《固定化酶和细胞》PPT课件.ppt

Chapter 5 Immobilized enzyme and cell,固定化酶和细胞,酶应用过程中的一些不足,酶的稳定性较差：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产。 产物的分离纯化较困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。,固定化技术,Contents of chapter 5-1 酶与细胞的固定化,1、什么是固定化技术和固定化酶,2、固定化酶的研究历史,3、酶的固定化技术,4、固定化酶的特点,Go,Go,Go,Go,5、细胞、原生质体的固定化,固定化生物技术 通过化学或物理的手段将酶或游离细胞定位于限定的空间区域内，使其保持活性并可反复利用。,1.酶是蛋白质，稳定性差（热、酸碱、有机溶剂对其有影响）。 2.不能回收，也使产物中混杂酶蛋白。 3.分离纯化困难。,游离酶的缺点：,固定化酶和固定化细胞的定义及特点 固定化酶(immobilized enzyme) 被局限在某一特定区域上的、并且保留了它们的催化活力，可以反复、连续使用的酶。,5.1 酶与细胞的固定化,什么是固定化酶？,水溶性酶,水不溶性载体,水不溶性酶 （固定化酶）,固定化技术,优点： (1)可提高稳定性。 (2)能回收，易与产物分离，可反复使用。 缺点： (1)存在扩散限制。适于催化小分子物质。 (2)酶活性下降。,2. 固定化细胞（immobilized cell） 固定在载体上并在一定空间范围内进行生命活动（生长、繁殖、新陈代谢）的细胞。,优越性： (1)降低成本，省去酶的分离纯化工作; (2)既可作为单一酶，也可作为复合酶系 完成部分代谢过程。 局限性： (1)细胞内多种酶的存在，会形成不需要的副 产物。 (2)细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制 作用。,3.固定化原生质体 意义： (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障碍，有利于氧的传递，营养成分的吸收和胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定，容易破裂，固定化后，由于载体的保护作用，稳定性提高。,制备固定化酶的依据 1.固定化酶必须能保持酶原有的专一性、高效催化能力和常温、常压下能起催化反应等特点。 2.固定化酶应能回收、贮藏，利于反复使用。 3.固定化酶应用于机械化和自动化操作，所用载体常有一定的机械强度。 4.固定化酶应能保持甚至超过原有酶液的活性。即要保护活性中心基团。 5.固定化酶应能最大程度与底物接近，从而提高产量。具有最小的空间位阻。 6.固定化酶应有最大的稳定性。 7.固定化酶应易与产物分离。,固定化酶的研究从50年代开始，1953年德国的 Grubhofer和Schleith采用聚氨基苯乙烯树脂为载体与羧肽酶、淀粉酶、胃蛋白酶、核糖核酸酶等结合，制成固定化酶。 60年代后期，固定化技术迅速发展起来。1969年，日本的千烟一郎首次在工业上生产应用固定化氨基酰化酶从DL-氨基酸连续生产L-氨基酸，实现了酶应用史上的一大变革。 在1971年召开的第一次国际酶工程学术会议上，确定固定化酶的统一英文名称为Immobilized enzyme。,5.2 固定化酶的研究历史,随着固定化技术的发展，出现固定化菌体 。1973年，日本首次在工业上应用固定化大肠杆菌菌体中的天门冬氨酸酶，由反丁烯二酸连续生产L-天门冬氨酸。 在固定化酶和固定化菌体的基础上，70年代后期出现了固定化细胞技术。 1976年，法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒精，1978年日本用固定化枯草杆菌生产淀粉酶，开始了用固定化细胞生产酶的先例。 1982年，日本首次研究用固定化原生质体生产谷氨酸，取得进展。固定化原生质体由于解除了细胞壁的障碍，更有利于胞内物质的分泌，这为胞内酶生产技术路线的变革提供了新的方向。