农业细胞工程ppt课件

2019/4/17,1,第二章,农业细胞工程,2019/4/17,2,细胞工程：指在细胞水平上，重组细胞的结构和内含物，以改造生物的结构和功能的生物技术。 （1）动物细胞工程 （2）植物细胞工程 （3）微生物细胞工程,2019/4/17,3,（1）动物细胞工程,建立基础：细胞融合 实际应用：单克隆抗体、胚胎移植、胚胎切割、动物克隆、动物生物反应器等。,2019/4/17,4,（2）植物细胞工程,建立基础：植物细胞全能性。 应用技术：原生质体培养、细胞杂交、植物组织和细胞培养、花药花粉培养、植物细胞突变体的筛选及利用、植物脱毒和快繁技术以及次生物质生产等等。,2019/4/17,5,（3）微生物细胞工程,建立基础：微生物发酵 应用技术：培育高产菌株，有效利用微生物细胞本身或细胞代谢产物。 发酵：指利用微生物细胞生产各种目的产物。,2019/4/17,6,细胞工程的意义,细胞工程克服了常规杂交的局限性，使远缘杂交有了新的途径。 创造杂交物种： 土豆番茄 大豆烟草 芹菜一胡萝卜等。,2019/4/17,7,细胞工程的应用,2019/4/17,8,本章主要内容,第一节 组织细胞培养技术 第二节 植物的快繁与脱毒 第三节 人工种子 第四节 单倍体技术 第五节 细胞杂交技术 第六节 动物胚胎工程 第七节 动物克隆技术,2019/4/17,9,第一节 组织培养技术,一、组织培养的概念及发展历程 1、概念 组织培养：指在离体条件下，利用生物体的一部分，在人工控制的培养条件和环境条件下，使其分化生长的技术和方法。 理论基础：植物细胞全能性学说。,2019/4/17,10,植物细胞全能性,指植物的每一个生活细胞在适当的条件下都可以通过分裂和分化再生成一个完整植株。 基本细胞（含全套遗传信息）分化各种特异组织细胞完整的个体 特异组织细胞脱分化基本细胞分化各种特异组织细胞完整的个体。,组 织 培 养,叶肉组织,愈伤组织,新植株,2019/4/17,12,2、发展历程,1839-1902 植物细胞学说 1902 细胞全能性学说 1904-1934 离体培养探索 1934-1943 基本条件建立 1948-1972 激素，原生质体培养 20世纪70S以后 应用阶段,1902，Haberlandt，“植物细胞具有全能性” 1904，Hanning，萝卜幼胚成熟胚植株，组培鼻祖。标志离体组织培养技术的开始。 1934，White，番茄根愈伤植株。 1939，White，烟草幼茎愈伤植株。发展迅速 1940-50S，培养效率提高。 1952，Martin，大丽花茎尖脱毒植株。快繁脱毒新途径。 1956，Miller，KTIAA控制机制。 1958，Steward，胡萝卜悬浮组培，证明细胞“全能性”。 1964，CuhaMaheshwari，蔓陀罗小孢子，单倍体育种途径。 1970，Carlson，烟草体细胞诱变育种。 1971，Takebe，烟草叶肉原生质体培养，细胞杂交。 1972，Carlson，粉兰烟草 + 郎化烟草细胞杂种植株。,组培发展,2019/4/17,14,二、组培的基础知识,1、培养条件 2、培养方式 3、基本设备,2019/4/17,15,1、培养条件,1）无菌条件（最基本、最关键） 常用灭菌法：高温高压法、火焰干热法、紫外照射法、化学消毒剂（酒精、升汞、次氯酸等）冲洗法等。 2）营养条件（培养基） 培养基是培养物的人工土壤。 培养基基本成分：无机营养物、碳源、维生素、生长分化调节物质及有机附加物等五类。 3）环境条件 光照条件、温度条件和湿度条件。,2019/4/17,16,2、培养方式,1）固体培养 指将培养物器官或组织置于固体培养基上培养。 2）平板培养 指将细胞或原生质体混合在含琼脂的培养基中，在培养皿中做成平板培养。 3）液体培养 指将培养物悬浮或飘浮在液体培养基中培养。 4）其他 发酵培养和固相化细胞培养等。,2019/4/17,17,3、基本设备,1）无菌室 无菌室=缓冲室+接种室。 2）超净工作台 最基本的无菌操作装置。 3）操作器械 剪刀、解剖刀、镊子等,2019/4/17,18,三、植物组培的技术程序,1、培养基的配制 2、培养物的选择和消毒 3、细胞或组织的无菌接种和培养 4、继代增殖 5、植株再生 6、实例,2019/4/17,19,1、培养基的配制,根据培养目的、培养物、培养阶段的不同配制适宜的培养基。 1）直接称取法 按配方，逐一称取所需成分。 成分多，易出错；称量误差大。极少用。 2）母液法 分类预配高倍母液，用时按比例量取。 操作简单，减少称量误差。常用,2019/4/17,20,2、外植体的选择与消毒,外植体指用于植物组织细胞培养的植物体的一部分（器官、组织、细胞及原生质体） 。 1）选择 一要新鲜，二要尽量少损伤，三要尽快接种。 