课件：第六章放射免疫实验.ppt

第三章 放射免疫分析技术,体外放射分析技术,利用放射分析方法或其派生的相关技术在体外进行体内物质种类和含量的分析测定。,竞争性放射分析放射免疫分析（RIA） 非竞争性放射分析免疫放射分析（IRMA）,待测物质浓度与检测手段,临床化学分析,pg/mL,ng/mL,mg/mL,mg/mL,g/L,免疫分析,Therapeutic Drugs,Thyroid Hormone,Fertility Hormone,Allergy,Cancer Markers,Infectious Disease,Vitamins,Serum Proteins,第三章 放射免疫分析,放射免疫分析法 免疫放射分析法 临床应用,放射免疫分析的创立,1959 美国Yalow & Berson 1960 英国 Ekims 1977 获诺贝尔医学生物学奖,医学生物学超微量分析的里程碑,1959年，Yalow和Berson创立了放射免疫分析法（RIA），并因此于1977年获得诺贝尔生物医学奖。 这种方法结合了放射性核素测量的高灵敏性和免疫抗原-抗体反应的高特异性两大特点，开创了生物活性物质微量测定技术的先河。,女科学家 R.Yalow,放射免疫分析法 （Radioimmunoassay，RIA）,基本原理,Ag + Ab Ag-Ab + Ag* Ag*-Ab,竞争结合：放射性标记的抗原（Ag*）和非标记的抗原（Ag）在同一反应系统中与特异性抗体（Ab）的竞争性结合。,在上反应式中： Ag与Ag*的免疫活性相同，即与Ab有相同的亲和力； Ab的结合位点数Ag或Ag*，但Ag+Ag*； Ag*与Ab的量是恒定的，Ag是待测量。,二种抗原(Ag 、Ag*)与Ab结合的量取决于两者的浓度比例，Ag量多，则AgAb结合多，Ag*Ab结合量就少，即Ag*Ab将随Ag的增加而减少，呈负相关，表现为函数关系。在系统中，Ag*Ab的量可通过测定放射性而获得，再根据函数关系求Ag的量。,+,+,+,+,+,+,+,+,Bound,Free,Ag,Ab,标准曲线,标准曲线又称为剂量反应曲线，以一系列递增浓度的Ag及一定量的Ag*与恒定量限量的Ab竞争结合反应而得，是对待测物进行定量分析的基础。,标准曲线实例,标准曲线:, 配制一系列已知浓度的标准抗原，分别向其中加入固定量的标记抗原和抗体，反应平衡后，分离抗原的结合部分和游离部分，测定*Ag-Ab的放射性B。 B0为标准抗原浓度=0时的放射性值。,放免分析基本条件,（一）标准抗原 （二）特异性抗体 （三）标记抗原 （四）分离技术,a. 概念：是指已知真实含量，且不含对免疫反应产生干扰杂志的抗原。 b. 用途： 免疫动物制备抗体Ab 放射性核素标记Ag* 绘制剂量反应曲线 c. 要求： 高纯度 高准确度 良好的稳定性,（一）标准抗原,（二）特异性抗体,a. 对特异性结合抗体的要求： 1亲和力 （affinity）高：指单个抗体分子与抗原决定簇特异结合的能力，用 亲和常数Ka 值表示，反映灵敏度，Ka应达1091012mol/L。 2特异性高：与待测抗原的结合力高，而与待测抗原类似物的结合能力（交叉反应率）低。 3滴度 （效价）高：指将血清稀释时能与抗原发生反应的最高稀释度。它反映抗血清中有效抗体的浓度。稀释倍数越高，滴度(titer)越高，表示抗体的效价越高。 4稳定性好：能长期保存，化学性质、效价稳定。,b. 抗血清的制备： 1.大分子物质可直接免疫动物诱导抗体产生，但是小分子物质为半抗原，必须与载体结合制成人工抗原（半抗原-蛋白质），才能进行免疫。 2选择合适的免疫动物：兔、鼠、羊。 3应用佐剂：福氏完全佐剂与不完全佐剂（羊毛脂、石蜡油 +卡介苗）。 4选择合适的免疫方法：剂量、接种途径（腹股沟、腋窝、脊柱两侧皮内多点）、间隔时间（加强）与次数。,c.