,5.3 酶固定化技术,活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。 功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的活性中心时，要求不参与酶的固定化结合 酶的高级结构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。,固定化酶操作的注意事项,5.3 酶固定化技术,固定化方法,酶的固定化方法,吸附法,结合法,交联法,包埋法,网格型,微囊型,共价键结合法,离子键结合法,1、吸附法 利用各种固体吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法。 常用的固体吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、羟基磷灰石等。 操作简便，条件温和，不会引起酶变性失活，载体廉价易得，而且可反复使用。 由于靠物理吸附作用，结合力较弱，酶与载体结合不牢固而容易脱落，所以使用受到一定的限制。,优点：条件温和，操作简便，酶活力损失少。 缺点：结合力弱，易解吸附。,2、结合法 选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定化方法。,根据酶与载体结合的化学键不同，可分为： 离子键结合法：通过离子键使酶与载体结合的固定化方法称为离子键结合法。离子键结合法所使用的载体是某些不溶于水的离子交换剂。常用的有DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等。 共价键结合法：通过共价键将酶与载体结合的固定化方法称为共价键结合法。共价键结合法所采用的载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。 酶分子中可以形成共价键的基团主要有：氨基、羧基、巯基、羟基、酚基和咪唑基等。要使载体与酶形成共价键，必须首先使载体活化。,第一个离子结合法固定化酶： DEAE-Cellulose 固定化过氧化氢酶 第一个工业化的固定化酶： DEAE-Sephadex A-50 固定化氨基酰化酶,借助共价键将酶的活性非必需侧链基团和载体的功能基团进行偶联。,共价结合法（covalent binding or covalent coupling）,1）载体：亲水载体优于疏水载体 如:天然高分子衍生物: 纤维素 葡聚糖凝胶 亲和性好，机械性能差 琼脂糖 合成聚合物： 聚丙烯酰胺 聚苯乙烯 机械性能好，但有疏水结构 尼龙,使载体活化的方法很多，主要的有：重氮化法、叠氮法、溴化氰法、烷基化法等。,优点：酶与载体结合牢固，不会轻易脱落，可连续使用。 缺点：反应条件较激烈，易影响酶的空间构象而影响酶的催化活性。,3、交联法 借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，制成网状结构的固定化酶的方法。,戊二醛有两个醛基，这两个醛基都可与酶或蛋白质的游离氨基反应，形成席夫（Schiff）碱，而使酶或菌体蛋白交联，制成固定化酶或固定化菌体。 交联反应既能发生在分子间，也可发生在分子内。 酶浓度低时，交联发生在分子内，酶仍保持溶解状态。 酶浓度高时，交联发生在分子间，酶变为不溶态。 交联法制备的固定化酶或固定化菌体结合牢固，可以长时间使用。但由于交联反应条件较激烈，酶分子的多个基团被交联，致使酶活力损失较大，而且制备成的固定化酶或固定化菌体的颗粒较小，给使用带来不便。为此，可将交联法与吸附法或包埋法联合使用，以取长补短。,常用的双功能试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐、双偶氮苯等。其中应用最广泛的是戊二醛。,酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（b）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶,本章 目录,缺点： (1)反应条件激烈，酶分子的多个基团被交联，酶活力损失大。 (2)制备的固定化酶颗粒较小，给使用带来不便。,4. 