2）外植体的消毒 常用消毒剂：75%酒精、升汞、次氯酸钠（钙）、漂白粉、双氧水等。 一般程序：外植体自来水多次漂洗消毒剂处理无菌水反复冲洗无菌滤纸吸干。,2019/4/17,21,3、接种培养,在超净工作台上进行。严格遵守无菌操作规程： （1）入室前，洗双手，去污垢。 （2）入室时，换装备。 （3）操作前，75%酒精擦洗双手，彻底消毒。 （4）操作中，常擦手，不讲话，不乱动，工具常消毒。 接种后，材料在适宜的条件中培养，常察看。,2019/4/17,22,4、继代增殖,1）继代的必要性 愈伤46周后，原有养分耗失；有害代谢物积累。 2）继代的作用 扩增愈伤细胞数，利于获得更多的胚状体或小苗。,2019/4/17,23,5、植株再生,1）过程 愈伤组织重新分化胚状体小植株。 2）注意事项 光照为必备外因。 小植株要适时移栽。 移栽前炼苗提高成活率。 胚状体指在组织培养中分化产生的具有芽端和根端类似合子胚的构造。,2019/4/17,24,6组织培养实例,试验所用材料采自泰山，经鉴定为穿龙薯蓣（Dioscorea nipponica），取其幼根、茎尖、带腋芽茎段、叶片和种子等分别为外植体。,2019/4/17,25,培养条件,MS基本培养基：矿质元素+MS有机物+8g/L琼脂+30g/L蔗糖，附加不同浓度激素，培养温度为(251)，光照强度为2000lx，光暗各12h。,2019/4/17,26,试验设计,技术路线,2019/4/17,27,6.1 培养基及激素组合对愈伤组织诱导的影响,2019/4/17,28,从表中可以看出，以MS为基本培养基，诱导率最高可达100%，高于其他培养基，且褐化率较其它培养基低，故愈伤组织诱导阶段宜选用MS作基本培养基。 当2,4-D、6-BA浓度一定时，不添加KT也可诱导出愈伤组织，但出愈率较低，说明在轮叶党参愈伤组织诱导阶段宜选用较低浓度的生长素和较高浓度的细胞分裂素。,2019/4/17,29,叶片愈伤,茎段愈伤,种子愈伤,叶柄愈伤,图版 不同外植体诱导出的愈伤组织,2019/4/17,30,6.2 不同外植体诱导愈伤组织的比较,出愈率：叶片茎段叶柄种子； 生长速率：叶片诱导的愈伤生长最快，24.5mg/d； 形态特征：叶片及种子愈伤紧密，茎段及叶柄愈伤疏松易碎。 综合考虑以上几个方面认为叶片是最佳外植体。,2019/4/17,31,6.3 激素及光照对愈伤组织继代培养的影响,2019/4/17,32,暗培养愈伤组织增殖倍数相对较小，且易褐化死亡；光照16h/d下，愈伤组织增殖倍数高于光照8h/d，说明光照16h/d更有利于愈伤组织的增殖。当培养基中仅仅添加NAA时，愈伤组织的增殖倍数极低，而培养基中只添加6-BA时，愈伤增殖系数相对较高，因此继代时应该有6-BA的存在。在4号培养基上，即MS培养基附加6-BA 0.75mg/L和NAA 0.5mg/L，光照16h/d条件下，愈伤增殖倍数最高，达9.5，愈伤组织生长迅速，呈淡黄绿色，质地紧密，这种继代培养的愈伤组织在后期的分化过程中分化程度较高。,2019/4/17,33,6.4不定芽的诱导,2019/4/17,34,在愈伤组织的分化过程中宜选用较低浓度的6-BA。从表中可以看出，相对于光照8h/d，光照16h/d下再生苗分化率更高，获得的再生苗健壮，叶片较多，而光照8h/d下得到的再生苗瘦弱不易生根。 筛选出最佳分化培养基为1/2MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L，光照16h/d条件下，愈伤组织分化率高达89.4%。,2019/4/17,35,不同光照条件下获得的再生苗,每天光照16h获得的再生苗,每天光照8 h获得的再生苗,2019/4/17,36,不同激素配比对生根的影响,6.5生根培养,2019/4/17,37,1,2,再生苗生根情况,筛选出最佳的生根培养基为: 1/2MS+IAA 0.2mg/L+ NAA 0.2mg/L。,2019/4/17,38,3,2,建立的再生体系,注：以叶片为外植体说明该过程,2019/4/17,39,愈伤组织诱导生长过程图,接种7d的愈伤组织,刚接种的幼胚,2019/4/17,40,四、植物组培技术类型,1、器官培养 植物脱毒、快繁、遗传转化及突变体筛选等 2、胚胎培养 远缘杂交育种 3、花药（粉）培养 倍性育种 4、细胞培养 次生物质； 5、原生质体培养 体细胞杂交或生物技术受体,2019/4/17,41,五、植物组培的发展现状,1、培养对象 外植体+培养物 2、培养方法 浅层、双层、悬浮、看护、包埋 3、培养规模 单细胞微滴大型培养罐 4、应用途径 1）直接再生 外植体继续发育再生植株 2）胚状体 外植体胚状体再生植株 3）愈伤组织 外植体愈伤组织胚状体或原生质体或再生植株 5、细胞工程产业化 600多种植物 我国：香蕉、苹果、甘薯、草莓、大蒜等。 