WATERS公司的UPLC-TQD培训资料 MS12LC-MS method development.ppt

LC/MS 实验方法开发,主要内容,LC-MS的实验目的 电离方式的选择 ESI 或 APCI 正离子或负离子 色谱柱因素 直径和流速 管路连接（Plumbing） 流动相因素 pH 溶剂 其他 液质联用应用实例,基质干扰：Loop进样,In Methanol,In Tomato Juice,基质干扰: 用色谱柱将基质和分析物分离,In Methanol,In Tomato Juice,流速 样品类型 MW 范围 电离方式 (mL/min) ESI 0.001-1.0 多电荷离子 1000 Da (M+H)+, (M-H)- 及其碎片 1000 Da APCI 0.2-2.0 (M+H)+, (M-H)- 及其碎片 1000 Da,ESI vs. APCI,电喷雾 (ESI),优点 分子量信息 适合于挥发性和非挥发性分析物 适合于离子型/极性分析物 灵敏度高 高分子量测定 适合毛细管高效液相色谱,缺点 对LC流速有一定的限制，流速较低 在溶液中必须形成离子 在高盐浓度的条件下，容易有离子抑制 有限的结构信息,适合于ESI分析的化合物,典型正离子分析样品 肽和蛋白 弱极性化合物 环境污染物，例如农药和污染物 毒品、违禁物及其代谢产物,典型负离子分析样品 某些蛋白 寡核苷酸 有些糖( saccharides) 和 多聚糖(polysaccharides) 某些药物的代谢物 (例如 葡糖苷酸共轭物(glucuronide conjugates),大气压化学电离 (APCI),优点 分子量确认 使用方便 耐用性好 匹配LC高流速 2.0mL/min 灵敏度高,缺点 有可能发生热裂解 在低质量端的化学噪声大 不适合分析分子量大于 MW1000 Da的样品 有限的结构信息,适合于APCI分析的化合物,抗菌素(Antibiotics) 碱性药物(Basic drugs) 小分子化合物 甾族化合物(类固醇Steroids),雌激素类 (estrogens) 苯并二氮杂卓类(Benzodiazepines) 很多适合EI 电离源的样品,柱径因素,4 mm i.d.,2 mm i.d.,1 mm i.d.,0.5 mm i.d.,4000 ng,1000 ng,250 ng,62 ng,得到相同的信号强度，绝对进样量和柱径的关系,柱径因素（续） Peak Height vs. Column Diameter,CONDITIONS: 250 picomoles ACTH peptides on a Bondapak C18 column,流速因素,流速 (ml/min) (50/50 ACN/H20),0,0.5,1.0,1.5,2.0,50,100,Relative intensity,APCI,Pneumatically assisted ESI,Pure ESI,质谱接口的流速(HPLC色谱柱),色谱柱内径 流 速* 进入 MS的流速 mm L/min ESI APCI 4.6 1000 分流或直接 直接 3.9 500 分流或直接 直接 2.1 200-350 直接 直接 1.0 50-100 直接 N/A 0.3 (毛细管) 10 直接 N/A,质谱接口的流速(UPLC色谱柱),色谱柱内径 流 速* 进入 MS的流速 mm L/min ESI APCI 2.1 500 直接（调节气流） 直接 1.0 200 直接 N/A,LC大流速分流,分流的目的 得到最优化的流速条件 减少离子源污染 节省部分珍贵的样品 分流 250 uL/min 进入 质谱 测量进入MS的流量 由于浓度的因素可以保证ESI在柱后分流之后不损失信号强度,做一个分流器,提高进入MS流速可以： 加大废液管的长度 减少废液管的直径,流速因素,梯度延迟 2695系统体积（柱前体积）为 600 uL，Acquity系统体积约150uL 2695在 200 uL/min, 需花费大约 3 min 抵达柱头 Acquity在500uL/min，需花费大约 0.3 min 抵达柱头 色谱柱平衡时间 柱体积 = r2L 为得到好的柱平衡需要运行: (3x 系统体积) + (5x 柱体积) Acquity UPLC的柱平衡时间约2min,HPLC系统配置基础： 谱带展宽体积与滞后体积,死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时),注意滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路！