包埋法（entrapment）,将酶用物理的方法包埋在各种载体（高聚物）内。分为： 网格型：将酶包埋在高分子凝胶细微网格中。 微囊型：将酶包埋在高分子半透膜中。,1）网格型包埋法 （gel (lattic) entrapment） 又称凝胶包埋法,使用的多孔载体及其特点,海藻酸钙凝胶包埋法： 滴至 海藻酸钠溶液E (or cell) CaCl2 溶液中 IE(or IC) 角叉菜胶包埋法： 滴至 角叉菜胶E (or cell) KCl 溶液中 IE (or IC) 聚丙烯酰胺凝胶包埋法： AP Acr+ Bis+E (or cell) IE (or IC) TEMED,2）微囊型包埋法 （microencapsulation） 又称半透膜包埋法 将一定量酶液包在半透性的高分子微孔膜内 。半透膜：直径几十微米到几百微米，厚约25nm。 半透膜孔径酶分子孔径，小于半透膜孔径的小分子底物和产物可以自由进出，被称为“人工细胞”。,与网格型包埋法相比，微囊型包埋法的优点： 1）固定化酶颗粒小，有利于底物和产物扩散。 2）半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入，注入体内既可避免引起免疫过敏反应，也可使酶免遭蛋白水解酶的降解，具有较大的医学价值。 缺点：反应条件要求高,制备成本也较高。,包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法，与其它固定化方法相比： 优点：不与酶蛋白氨基酸残基反应，很少改变酶的高级结构，酶活回收率高。 缺点：只适合作用于小分子底物和产物的酶。,各种固定化方法的优缺点比较,（二）细胞的固定化方法 1.固定化细胞的分类,1) 直接固定法 不使用载体，借助物理（如加热、冰冻）、化学方法（如柠檬酸、各种絮凝剂）将细胞直接固定。 一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。 2)吸附法 3)包埋法,2. 固定化方法,例如：葡萄糖异构酶(白色链霉菌)，是一种胞内酶。在50-80加热10分钟，使菌体自溶作用的酶失活，而葡萄糖异构酶仍然保持活性，长期使用酶活力不减少。,实验： 2.4%左右的卡拉胶 ，70 溶解, 再冷却到 42, +10%左右的细菌菌体(预热到42） 迅速混合均匀 4 冰箱放置大约30min 取出后切成33mm的小颗粒,一般采用网格包埋法（即凝胶包埋法）。常用凝胶：琼脂凝胶，海藻酸钙凝胶，角叉菜胶和光交联树脂。 注意：一般要加渗透压稳定剂，以防止原生质体破裂。,（三）原生质体的固定化方法,第二节 固定化酶和固定化细胞 的性质与表征 一、固定化酶的性质 影响酶催化活性的因素 1. 构象改变或立体屏蔽以及微扰 2. 分配效应和扩散限制效应,（一）酶的活性 ： 通常低于天然酶（有例外）。 （二）酶的稳定性 酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋白酶的抵抗力增加。,可能的原因： 固定化增加了酶活性构象的牢固程度， 可防止酶分子伸展变形； 抑制酶的自身降解。 固定化部分阻挡了外界不利因素对酶 的侵袭。,如：氨基酰化酶， 70，15分钟，酶失去活性。 而固定化后， 70，15分钟，有80%活性。,（三）酶的最适温度 最适温度与酶稳定性有关。 多数酶固定化后热稳定性上升，最适温度也上升（有例外）。 （四）酶的最适pH 带负电荷载体 ：最适pH 向碱性偏移。 带正电荷载体 ：最适pH 向酸性偏移。,固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电性能变化。 固定化载体与底物电荷相反,固定化酶的表观Km值降低。 固定化载体与底物电荷相同,固定化酶的表观Km值显著增加。,（五）酶的动力学特征,与自然酶基本相同。但大分子底物难于接近酶分子，导致酶的专一性发生改变。,（六）酶的作用专一性,5.4 固定化酶的特性：,将酶或含酶菌体固定化制成固定化酶或固定化菌体以后，由于受到载体等的影响，酶的特性可能会有些变化。 固定化酶的稳定性一般比游离酶的稳定性好。 固定化酶的最适作用温度一般与游离酶差不多，活化能也变化不大。 