2010年建立10个脱毒快繁中心。,2019/4/17,42,六、植物组培的应用前景,农作物育种、遗传、生理、生化和病理学研究等 1、作物育种 1）单倍体育种。烟草单育1号、小麦京花1号 2）远缘杂交育种 3）体细胞杂种 4）细胞突变体 5）种质保存 2、脱毒快繁 马铃薯、甘薯、草莓、大蒜、康乃馨、甘蔗、菠萝、香蕉、咖啡、苎麻、樱桃、藕等100多种。 3、次生产物生产 蛋白质、脂类、糖类、药物、生物碱等,第二节 植物的快繁与脱毒,单个 细胞,营养培养基,克隆植株,快速无性繁殖,2019/4/17,44,一、植物快繁技术,（一）意义 1、提高繁殖系数 自然2-10倍；组培：数十万倍 2、珍稀奇植物繁殖 无籽西瓜；安徽软籽石榴 3、种质保存 组培苗/胚状体/细胞/原生质体 4、人工种子 5、植物脱毒,2019/4/17,45,（二）常用快繁技术,外植体成苗繁殖体增殖生根移载。 外植体：茎尖、腋芽，根/茎/叶/花器片段 1、茎培养技术 幼茎/茎尖/幼芽试管苗 2、叶培养技术 叶片不定芽试管苗 3、幼胚培养技术 幼胚试管苗 4、胚乳培养技术 禾本科；猕猴桃/柑桔 5、幼穗培养技术 禾本科 6、胚根/胚芽/胚轴培养技术 双子叶,2019/4/17,46,二、植物脱毒技术,（一）植物脱毒的意义 植物病毒200多种，导致植物生长受抑制、产量和品质下降、种性退化。低产劣质的主要原因。 草莓：62种病毒，日本年损失500亿日元 马铃薯：30多种病毒，世界年损失3000万吨 植物病毒系统发病，长期积累，药物难以防治。 防治途径：组培无毒苗大田生产 无毒苗产量提高30-300，品质大幅提高 克山农科所脱毒马铃薯“男爵”，增产158%,2019/4/17,47,（二）植物脱毒研究进展,1952，Morel，大丽花茎尖脱毒苗 1960，Morel，兰花茎尖脱毒苗1年400万脱毒苗 “兰花工业” 20世纪70年代， 果树（如香蕉、苹果、葡萄） 90年代，脱毒植物 60种，除去病毒 80种 工厂化生产：花卉/果树/蔬菜/林木/药用植物 快繁/脱毒：应用最广/成效最大的细胞工程技术 法国：马铃薯、大蒜、康乃馨100%脱毒苗 日本：草莓、葡萄、苹果等 我国：1974起步，90年代，规模应用。 马铃薯，甘薯，苹果，香蕉，草莓，大蒜等 马铃薯：100品种，120万脱毒苗，35-40万亩,2019/4/17,48,（三）植物脱毒方法,病毒病防治的三种主要方法： 1、物理方法 2、化学方法 3、生物学方法。,2019/4/17,49,1、物理方法,温度处理 利用植物细胞和病毒对温度的耐受性不同，选择一个合适的温度和处理时间，使寄生体内的病毒失活而植物能够存活。 （1）高温处理脱毒(热疗法) 耐高温能力：植物病毒。 温汤处理：50温水，数分/数小时。方法简便，易伤材料 热风处理：温箱，35-40/数小时-数月。 康乃馨：38，2月；马铃薯：35，2-3月；草莓：36，6周。 变温方法：马铃薯，404h/16-2020h 热疗法缺陷：部分病毒对温度不敏感：对球状病毒/类线状病毒/类菌质体有效；对杆状/线状病毒无效。高温钝化植物抗病毒因子 （2）低温处理脱毒(冷疗法) ： 4-5低温，病毒不繁殖，老化死亡。,2019/4/17,50,2、化学方法,常用化学药剂：孔雀绿、硫鸟嘧啶、8-氮鸟嘌呤、氨基酸、抗菌素等。 缺点：对寄主植物具有毒害作用。 效果：整株处理效果差； 离体组织/原生质体处理效果好 。,2019/4/17,51,3、生物学方法,原理：病毒浸染植株后，通过胞间连丝或筛管进行转移。病毒分布，成熟器官含量高，幼嫩器官含量少，茎尖的分生组织几乎不带任何病毒。因此，利用茎尖分生组织培养可获得无病毒植株，这是目前防治病毒病的最有效的方法。 基本途径：1）茎尖培养，2）愈伤组织培养，3）花药培养，4）珠心胚培养，5）茎尖嫁接等。,2019/4/17,52,1）茎尖培养,原理：茎尖分生组织无维管束，病毒通过胞间连丝传播，速度细胞分裂，生长点无病毒。 程序：茎尖组培无病毒株。 效果：有效脱毒技术/49种脱毒 应用：非常广泛,2019/4/17,53,2）愈伤组织培养,原理：愈伤无维管束，细胞分裂病毒传播速度。 程序：感毒植株 愈伤组织 带毒株 + 无毒株 效果：高于茎尖培养脱毒 应用：烟草、马铃薯、草莓、唐菖蒲、大蒜、大葱,2019/4/17,54,3）花药培养,花药不带毒。 花药小孢子植株无毒 王国平等：12个草莓品种，花药培养，再生株脱毒率100% 。,2019/4/17,55,4）珠心胚培养,柑桔类：一个受精胚 + 多个珠心无性胚 珠心细胞不带毒，但珠心胚不育，果实成熟前离体培养脱毒幼苗。 如： 柑桔银屑病、叶脉突出症、柑桔裂皮病等。,2019/4/17,56,5）茎尖嫁接,木本植物茎尖培养难度大，砧木离体种植，取茎尖为接穗，试管微体嫁接无毒苗。 