广泛分布于高等植物、地衣、海藻、动物和微生物中。多糖类药物具有多效性、低毒性、来源广泛、天然绿色等优点，多糖与现有药物的联合用药可以提高药物的作用范围和效力，减少用药量，并可防止或推迟耐药的出现，引起了科学家们的研究兴趣。近二十年来，有更多微生物来源的多糖被确认对机体免疫反应的调节有着极为重要的意义。多糖的抗肿瘤活性大多是与其免疫调节功能密切相关的1，主要通过激活免疫细胞，并诱导多种免疫细胞因子和细胞因子受体基因的表达，进而增强机体的抗肿瘤免疫力。有些微生物来源的多糖与肿瘤细胞表面的糖类分子很相似，能抑制肿瘤细胞的粘附，从而抑制了肿瘤细胞的侵袭与转移。此外，多糖的抗病毒作用也已引起医药界的高度重视，尤其是在抗HIV方面，硫酸酯化多糖因为其活性明确，已成为研究热点2。虽然近年来粘细菌的次级代谢产物在抗肿瘤机制上的多样性，使其成为抗真核生物类药物筛选的重要微生物类群3，但对粘细菌多糖的研究尚未引起足够重视，未见到系统的报道，在这方面具有很大的研究空间。粘细菌产生的胞外多糖除具有重要的药用价值外，以多糖为主要成分的粘液有润滑作用，可以推动粘细菌在物体表面运动，这一特性有望运用于火箭动力学研究中，从而展现出了粘细菌多糖的更加广阔的潜在的应用价值。因此，对于粘细菌胞外多糖的系统研究将为这一类微生物资源的开发利用，起到重要的推动作用。二 国内外发展状况粘细菌（Myxobacteria）是一类可以滑行，革兰氏染色阴性的单细胞细菌4。在其生长过程中，当营养物质被消耗之后，其营养生长结束后，细胞则聚集成球状或珊瑚状，颜色鲜艳，通常肉眼可见的子实体5，在子实体内生有抗逆性强的休眠孢子粘孢子。粘细菌以二等分分裂繁殖，大多生长在土壤中，有的能分解纤维素6,7，随着对粘细菌深入的研究，发现它是一类能产生新型的生物活性物质的细菌类群。目前已知的粘细菌来源的生物活性物质种类丰富，结构新颖8。近年来的研究证实，粘细菌相当一部分代谢物具有抗真菌、抗细菌以及抗肿瘤等生物活性9。因此，粘细菌是一类具有极大研究价值的微生物类群。粘细菌虽然在1809年就已被发现，至今已经历了200年的研究历史10。直到上世纪五十年代，科学家发现了粘细菌的抗生素活性。由于粘细菌是一类难以操作和培养的细菌，所以当时他们还是把目光投向那些易于操作的微生物。直到1973年，人们首次分离得到粘细菌产生的够抑制真菌孢子的发育活性物质，特别是20世纪90年代德国学者发现由粘细菌产生的高效抗肿瘤抗生素埃博霉素(epothilones)以来，粘细菌才开始展现其重要的应用价值11,12。目前，随着越来越多的具有药理和生物活性的次级代谢产物的发现，粘细菌也成为了药源微生物家族的重要成员。微生物来源的多糖是至今研究得比较详细的一类多糖，其广泛的生物活性使得其已成为微生物药物一个重要的组成部分，且在新药研发中也越来越受到重视。我国微生物胞外多糖产业起步较晚，但发展迅速，于“七五”、“八五”期间研究开发出了黄原胶、茁霉多糖、海藻酸盐、齐整小核菌多糖等微生物多糖，初步建立了我国微生物多糖产业。不过我国的主要研究工作还是集中在黄原胶这一产物，然而对于粘细菌多糖的几乎处于空白。总的看来，国内多糖的研究与生产均落后于发达国家，其质量和产量远不能满足社会的需求，这就迫切需要人们改进工艺和产品性能或寻找替代品来满足实际的需要13。三 研究目标及内容3.1 研究目标本实验重点是通过对粘细菌进行培养，使其大量分泌胞外多糖，并对胞外多糖进行提取纯化，进一步检测粘细菌多糖的生物活性，从而发现粘细菌胞外多糖的生物活性，为粘细菌多糖理论及应用研究奠定的基础。3.2 研究内容菌种活化 (57d)种子培养 （28 3-4d）发酵培养 （28 57d） 离心，去上清胞外多糖提取 样品检测四 实验方法与手段4.1发酵培养 活化发酵培养 菌种保藏管液体CAS种子培养基提取发酵液4.2提取 弃沉淀 离心发酵液 减压蒸馏 3800rpm，离心10min 上清液 2倍体积95 乙醇沉淀过夜 3800rpm，离心10min得沉淀，水溶解 2倍体积95 乙醇沉淀 去上清，得沉淀。4.3初步纯化将粗胞外多糖加水溶解，初步纯化的流程如下14：粗胞外多糖20，10000 r/min离心20min去菌体，取上清液 上清液加等体积的氯仿，振荡，20，3800 r/min离心10min上清液加等体积的氯仿，振荡，20，3800 r/min离心10min上清液加等体积的氯仿，振荡，20，3800 r/min离心10min上清液加两倍体积的95乙醇，振荡，20，3800 r/min离心10min沉淀物 加等体积水溶解，20，10000 r/min离心10min上清液（粗胞外多糖） 4保存4.4 胞外多糖蛋白质的去除采用Sevag法（原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，它是用氯仿：戊醇或丁醇，以4:1（或3:1，或5:1）比例混合，加到粗品中充分振摇，使样品中的游离杂蛋白与Sevag试剂形成凝胶15,16，使杂蛋白变性成不溶状态，用离心法除去，重复操作三次，但其中一次要振荡过夜去蛋白，取上清液。