酶经过固定化后，其作用的最适pH值往往会发生一些变化。这一点在使用固定化酶时，必须引起注意。影响固定化酶最适pH值的因素主要有两个，一个是载体的带电性质，另一个是酶催化反应产物的性质。 固定化酶的底物特异性与游离酶比较可能有些不同，其变化与底物分子量的大小有一定关系。固定化酶底物特异性的改变，是由于载体的空间位阻作用引起的。,本章 目录,与固定化酶相比，固定化细胞的情况比较复杂。 （1）有活性升高的现象。 （2）稳定性的增加 。 （3）最适温度和最适pH常保持不变。,二、固定化细胞的性质,(一)酶(细胞)的活力 固定化酶通常呈颗粒状，一般用于测定自然酶活力的方法改进后才能用于测定固定化酶。 (二) 蛋白总量 1.双辛可宁酸法(BCA法) 2.考马斯亮蓝法,三、固定化酶（细胞）的评价指标,(三)偶联率及相对活力 偶联率=(加入蛋白活力一上清液蛋白活力)/加入蛋白活力100% 活力回收=固定化酶总活力/加入酶的总活力100% 相对活力=固定化酶总活力/ (加入酶的总活力-上清液中未偶联酶活力)100%,(四)半衰期 在连续测定条件下，固定化酶(细胞)的活力下降为最初活力一半所经历的连续工作时间，以t1/2表示。 是衡量稳定性的一项重要指标。,不同固定化方法的比较,乙酰 -DL Ala L Ala +乙酸 乙酰 -D Ala,第三节 固定化酶与固定化细胞的应用 一、在工业生产上的应用 1. 氨基酰化酶（Aminoacylase） 世界上第一种工业化生产的固定化酶,2.葡萄糖异构酶 世界上生产规模最大，应用最为成功的一种固定化酶。,二、固定化酶在医学上的应用 1. 消血栓： 纤溶酶是异源蛋白质，在人体内引起免疫反应，无法长期使用。 酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。 用包埋法制备的酶固定化技术可克服上述弊端，酶在囊中不能漏出，小分子物质能自由进出。,2. 人工肾： 原理：将病人血液中的尿素经脲酶水解成氨，再用活性炭吸附。即：用固定化脲酶和微胶囊活性炭组成人工肾。,酶传感器 固定化酶和电化学传感器的结合。 优点： 既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度； 酶的专一反应性，使其具有较高的选择性，能够直接在复杂试样中进行测定。,三、在分析检测中的应用,Sensitive and specific Rapid Simple,Biosensor,1967年Updike等采用酶的固定化技术，将葡萄糖氧化酶固定在疏水膜上，然后再和氧电极结合，组装成了世界上第一个生物传感器葡萄糖氧化酶电极。,葡萄糖酶电极,酶电极示意图 D葡萄糖O2 D葡萄糖酸1，5内酯H2O2,半透膜,酶胶层,感应电极,Glucose,Gluconic acid,Glucose oxidase,Oxygen,Hydrogen peroxide,Membrane,Electrode,根据反应中消耗的O2、生成的葡萄糖酸和H2O2的量，可以用氧电极、pH电极和H2O2电极来测定葡萄糖的含量。,继酶传感器（enzyme sensor）后，又出现： 细胞器传感器（cell organelle sensor） 组织传感器（tissue sensor） 微生物传感器（microbe sensor） 免疫传感器（immunosensor）,1）酶传感器的原理,生物传感器 由生物识别单元（如酶、微生物、抗体等）和物理转换器相结合所构成的分析仪器。,生物识别元件 (Biological recognition element),是酶、抗原(体)、细胞器、组织切片和微生物细胞等生物分子经固定化后形成的一种膜结构，对被测定的物质有选择性的分子识别能力。,换能器(Transducer),将识别元件上进行的生化反应中消耗或生成的化学物质，或产生的光或热等转换为电信号，并呈现一定的比例关系。,酶传感器工作原理示意图,酶传感器主要由固定化酶膜和变换器组成： 固定化酶膜：选择性地“识别”并催化被检测物质发生化学反应； 变换器：把催化反应中底物或产物的变量转换成电信号，通过仪表显示出来。,2）酶传感器的应用,水质监测 用化学法测定酚时，硫化物、油类等可干扰其测定。 从马铃薯中提纯、