柑桔：无毒苗生产，嫁接成活率30-50%，移植成活率95%，嫁接后2年结实。 桃：成活率40-70%。 苹果：应用成功。,2019/4/17,57,三、茎尖培养脱毒快繁技术,1、母株选择 2、幼茎获得 3、茎尖剥取 4、茎尖接种培养 5、植株再生 6、无性繁殖系建立 7、脱毒植株鉴定 8、无毒苗的快繁及推广,2019/4/17,58,1、母株选择,典型性个体 应用推广 病毒预鉴定 提高效率,2019/4/17,59,2、幼茎获得,直接截取 高温催芽,2019/4/17,60,3、茎尖剥取,（1）茎尖大小 培养成活和脱毒成功的关键。 茎尖大小/脱毒效果 (反比) 茎尖大小/组培成活率 (正比) 取茎尖：无毒/尽量大 一般0.2-0.5mm，带1-2叶原基，因植物而异 （2）剥取方法 双子叶：3-5cm芽消毒剥幼叶切0.2-0.5mm生长点。 单子叶：剥叶鞘芽消毒切生长点。 球鳞茎植物：球茎逐层剥鳞片逐次消毒切,2019/4/17,61,4、茎尖接种培养,1）注意事项 接种工具次次消毒； 接种尽量快速，防风干防感染。 2）培养条件 温度24-27 光照1000-3000lux 光照16Hr/天。 3）生长类型,2019/4/17,62,生长类型,（1）生长正常型 茎尖渐绿，渐长，一个月，见小茎，叶原基形成可见小叶，说明各因子都很合适。 （2）生长缓慢型 茎尖不见大，渐绿，最后绿点，细胞老化休眠或变褐死亡。 原因：生长素浓度偏低或培养温度过低。 （3）生长过旺型 茎尖明显增大，一周，愈伤组织，茎尖不伸长，颜色较淡，后形成半透明状愈伤组织，丧失成苗能力。 原因：生长素浓度偏高、光照太弱或温度过高。,2019/4/17,63,5、再生植株获得,茎尖正常生长到2-3片小叶时，就可转入生根培养基中，进一步培养可获得再生植株。,2019/4/17,64,6、无性繁殖系的建立,小植株6-7叶，切段培养，建立无性繁殖系，循环，逐级扩大繁殖系数。 马铃薯切段：1叶原基/节。 草莓：大量侧芽，侧芽循环培养。,2019/4/17,65,7、脱毒植株的鉴定,再生植株脱毒植株，非100%无毒。 大量繁殖前鉴定： 病毒延迟恢复稳定期鉴定 无病毒植株易再感染不同繁殖阶段鉴定 常用检测方法：直接测定法、指示植物测定法、血清学测定法、电镜测定法、生物学方法等。,2019/4/17,66,（1）直接测定法,方法：直接检测植株有无病毒病症状。 优点：最简单、直观。 缺点：无法快速检验。症状表现。,2019/4/17,67,（2）指示植物法,指示植物：指对于某种或某些特定病毒非常敏感的植物。 常用指示植物：曼陀罗、有荆芥、苋色藜、千日红、牵牛花、辣椒和烟草等。 马铃薯病毒：千日红和曼陀罗 康乃馨斑纹病毒：苋色藜 甘薯病毒：千日红，牵牛花,2019/4/17,68,检测方法,接种检测：待检株叶汁涂指示植物防虫网观察指示植物有无病毒症状。 优点：简便、易操作、成本低，广泛应用。 缺点：不能定量，鉴定时间长（一到数周），多年生木本植物/草莓等接种困难。 嫁接检测：待检植物切段嫁接指示植物观察有无发病症状。 甘薯巴西牵牛：10天可观察。 优点：灵敏度高，方法简单，成本低； 缺点：时间长，不能区分病毒种类。,2019/4/17,69,（3）血清学检测法,原理：用已知病毒的抗血清鉴定未知病毒。 抗血清的制备：已知病毒注射兔子抗体取兔子血清检测相应病毒。 注射不同病毒 相应抗血清。 方法：被测株汁液离心上清液滴入抗血清中如出现沉淀有该种病毒。 特点：高度专一性，快速定量，最常用方法。,2019/4/17,70,（4）电镜法,利用电子显微镜直接观察，可检查病毒有无，病毒颗粒大小、形状和结构，以此来确定病毒的种类和数量。 该法准确可靠，但成本高。,2019/4/17,71,（5）生物学方法,利用分子标记来检查，如PCR检测等。 病毒分子序列分析分子探针标记 鉴定后的无毒苗，相对“无毒”：其它病毒无法鉴定“无特定病毒”苗。,2019/4/17,72,8、无毒苗的扩繁及推广,无毒苗需经生产性能鉴定：无毒苗防虫室种植形态、农艺性状和生产能力鉴定品种典型性和丰产性好的类型快繁推广。 原因：组培变异？！ 无毒苗抗病毒苗：扩繁/推广传毒媒介重新感毒。 适宜繁育体系： 试管苗离体快繁：系数大，速度快，成本较高 常规繁殖：“二圃制” 试管苗移栽圃：温室，防蚜网 原种圃(1-2代)：防蚜棚，大量繁殖 早春/晚秋繁殖，媒介少 大田生产,2019/4/17,73,第三节 人工种子,天然种子是有性繁殖的产物，季节限制，繁殖系数低。 试管苗无性繁殖，贮运困难，成本过高。 人工种子（Artificial Seed） =组培快繁+生长发育理论+生产技术成果。 传统种业的革命。世界各国十分重视。