,管路连接,不锈钢管 通常为LC使用 PEEK 管 通常为 LC/MS使用 易于连接 易于被 DMSO, THF, CH2Cl2 等溶剂溶涨 易于被 HNO3, H2SO4等腐蚀,减少死体积,*Successive changes from Row 2,*,下图:差的色谱结果 注意：色谱峰高降低，峰宽加大，较早洗脱的色谱峰拖尾尤甚,上图:良好的色谱结果,谱带展宽比较,系统配置(1): 色谱柱接头的种类,确保色谱柱适当连接 确保螺钉和锥箍固定在合适位置,色谱柱接头的安装,注：色谱柱接头连接不当 产生死体积(Parker型锥箍与Waters接头连接),密封(连接)良好,(建议:使用PEEK接头),死体积,由于色谱柱连接不当引起的谱带展宽,谱带展宽,死体积,连接适当,连接不妥,.009“,.020“,.040“,注意：连接管路内径的差异！ 对于LCMS常用0.007或0.005的管路,系统配置(2):管路内径,连接管路的影响:柱外谱带展宽,过长的管线亦会造成较大的谱带展宽,实例1：管线内径对柱效的影响,J. Li,下图： 柱效：4000 用0.04内径的管路测柱效的色谱图,上图：柱效：1,1000 用0.009内径的管路测柱效的色谱图,注：测试同一根色谱柱,在色谱柱与进样器之间使用不同内径的管线,实例 2:谱带展宽对分离度的影响,用户自己进行管线连接 灵敏度降低 仪器：Quattro Ultima 代谢产物研究,改善了管线连接 更换了进样器与切换阀及质谱检测 器之间的10个接头 拆掉了4内径0.005的多余管线,灵敏度提高一倍 位于主峰尾部的代谢 产物得以分离检测,用户原有色谱系统,优化的系统,J. Li,ES- TIC,液质联用中流动相的选择,有利于色谱分离-满足LC的需要 有利于电离满足MS的需要 流动相纯度影响质谱检测的重要因素 对样品的溶解度 对色谱柱填料的损害,2 weeks,1 day,1 week,1 hour,Control,5,10,15,20,25,0,Minutes,保存于聚乙烯瓶中的超纯水,Conditions Water samples: 40ml trace enrichment 2.0 ml/min Column: C18 reversed phase (Waters) Gradient: linear 100% water to 100% acetonitrile Wavelength: 254 nm,1 day,1 week,Control,5,10,15,20,25,0,Minutes,保存于标准棕色玻璃瓶中的超纯水,Conditions Water samples: 40ml trace enrichment 2.0 ml/min Column: C18 reversed phase (Waters) Gradient: linear 100% water to 100% acetonitrile Wavelength: 254 nm,pH 因素来自MS的要求,分析碱性化合物 - 正离子模式 加酸降低 pH 例如:甲酸或乙酸，甲酸铵-甲酸，乙酸铵-乙酸 分析酸性化合物 - 负离子模式 加碱提高 pH 例如:氨水，碳酸氢铵-氨水 分析混合物或未知物 - 正、负离子同时扫描,pH 值的影响,pH 值的影响,pH 因素来自反相HPLC的要求,分析酸性化合物 若有利于保留 加酸性缓冲盐,控制低 pH,抑制酸性样品的电离 例如:磷酸盐或乙酸盐 分析碱性化合物 若有利于保留 加碱提高 pH,例如:氨水,三乙胺,但只有少数色谱柱可以忍受(硅胶基质色谱柱pH为28) 加离子对试剂(对大多数色谱柱) LC与MS在流动相上的矛盾 解决方案：选用合适的色谱柱，避免使用缓冲盐，或 选用对MS影响较小的缓冲盐,LCMS常用的流动相和添加剂,流动相 水 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 异丙醇,添加剂 乙酸 甲酸 氢氧化铵 甲酸铵* 乙酸铵* 碳酸氢铵,* 盐浓度应限制在 10 mM 以下。,不适宜的添加剂,非挥发性的盐 (磷酸盐, 硼酸盐, 柠檬酸盐, 等等) 会在离子源部分结晶、沉积 (需要更多的清洗和保养) ZSpray 设计可以最大程度的容忍不挥发性的盐 表面活性剂 / 洗涤剂 会抑制电喷雾电离 无机酸 腐蚀剂 (具腐蚀性),不适宜的流动相和添加剂,三氟醋酸 (TFA) 浓度 0.01% 时会抑制电喷雾的正离子 会大大抑制电喷雾的负离子 三乙胺 (TEA) 对弱碱性化合物而言，将会抑制电喷雾的正离子 极容易电离得到非常强的 m/z 102 分子离子（MH+ ） 四氢呋喃 (THF) 100% THF 非常易燃 如果雾化气中含有较多空气时，不要用于APCI,TFA 对利血平(ESI)响应值的影响,% TFA (0 是 50/50 ACN/H2O),Response,一般而言,样品信号强度随着其它电解质浓度的增高而降低. 