单克隆抗体的使用：,特异性高 亲和力低，不一定优于传统的多克隆抗体,对标记抗原的要求： 1放射性比活度高：即单位物质的放射性强度高，一般至少达到370GBq/mmol。 2免疫活性：与标记前一致。 3放射化学纯度高：应 95%。 4稳定性好：标记的同位素不易脱落。,（三）标记抗原,常用标记核素： （1）125I： 射线，半衰期 60 天 （2）3H： 射线，半衰期 12.3 年 测量仪器： （1） 计数仪 （2）液体闪烁计数器,两种标记方法的优缺点,3H标记物 125I 标记物 货架期长 货架期短 以3H置换H，对原物质 以125I取代H，可能影响 免疫活性无改变 免疫活性 标记难度大，比活度低 标记方法简单，比活度高 射线测量效率低 射线测量效率高 废弃物处理较困难 废弃物处理较容易,a. 对分离方法的要求： 1使抗原-抗体复合物（B）与游离抗原（F）尽可能分离完全； 2分离后便于放射性测量； 3分离效果不受外界干扰因素的影响； 4 操作简便、分离迅速、重复性好； 5与游离标记物的非特异性结合尽可能小； 6. 试剂来源广泛、价格低廉。,（四）分离技术,b. 常用的分离方法 1. 双抗体法 特点： 分离完全，非特异结合小，环境影响小，效价高，但分离时间长，成本高。,2. 沉淀法 聚乙二醇（w=6000） 特点： 快速，价廉，来源方便，受环境影响大 3. 双抗体PEG法 将双抗体和沉淀法两者结合进行分离。 本法具有两种方法的优点，并克服了双抗体分离时间长和沉淀法非特异性结合高的缺点。,4固相分离法 将抗体通过特殊技术联结在固相载体上，免疫反应在固相载体上完成，达到平衡后形成固相的Ag-Ab 复合物，可与游离部分分离。 此方法具有操作简便，迅速，分离效果好，非特异性结合低等优点。,5.磁化分离法 6.葡萄球菌A蛋白分离法（SPA分离法） 7. 微孔滤膜法,放免分析的优点,灵敏度高 特异性强 精确度高 用血量少 缺点：污染；放射性核素衰变及不稳定,第三章 放射免疫分析,放射免疫分析法 免疫放射分析法 临床应用,1968年，Miles和Hales创立了免疫放射分析法（IRMA）。 IRMA与IRA不同，它是将放射性核素标记在抗体上，而不是标记在抗原上。同时所用的标记抗体与待测抗原比较是过量的。 Ag+Ab* Ag-Ab*+Ab* B F 由上式可见， IRMA不存在竞争反应，是待测抗原直接与标记抗体反应。待测抗原的量与抗原-标记抗体复合物的量成正相关关系。,免疫放射分析法 （immunoradiometric assay，IRMA）,1.单位点IRMA,单位点（one-site）IRMA是利用过量的标记抗体（Ab*）与待测抗原（Ag）进行免疫结合反应，形成抗原标记抗体复合物，当反应达到平衡后，再用固相抗原免疫吸附剂（SP-Ag）与剩余的标记抗体结合，并将其分离。,2.双位点IRMA,将抗体1结合于固相表面，加入标本后，待测抗原与固相抗体形成抗原-抗体复合物，并留在固相表面。洗去其他物质后，加入标记抗体2，在固相表面形成抗体-抗原-标记抗体复合物，再洗去多余标记抗体，即可达到分离目的。,竞争性分析与非竞争分析的比较,第三章 放射免疫分析,放射免疫分析法 免疫放射分析法 临床应用,放射免疫分析技术的临床应用,一 甲状腺疾病 二 代谢类疾病 三 骨和矿物质代谢 四 肿瘤 五 心血管疾病 六 器官移植中的药物监控,一 甲状腺疾病,TSH 促甲状腺激素 STSH 高灵敏度甲状腺激素 FT3 血清游离三碘甲状腺原氨酸 FT4 游离甲状腺素 TgAb 抗甲状腺球蛋白抗体 TmAb抗甲状腺微粒体抗体,临床上确诊为甲状腺功能亢进的步骤,临床上确诊为甲状腺功能减退的步骤,二 代谢类疾病,胰岛素原（proinsulin） 正常生理条件下，胰岛素原分子释放很少，占总分泌5%-10%，因此不考虑其对胰岛素测定的影响。