,2019/4/17,74,一、人工种子的概念,人工种子指通过人工组织培养获得植物体细胞胚胎，在其外部包上人工胚乳和人工种皮，以代替天然种子传播的结构。,种被：果种皮，保护作用 籽粒 胚乳：淀粉、蛋白质、脂肪等，营养源。 胚：发育为植株。 天然种子构造,2019/4/17,75,二、人工种子研究概况,世界范围： 1978，Murashige，人工种子设想。 1980，Janick，胡萝卜饼状囊，萌发率1-4%。 1984，Redenbangh，苜蓿球形种子，86%。 1983，美国，人工种子技术专利1项和人工种皮专利2项。 1986，日本，芦笋和胡萝卜人工种子专利。 目前，胡萝卜、芹菜、莴苣、柑桔、咖啡、棉花、玉米、水稻等成功。,2019/4/17,76,我国人工种子,起步晚，发展快，水平高。1987，“863”计划 北大：胡萝卜(李修庆)； 中科院遗传所：橡胶(陈正华)； 中科院植物所：西洋参等(郭仲琛)； 中山大学： 南方特有果树(李宝健) 橡胶树、首蓿、胡萝卜、旱芹、小麦、番木瓜、黄连和杂交水稻的人工种子已进入开发阶段。 萌发率：90以上（无菌土壤80-96%，有菌70-80%）。 2010 ，人工种子工厂化、自动化生产。,2019/4/17,77,三、人工种子的结构及特点,2019/4/17,78,（1）人工种皮,外层胶质化合物薄膜。 作用： 允许内外气体交换畅通； 防止人工胚乳中水分及各类营养物质的渗漏； 具备一定的机械抗压力，方便储藏和运输。,2019/4/17,79,（2）人工胚乳,胚状体生长发育需要的营养物质。 构成： 人工胚乳=基本培养基+添加剂 培养基：以生成胚状体的培养基为主要成分。 添加剂：植物激素、抗生素、农药以及除草剂等。,2019/4/17,80,（3）胚状体,胚状体萌发植株 胚状体特点： 组织培养产生 具有胚芽、胚根双极性 类似天然种子胚,2019/4/17,81,人工种子的优点,不受环境因素制约，一年四季可进行工厂化生产； 由于胚状体是经人工无性繁育产生，有利于保存该种系的优良性状； 与试管苗相比，人工种子成本更低，更适合于机械化田间播种； 可根据需要在人工胚乳中添加适量的营养物、激素、农药、抗生素、除草剂等，以利胚状体的健康生长。,2019/4/17,82,四、人工种子的生产流程,2019/4/17,83,1、胚状体的制备及其同步生长,制备：外植体培养胚状体。 缺陷：胚状体发育不同步，即处于胚胎发育的不同时期。 核心问题：诱导胚状体的同步化生长。 措施：低温法；抑制剂法；分离法；通气法；渗透压法；,2019/4/17,84,低温法,方法：培养早期，低温处理，后恢复正常。 原理：低温阻碍微管蛋白的合成，纺锤体形成受阻，滞留于有丝分裂中期的细胞增多。此时再让培养物回复到正常温度，细胞则同步分裂。,2019/4/17,85,抑制剂法,方法：培养初期添加抑制剂，后去除，促同步。 原理：细胞培养初期加入DNA合成抑制剂，如5-氨基尿嘧啶等，使细胞生长基本上都停顿于Gl期。除去抑制剂后，细胞进入同步分裂阶段。,2019/4/17,86,分离法,原理：不同发育时期的胚状体大小和密度各不相同。 方法： （过筛或离心）在细胞悬浮培养的适当时期，用一定孔径的尼龙网或钢丝网或密度梯度离心法，收取处于胚胎发育某个阶段的胚性细胞团，然后转移到无生长素的培养基上，使多数胚状体同步正常发育。,2019/4/17,87,通气法,方法：在细胞悬浮培养液中每天通入氮气或乙烯12次，每次几秒或更长时间，可显著提高有丝分裂同步率。 原理：不清。,2019/4/17,88,渗透压法,原理：植物胚状体的渗透压值，随发育进程而呈现规律性的从高到低的变化。 方法：可配制特定渗透压值的培养基而使胚状体的发育停留在指定的阶段，从而达到同步发育的目的。 如向日葵球形胚的渗透压为17.5。,2019/4/17,89,注意,目前该问题尚未完全解决。 除外因外，物种及不同外植体细胞的敏感性，对实现同步生长也有很大影响。 胚状体要经自然干燥过程。 含水量高，成熟度差，难贮存。 一般应经自然干燥47天，使胚状体转为不透明状为宜。,2019/4/17,90,2、人工胚乳的制备,人工胚乳因物种而异。 基本培养基+天然大分子碳水化合物+添加物 常用人工胚乳： MS（或SH、White）培养基+马铃薯淀粉水解物（1.5） 0.5SH培养基+麦芽糖（1.5）等 添加适量激素、抗生素、农药、除草剂等,2019/4/17,91,3、配制包埋剂及包埋,包埋剂：褐藻酸钠、琼脂、白明胶等。 褐藻酸钠是目前最好的人工种子包埋剂，它无毒、使用方便，具有一定的保水、透气性能，机械性能较好，价格较低。,2019/4/17,92,人工种子的包埋,人工胚乳+4褐藻酸钠+胚状体 混匀，逐滴滴到 2.02.5Cacl2 1015min离子交换络合 无菌水漂洗20min，终止反应 晾干 人工种子,2019/4/17,93,4、人工种子的包装,包埋后，经过晾干就可包装销售。