这一现象叫作离子抑制. 样品离子和电解质离子对电荷及占据液滴表面的竞争导致离子抑制.,ESI:流动相对样品响应的影响,ESI:流动相对样品响应的影响(续),甲基氢化强的松APCI 质谱图 (正离子),未加醋酸铵,加 100 mM醋酸铵,样品比溶剂 CH3CN/H2O 具 有更大的质子亲和力，而醋 酸铵的质子亲和力比样品大,甲基氢化强的松APCI 质谱图(负离子),未加醋酸铵,加 100 mM醋酸铵,M+OAc)-,样品的气相酸性 大于溶剂，而小于 醋酸铵,常用溶剂 乙腈,常用溶剂 甲醇,溶剂的选择,使用同位素模型预测质谱峰,流动相配比的影响,HPLC等度和梯度方法比较,等度 LC,梯度 LC,溶样溶剂,样品全溶解于水中,样品溶解于流动相中,建议用流动相溶解样品。如果是梯度，用梯度起始流动相溶解样品。,色谱柱温度变化的影响,液质联用中缓冲盐的选用 果汁中杀菌剂残余物分析实例,Jim Krol and Michael Young Waters Corporation,杀菌剂涕必灵和多菌灵的结构,内吸杀虫剂用于抑制水果和蔬菜中的霉菌生长; 也被用作兽医杀灭寄生虫的药物,杀菌剂LC/PDA 检测的色谱条件,0,10,5,50 mAU,1,2,1 多菌灵 = 70 ppb 2 涕必灵 = 130 ppb 色谱柱: XTerra RP18, 4.6 x 100 mm, 3.5 m 流动相: 72% 20 mM 磷酸盐, pH 6.8 28% 乙腈 流 速: 1 mL/min 检测器: PDA 扫描 200 400 nm 提取288 nm 进样体积: 20 L,10 mL 市售苹果酒 OASIS MCX 小柱 SPE 方法 B,Minutes,杀菌剂LC/PDA 检测的色谱条件,仪 器: Waters ZMD Zspray 质谱检测器 接 口: 电喷雾正离子 (ESI+) 源温度: 125 扫描功能: 多重选择离子监测方式 (SIR) SIR 时间 锥孔 停留 Group 分 化合物 Mass 电压 时间 0-6.5 多菌灵 192.1 25V 1.0 秒 6-15 涕必灵 202.0 35V 1.0 秒,MS条件,质谱检测器的控制和数据处理由Mass Lynx完成,液质联用分析多菌灵和涕必灵 为适合MS ESI检测器而改进的色谱条件,HPLC: Waters Alliance 系统 色谱柱: Waters XTerra MS C18, 2.1 x 100 mm, 3.5 m 流动相: 80% 10 mM NH4HCO3 缓冲液 (pH 9) pH 用 NH4OH 和 HOAc调节 /20% 乙腈 流 速: 200 L/min;检测器前分流 50/50 进样体积: 5 L PDA: 扫描 200 400 nm; 提取 288 nm,流动相 pH 和用于 ESI质谱检测器 的缓冲液的选择,对于MS检测器,乙酸铵或甲酸铵是典型的挥发性缓冲盐其天然 pH 值约为 7; 用 NH4OH 可以调至碱性 pH ,但是几乎没有缓冲能力 碱性流动相会从空气中吸收 CO2 将会引起 pH 和组成的改变 碳酸氢铵天然 pH 为 8.4 较高的挥发性; 于 60C分解, 直到 pH 10 均有良好的缓冲能力 吸收 CO2最低,碳酸氢铵的化学,在 MS 接口处 NH4HCO3 NH3 + CO2 + H2O,60C,NH4HCO3 + H2O NH4+ + HCO3- + H2O pKa : NH4+ NH3 + H+ 是 9.24 pKa : HCO3-+ H+ H2CO3 是 6.2 pKa : HCO3- H+ + CO32-是 10.3,溶液中,缓冲范围 6.2 10.3 10 mM 溶液的 pH 是 8 8.2,9 x 104,缓冲盐类型的选择对响应的影响,缓冲盐选择小结,LC/UV 方法需要改进才能用于 MS 检测; 尽量避免使用非挥发性缓冲盐 在碱性 pH下可以做正的ESI 用 Waters XTerra 色谱柱做碱性 pH 扩展了色谱的选择 碳酸氢铵对于碱性 pH (8 10) 工作是最佳缓冲盐,液质联用中色谱柱的选择,一般多采用反相柱(C8,C18) 都是C18色谱柱,难道还有什么不一样吗？ 不同的品牌即是不同的色谱柱 选用能使用简单流动相