在病理情况下，如胰岛素瘤，血中胰岛素原可达50%-70%。目前，市场上已有用纯胰岛素原做为标准品的放免药盒，可用来直接测定血清或血浆中的胰岛素原含量。,人真胰岛素(insulin specific) 不经处理的血浆，通过放免法测得的胰岛素称为免疫反应性胰岛素（IRI），IRI与胰岛素原有明显的交叉反应，当血清中胰岛素原含量较高时，应考虑对胰岛素测定的影响。 人真胰岛素放免分析可特异性测定人血清中与胰岛素原无交叉反应的胰岛素水平，是确切评价细胞功能和胰岛素敏感性的关键指标。,三 骨和矿物质代谢,1,25二羟基维生素D及25羟基维生素D 体内维生素D经日光紫外线照射、且在C1和C25位羟基化后，才能转变为有活性的维生素D代谢物。 测定血清中1,25二羟基维生素D及25羟基维生素D的浓度可鉴别与维生素代谢有关的疾病。目前国内用维生素D放免药盒用于维生素D缺乏症、骨营养不良、肝炎和药物性维生素D紊乱、甲状旁腺功能亢进或减退的测定。,降钙素（CT）和甲状旁腺激素（PTH） CT及PTH参与钙稳态调节机制：当血钙降低时，PTH分泌增加，作用于骨促进溶骨，钙自骨释出，同时作用于肾使肾小管对钙回吸增多。血钙上升则刺激甲状腺分泌CT抑制骨钙释放，同时促进肾小球对钙的排出。 CT和PTH的分泌功能彼此成反馈关系，机体通过它们互相拮抗作用维持代谢的内环境稳定。降钙素和甲状旁腺激素对钙代谢的调节不仅取决于它们在血中含量的绝对值，更重要是它们的比值。因此测定它们的比值对内分泌代谢病研究很有价值。,骨钙素（OC） 骨钙素由成骨细胞合成，在合成过程中不断有少量骨钙素释放到循环系统中，骨钙素的水平直接反映骨骼生成状况，其检测可以帮助评价骨骼更新程度，高水平的骨钙素与骨代谢病相关。 整分子骨钙素放免药盒（intact OC IRMA kit）可以用于软骨病、Paget骨病、甲状腺功能亢进、肾性营养不良、绝经后骨质疏松症的检测。,四 肿瘤,甲胎蛋白（AFP） 甲胎蛋白作为一种肿瘤特异性抗原，对早期诊断原发性肝癌具有较高灵敏性和特异性。阳性率在60%85%。 癌胚抗原（CEA） 癌胚抗原首先是从结肠癌和胚胎组织中提取的一种肿瘤相关抗原，癌胚抗原升高和消化道肿瘤密切相关。胃癌患者阳性率可高达50%以上。,糖类抗原（carbohydrate antigen，CA） CA50胰腺癌、肝癌、结、直肠癌、卵巢癌、子宫癌、胃癌、肺癌、食道癌。 CA19-9对胰腺癌和胆囊癌诊断有较高特异性，阳性率80%，绝对值升高明显。 CA125非粘液性卵巢癌诊断特异性强。 CYFRA21-1肺癌的诊断和疗效观察。,五 心血管疾病,内皮素（ET） ET是一种内皮细胞来源的血管活性多肽，主要分布在血管内皮细胞，具有强大的缩血管和促血管平滑肌细胞增殖作用。与冠心病发生密切相关。急性心肌梗死和高血压患者血中ET水平明显增高。,肌红蛋白（Mb） Mb广泛分布于心肌和骨骼肌中，正常人血中含量低。当心肌和骨骼肌发生损伤时，血中Mb含量明显升高。现已将Mb测定广泛用于心肌梗死诊断、预后判断及病情监测。正常参考值RIA为685ng/ml，男性高于女性。 心肌钙蛋白T（TnT） TnT是心肌细胞收缩器结构蛋白的一种，正常人血清中几乎测不到，而心肌梗死病人呈不同程度升高。 TnT检测能敏感发现心肌细胞损害。对诊断有价值。,六 器官移植中的药物检测,环孢素（Cyclosporine ） 环孢素是器官移植中最常用的免疫抑制剂。病人对药物的吸收有个体差异。美国DiaSorin公司提供的环孢素放免药盒，可以确定血中药物浓度的测定范围。据了解，在美国、台湾等地该药盒列为器官移植病人的必须检查项目。,FK506（Tacrolimus） 是一种真菌原的大环内酯类抗生素，它的免疫抑制能力比环孢素高1020倍。病人膳食及运动状况对FK506的吸收及生物有效性影响很大。 据报道，在520ng/ml范围内