,2019/4/17,94,克服沾粘和变干措施：,Elvax 4260涂料：美国杜邦公司，表面处理，效果较好。 5% Cacl2或滑石粉：表面处理，抗粘，也有一定效果。 抗粘剂：改良PVF-2，中山大学，1990 ASC1，北京大学，1990,2019/4/17,95,五、人工种子的贮存与萌发,迄今尚未攻克的难关。 一般保存方法：低温（47）、干燥（相对湿度67%）。 胡萝卜，两个月，发芽率100。 但这种贮存方式的费用昂贵。 自然条件：贮存时间较短，萌发率较低。 1990，柯善强，黄连，未消毒土壤，4.45.2。,2019/4/17,96,人工种子状况评价,研制尚处于实验室研究阶段 产业化前景诱人 各国巨额资金投入,2019/4/17,97,第四节 单倍体技术,一、单倍体技术的含义 单倍体育种技术指在不经正常受精过程的情况下，由单倍体性细胞单独发育成完整的植株体，再经染色体加倍，获得基因型纯合、遗传性稳定的纯系的育种过程。 快速、高效的植物育种新途径。,2019/4/17,98,二、单倍体技术的应用,1、新品种培育 我国单倍体育种技术居世界前列。 1）水稻：50多个，占世界的25%。 1988，南农，籼稻原生质体，世界首次改造籼稻品质。 中国农科院作物所，中花8号、9号、10号、花寒早等15个水稻新品种，推广面积1千多万亩。 华中师范大学，籼稻蛋白质13.72%14.81%，比世界水稻蛋白质含量约高近1倍。 高千粒重杂交稻：60克，世界50克，“东方魔稻”。 2）小麦： “京花1号”、“京花3号”、“小偃107号”等6个良种，推广500万亩。,2019/4/17,99,2、自交系选育,单倍体杂种优势利用。 玉米：花培纯系100多个。 山东农大：山农3号、山农973、山农985，糯1号，泰爆2号等。,2019/4/17,100,3、基因转移,染色体： 利用花粉植株选择代换系或附加系。 基因转移： 抗稻瘟病基因：中国农科院沈锦骅，2年，Pi一ZT基因，中花8号和9号品种。,2019/4/17,101,4、突变体选择及其利用,单倍体无显隐性关系变异易选择。 Schaeffer，水稻，高蛋白质或赖氨酸含量。 花培表型变异遗传标记遗传操作。 烟草、水稻、大麦以及珍珠粟等。,2019/4/17,102,三、花药培养育种,基本程序： 小孢子愈伤组织再生株染色体加倍纯系杂交种。 （秋水仙碱诱导染色体加倍） 目前应用最广、效果最好的单倍体技术。,2019/4/17,103,技术特点,快速：一个有性世代可得到花培纯系， 1代=5-6代，缩短2-4年。 诱导率低，基因型障碍大。山东农大 花粉植株诱导率3-5%，山东农大：20-30%。 推广品种：山农3号,2019/4/17,104,1、选材,花药供体：典型健壮单株。 生育时期：雄穗顶端距叶片喇叭口约3-5cm。,2019/4/17,105,2、镜检单核中后期,2019/4/17,106,3、预处理,所选雄穗7低温预处理7-14天。,2019/4/17,107,4、花药接种与诱导培养,2019/4/17,108,小孢子形成多细胞体,2019/4/17,109,荧光下多细胞体,2019/4/17,110,5、分化培养多细胞体形成愈伤组织,2019/4/17,111,花药愈伤组织,2019/4/17,112,6、绿苗分化单倍体苗,2019/4/17,113,7、壮苗移栽,2019/4/17,114,8、染色体加倍,加倍方法常用秋水仙素溶液处理。 幼苗期：0.1-0.5%秋水仙溶液滴心叶 加倍率约50% 愈伤组织阶段： 100-200ppm秋水仙素溶液浸泡6-12小时； 50ppm秋水仙素的分化培养基上培养2-3天。 加倍率60-80%。,2019/4/17,115,双倍体植株,2019/4/17,116,9、花培纯系的获得,2019/4/17,117,10、杂交种选育,2019/4/17,118,杂交种比较,2019/4/17,119,品种育成-山农3号,2019/4/17,120,第五节 细胞杂交技术,一、细胞杂交的概念 细胞杂交技术又称细胞融合，是指将不同来源的原生质体相融合并使之分化再生，形成新物种或新品种的技术。 细胞杂交：自然发生或人工诱导。 自然发生：精卵有性结合。 人工诱导：人工利用诱导剂使原生质体融合。,2019/4/17,121,二、植物细胞杂交,甲原生质体 + 乙原生质体（人工分离） 融合细胞 离体培养、诱导分化 完整植株 植物细胞杂交/体细胞杂交,2019/4/17,122,相关名词,准性杂交： 由体细胞原生质体融合实现的细胞杂交。 超性杂种： 体细胞杂交生成的杂交细胞。 异核体： 基因型不同的细胞融合后，细胞质中存有两个或两个以上细胞核的细胞。