4.5 胞外多糖脱色上述上清液加入等体积的30的双氧水，调pH至8.8，置于45水浴锅中水浴4h。取出置4冰箱保存。4.6 胞外多糖活性的检测送样检测粘细菌多糖的活性。五 实验创新点本实验通过对不同属的粘细菌进行胞外多糖的发酵，并分离具有特殊生物活性的多糖成分，可作为新的微生物来源的药物资源，为新药的开发奠定基础。 六 实验进度安排2月27日3月10日 查阅资料，熟悉实验条件及相关操作，做准备试验。3月11日4月20日 活化菌种，进行发酵培养获得培养液，提取纯化多糖。4月21日5月21日 多糖活性检测。5月22日5月31日 分析整理实验数据，撰写毕业论文，毕业论文答辩。七 实验方案的可行性分析和已具备的实验条件本实验室保藏有一定数量的粘细菌菌株，可以获得广泛性菌株作为实验材料。并且，本实验室已经进行了多年的粘细菌研究，对粘细菌生物活性物质的测定已有一定基础；前期的研究工作中，已建立了粘细菌胞外多糖提取纯化的方法，获得了一定量的粘细菌胞外多糖的提取物。同时，有本人的努力和老师的指导，因此，本实验在理论和实践上均具有可行性。参考文献1 张锐.黄蘑多糖抗肝癌作用的研究.硕士学位论文,吉林大学:2005,22 Berteau O, Mulloy B. Sulfated fucans, fresh perspectives: structures, functions, and biological properties of sulfated fucans and an overview of enzymes active toward this class of polysaccharide . Glycobiology,2003,13,6: 293 李越中,胡玮,吴斌辉等.纤维堆囊菌的代谢产物及其生物学活性分析.微生物学报,2001,41,6:7167224 方晓梅,张利平.粘细菌生态多样性的初步研究.生物多样性,2001,9,3: 2072135 张建法,王睿勇,李鹏富等.溶纤粘细菌NUST06的系统发育学研究.南京大学学报,2003,39,2: 2812876 Youderian P. Bacterial motility Secretory secrets of gliding bacteria.Curr.Biol, 1998,8:4084117 Kaplan H B,Gulati P Xu D.Identification of the Minimum Regulatory Region of a Myxococcus xanthus A-Signal Dependent Developmental Gene.J Bacteriology,1995,177,16,:464546518 李健,李越中,王臻圮.粘细菌生物活性物质研究进展.中国新药杂志,1998,7,2: 84899 李娜,张利平,刘京生.微生物来源的抗肿瘤活性物质研究.河北医药,2003,25,9:68568610 王赫,张庆林.粘细菌代谢产物的研究进展综述.国外医学药学分册,2005,32,4:24625011 Anderson A R, Vasiev B N.An individual based model of rippling movement in a myxobacteria population. Journal of Theoretical Biology, 2005,234,3:34134912 Florshimer A,Altmann K-H. Epothilones and their analogues-a new class of promising microtubule in hibitors. Expert Opin Their Patents,2001,11,6:95196813 李冰.粘细菌Sorangium cellulosum NUST06产胞外多糖的代谢调控及其流变学性质的研究.硕士学位论文,南京理工大学:2004,814 陈欢.粘细菌NUST06胞外多糖的化学组成及其应用的研究.硕士学