,2019/4/17,123,（一）植物细胞杂交基本程序,1、原生质体制备 2、原生质体融合 3、融合细胞的选择培养 4、植株再生 5、杂种植株的鉴定,2019/4/17,124,1、原生质体制备,制备原则：除细胞壁，保持原生质体活性。 制备方法： 1）机械法 细胞高渗糖/盐溶液质壁分离切壁原生质体。 2）酶解法（常用） 细胞酶制剂解壁原生质体。,2019/4/17,125,2、原生质体融合,融合类型： 1）自发融合：在酶法制备同源原生质体时相邻细胞间发生的融合。 特点：自发、同源、相邻 2）诱导融合：将原生质体分离出来后，再加入诱导剂或用其他方法促使两亲本原生质体融合。 特点：人工、诱导、目的,2019/4/17,126,原生质体诱导融合,1）化学处理：化学融合剂+ （pH、Ca2+） 常用融合剂：聚乙二醇（PEG法）、聚乙烯醇（PVA法）、聚糖类、磷脂等。 特点：无需特殊装置，可处理大量的细胞；但诱导剂对细胞有毒害作用。 2）物理处理：电激法，电场刺激。 特点：对细胞没有毒性；但需要特殊的装置。,2019/4/17,127,3、融合细胞的选择培养,融合处理产物 未融合的原生质体：发育快，非所需。 同源融合的原生质体：发育快，非所需。 异源融合细胞：不易发育，所需。 设计选择体系优先选择异源融合细胞 淘汰其他形式的细胞。,2019/4/17,128,1）色彩识别法,利用两种细胞色彩上的差异识别。 绿色原生质体 + 淡黄色原生质体 异源融合细胞 （黄绿色）,2019/4/17,129,2）机械方法分离,不同荧光素 标记原生质体 诱导融合 异源融合细胞 （双荧光标记） 电子荧光激活选择器自动分类和选择。,2019/4/17,130,3）生长特性差异选择,对培养基成分要求不同： 粉蓝烟草与郎氏烟草需外源激素； 杂种细胞自生内源激素 无激素培养基选择杂交细胞。 愈伤组织生长速度差异： 曼陀罗与烟草细胞杂交：杂种快于亲本。,2019/4/17,131,4）抗性互补选择,例如： A抗青霉素而不抗链霉素 B抗链霉素而不抗青霉素 杂种细胞则双抗。,2019/4/17,132,5）营养缺陷型互补选择,一个亲本：生长需添加A物质 另一亲本：生长需B物质 杂种细胞：A、B皆不需,2019/4/17,133,4、植株再生,细胞培养与植株的再生同一般的组培。,2019/4/17,134,5、杂种植株的鉴定,利用杂种与亲本在遗传方面的异同， 证明杂种细胞中存在着双亲的遗传物质， 鉴定杂种植株的真实性。 常用方法如下：,2019/4/17,135,1）形态学鉴定,初步的鉴定： 观察杂种与亲本形态特征上的区别。 特点：简单易行； 准确度差。 原因：组培再生株变异广泛存在。,2019/4/17,136,2）细胞学鉴定,利用指标：染色体数目和核型 操作：细胞制片，染色体分析 特点：比较直接准确。,2019/4/17,137,3）同工酶谱分析,体细胞杂种可能具有双亲所有的同工酶谱带，也可能还有其独特的杂种谱带。 常用同工酶：酯酶、过氧化物酶、淀粉酶、磷酸酯酶、天冬氨酸转氨酶以及丙氨酸氨态酶等。 特点：准确可靠；但要同一发育阶段的植物组织。 原因：同工酶的表现常因所用的植物组织和植物生长阶段而异。,2019/4/17,138,4）DNA指纹图谱鉴定,每种物种都有自己典型的限制性内切酶的酶切片段长度多态性的指纹图谱。 用某种特异的重复DNA作探针，与DNA酶切片段杂交后，就可以根据其特异的图谱鉴定出杂种。,2019/4/17,139,（二）植物细胞杂交应用价值,1975，美国，哈尔森，烟草，细胞杂交序幕。 1978，德国，马铃薯（potato）+番茄（tomato） “泡马豆”（pomato）。 甘蓝+白菜甘蓝型油菜：重现自然界进化过程。 春油菜：具油菜叶绿体和萝卜胞质不育特性。 中国：80个体细胞杂种植物，茄科、十字花科,2019/4/17,140,细胞杂交技术的优势,1、克服植物有性杂交不亲和性。 实现基因转移，创造新品种、新物种。 2、种内融合解决遗传不相容性问题。 如：旱稻与高产水稻融合，培育高产旱稻，利于解决水资源问题。 3、创造细胞质杂种。 通过细胞融合获得细胞核、叶绿体、线粒体基因组的不同组合，利用胞质性状。,2019/4/17,141,三、动物细胞杂交,动物细胞没有细胞壁，融合比较简单。 融合诱导剂：灭活的仙台病毒或聚乙二醇。 （一）杂交瘤技术 （二）核移植技术,2019/4/17,142,单克隆抗体,1975年，剑桥，米尔斯坦因和科勒。 肿瘤细胞 + 淋巴细胞 融合 杂交瘤细胞 特异性抗体 “单克隆抗体”。 应用于免疫学、肿瘤学、生物化学、遗传学、细胞生物学以及药理学等领域。,2019/4/17,143,单克隆抗体的应用,（1）临床诊断方面 单克隆抗体具有高度的灵敏性与特异性，早期快速、准确地确定病因。 （2）临床治疗方面 利用专一性特点，单克隆抗体“导弹”，专杀恶性肿瘤细胞。 （3）生物大分子纯化 利用特异性免疫吸附特性，纯化生物大分子。 （4）生物学研究中的应用 利用抗体能识别蛋白质特异氨基酸顺序的特点，研究蛋白质的结构与功能。,2019/4/17,144,（二）核移植技术,指将一种细胞的细胞核，移植到另一种事先已除去了细胞核的细胞中去，重组成一个核质杂种细胞。 这是一种核质（细胞核和细胞质）水平的细胞工程。,2019/4/17,145,经典试验,青蛙核移植卵（英国牛津，格尔登） 甲青蛙 乙青蛙 卵细胞 肠细胞 卵细胞（紫外破核） 细胞核 杂交细胞 小蝌蚪（乙青蛙）,2019/4/17,146,1、意义,1）研究核质关系的重要手段。 2）珍稀动物的培育与繁殖。 3）动物不孕症的治疗。 4）器官人工培育移植。 5）创造优良新物种、新种质。,2019/4/17,147,2、基本程序,1）细胞去核 机械法、紫外线照射、激光照射法 2）细胞核的获得 低渗处理法 3）核移植 显微操作法 4）杂种细胞培养,2019/4/17,148,四、微生物的细胞杂交,微生物原生质体融合技术 新菌种 食用菌、抗生素、链霉素，酵母,2019/4/17,149,第六节 动物胚胎工程,胚胎工程主要是对哺乳动物的排卵、受精、胚胎早期发育等进行某种人为的工程技术操作，然后让它继续发育，获得人们所需要的成体动物。 这是动物细胞工程的拓展与延伸。 动物繁殖打破时间和空间限制，利于优良动物繁育和推广。,2019/4/17,150,一、胚胎冷冻技术,胚胎，-196冷冻贮存 运输、移植 技术优势： 利于种质保存； 减少饲养费用； 避免续代变异； 避免意外事故破坏。 成果： 十多种动物胚胎冷冻程序化（鼠、兔、牛、羊等），移植成功率70%80%。 新课题： 特定动物移植成功率低。猪,2019/4/17,151,二、胚胎移植技术,指将优良供体母畜的早期胚胎移到受体母畜的子宫内繁殖后代的技术。“借腹怀胎” 胚胎来源：冷冻的胚胎；鲜活的胚胎。 应用价值：提高良种的繁殖率。 应用成果：奶牛和肉牛，成功率70%。,2019/4/17,152,三、胚胎分割技术,胚胎分割：将一个胚胎分割为2个或多个，制造同卵多仔，从而能够成倍甚至成数倍地提高优良胚胎移植后得到的成体数。 鼠、兔、牛、羊、猪,2019/4/17,153,四、胚胎体外生产技术,意义： 第一，提供大量胚胎进行商业化移植。 第二，为克隆胚胎提供核受体。 第三，胚胎体外早期培养降低成本。 第四，为某些研究提供大量知道准确发育时期的胚胎。 工艺过程： 卵母细胞体外成熟，体外受精和胚胎培养。,2019/4/17,154,1、卵母细胞体外成熟,牛：受精囊胚发育率20%30%。 发展方向： 体外培养胎儿卵巢，产生卵母细胞。,2019/4/17,155,2、体外受精,“试管仔畜”牛、羊、猪、兔、鼠约1000只。 “试管婴儿”8000多例 牛、绵羊、猪和山羊的体外受精率都高达70%80%。,2019/4/17,156,五、胚胎性别鉴定技术,移植前对胚胎进行性别鉴定，按需控制仔畜性别。 对于产乳业意义重大。 技术要求：准确、快速，对胚胎无损害。技术类型：电泳法、离心分离法、抗体法、DNA探针法以及PCR扩增法。,2019/4/17,157,六、基因导入技术,将外源基因注入性细胞或胚胎，以改进家畜基因组型，培育具有新性状的仔畜。 1982，美国， “超级小鼠”。 应用前景： “超级家畜” “微型动物” “产药动物”,2019/4/17,158,第七节 动物克隆技术,1997年2月23日，英国，Ian Wilmut： 体细胞克隆羊“多莉”（Dolly）诞生。,2019/4/17,159,一、克隆的含义,英文clone指无性繁殖系。 希腊klon用来繁殖的小枝条。 克隆指从同一个个体经过无性繁殖而来的具有与母体完全相同的遗传基因的后代以及由这些后代所组成的群体。 克隆的本质特征：生物个体在遗传组成上的完全一致性。,2019/4/17,160,动植物克隆的含义,植物克隆：指从体细胞直接再生出的新个体。 实质为完全的无性繁殖，完全不需要生殖细胞参与作用。植物具有细胞的全能性。 动物克隆：指不经过生殖细胞而获得的后代个体。 实质是指不经过受精过程，人工将体细胞核移植到取出了细胞核的卵子里，然后由体细胞核主导卵子发育而形成新个体。 需要卵子的参与。,2019/4/17,161,二、动物克隆的基本程序,1、供体细胞的准备 2、受体去核卵的准备 3、细胞核移植 4、胚胎培养,2019/4/17,162,1、供体细胞的准备,6岁芬兰白色母羊 乳腺 乳腺细胞 10%血清3-6代0.5%血清 细胞脱分化 供体细胞核,2019/4/17,163,2、受体去核卵的准备,苏格兰黑面母羊 卵细胞 去除其细胞核 去核卵,2019/4/17,164,3、核移植,白羊乳腺细胞核 + 黑羊