遗传病的诊断医学

遗传病的诊断,教学要求,1遗传病的临床诊断：病史采集；症状和体征；系谱分析。 2细胞遗传学检查：染色体检查，FISH技术；性染色质检查。 3生化检查：代谢产物分析、酶和蛋白质分析。 4基因诊断：基因诊断的定义和特点；基因诊断的方法：限制性片段长度多态性分析、Southern印迹杂交、聚合酶链反应分析（已知点突变的检测、未知点突变的检测、基因缺失的检测、RCR-RFLP）、DNA测序、DNA芯片、荧光原位杂交等的原理、操作和应用。,产前诊断 (prenatal diagnosis) 植入前诊断 (preimplantation diagnosis) 症状前诊断 (presymptomatic diagnosis) 现症病人诊断 (symptomatic diagnosis),临床诊断,实验诊断,病史采集,症状和体征,遗传病系谱分析,细胞遗传学检查,生化检查,基因诊断,第一节 遗传病的临床诊断,病史采集,一、病史采集,家族史：有无同种病史； 婚姻史：婚龄、婚次、配偶健康情况及是否近亲结婚； 生育史：生育年龄、生育子女数目及健康状况，有无流产、死产和早产史 。,除应了解一般病史外，还应着重采集与遗传病家族聚集现象有关的以下项目：,二、症状和体征,遗传病有和其它疾病相同的症状和体征，往往又有其本身特异性症侯群，为诊断提供初步线索。,如：,智力发育不全伴有特殊腐臭尿液,苯丙酮尿症,智力发育不全伴有白内障，肝硬化,半乳糖血症,智力低下伴有眼距宽、眼裂小、外眼角上斜,先天愚型,二、症状和体征,白化病,并 指,多 指,软骨发育不全,二、症状和体征,除了解现在的症状和体征外，还应注意了解身体发育快慢、智力增进情况、性器官及第二性征发育状态等。皮肤纹理特征的检查也可作为遗传病的辅助诊断指标。,三、系谱分析,记录遗传病家族史最好的方法是绘制系谱。,系统性、完整性和可靠性 不规则显性、延迟显性、从性显性等特殊现象 新的基因突变 显性与隐性概念的相对性,注意问题,同一遗传病采用的观察指标不同而得出不同的遗传方式，如镰状细胞贫血和镰状细胞症状。,四、遗传数据库资源应用,OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man ),四、遗传数据库资源应用,OMIM(Online Mendelian Inheritance in Man ),第二节 细胞遗传学检查,染色体检查,取材：视检查对象和目的而有所不同，通常主要取自外周血、皮肤、骨髓、胸、腹水、绒毛、羊水中胎儿脱落细胞和脐血等各种组织。 体外细胞培养 制片：秋水仙素处理，收获细胞、低渗、固定、滴片等过程，制备染色体标本。 显带 核型分析,一、染色体检查, 不明原因的智力发育不全、生长迟缓者； 先天性畸形（包括两性内外生殖畸形）； 性征发育异常及生育异常： 原发性闭经和女性不孕症； 无精子症和男性不育症； 有反复多次早期流产史的妇女及其丈夫； 家族史：家族中有染色体异常或先天畸形的个体。 有较长时间、较大剂量射线或致畸致突变物质接触者； 恶性肿瘤，尤其是恶性血液病患者。,染色体检查（核型分析）指征,二、性染色质检查,X染色质和Y染色质 适应症：两性畸形或性染色体数目异常疾病的诊断，但仍需染色体检查确认。,第三节 生物化学检查,1、代谢产物分析 2、酶和蛋白质分析 材料主要来源于血液和特定的组织、细胞，如肝细胞、皮肤成纤维细胞、肾、肠粘膜细胞等。 产前诊断中常采集绒毛、羊水、脐带血和皮肤。 新生儿的筛查最常用的标本是血和尿。,例：,1978年，美国科学院院士美籍华裔科学家YW Kan(简悦威 )和Dozy应用液相DNA分子杂交成功地进行了镰状细胞贫血症的基因诊断，标志着检验诊断进入基因诊断时代。,第四节 基因诊断(gene diagnosis),第四节 基因诊断(gene diagnosis),基因诊断：利用分子生物学技术，从DNA/RNA水平检测分析致病基因的存在、变异和表达状态从而对疾病作出诊断的技术。,一、基因诊断定义和特点,A、特异性强,B、灵敏度高,特点,C、应用范围广,D、早期诊断,基因诊断概述,人类基因组计划 基因结构 后基因组计划 基因功能,基因诊断的两个支点：,基因诊断的一般流程,前提条件：先证者要有明确的临床诊断,医学遗传咨询门诊,相关临床科室 医生诊断,签署基因诊断知情同意书,抽取外周血2-3ml,基因检测,咨询临床医生,对基因检测结果的理解,找到功能性突变：支持临床诊断 未找到功能性突变：不否定临床诊断,遗传病基因诊断的分类,临症诊断家系先证者或患者 症状前诊断家系高危个体 产前诊断家系高危胎儿,二、基因诊断基本方法,1Southern印迹杂交,2聚合酶链反应分析,3DNA 测序,5荧光原位杂交,4. DNA 芯片,分子印迹杂交(Southern blotting)的基本方法：DNA标本用限制性内切酶消化琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段DNA转印至硝酸纤维素滤膜标记探针杂交显影确定探针互补的每条DNA带的位置，以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。,1Southern印迹杂交,2聚合酶链反应分析,PCR原理示意图,变性退火延伸,聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）：体外酶促扩增特定DNA片段的技术。由高温变性、低温退火及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增。,（1）产物探针检测 ASO探针,等位特异性的寡核苷酸(allele-specific oligonucleotide，ASO)探针: 当某一致病基因的突变位点的性质以及突变位点两侧的碱基序列都明确的情形下，可以合成ASO探针。,ASO探针检测镰状细胞突变基因的示意图,/ /S S/S,已知点突变,（2）产物构象变化检测-SSCP,DNA单链构象多态性(single strand conformation polymorphisms,SSCP)：相同长度的单链DNA可因碱基序列不同产生构象差异，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现为迁移率差别。 提取DNAPCR扩增产物变性电泳 根据单链条带位置的改变判断该个体是否存在突变。 并不是所有的碱基突变都会导致SSCP，因此该方法不能鉴别所有突变。,SSCP电泳检测示意图,未知点突变,基因缺失时可导致靶DNA模板的缺失，使用特异性引物扩增时得不到相应的扩增产物，因此可以直接检测缺失。,（3）PCR产物有无检测,正常基因,异常基因,目的基因,引物,PCR,产物 （电泳）,基因缺失或点突变,RFLP连锁分析法 （restriction fragment length polymorphism，RFLP） 由于碱基变异可能导致限制酶切点消失或新的酶切位点出现，引起不同个体DNA在用同一限制酶切割时，产生不同长度的DNA片段，称 RFLP。,（4）产物酶切检测-RFLP,基因缺失或点突变,RFLP的主要步骤: DNA酶切Southern印记杂交分析 DNAPCR 酶切电泳分析,RFLP主要有以下两种类型： 点多态性 序列多态性,正常人（HbA）和镰状细胞贫血患者 （HbS）珠蛋白基因的结构差异,正常人（HbA）和镰状细胞细胞 贫血患者（HbS）珠蛋白基因 Dde限制酶切点示意图,珠蛋白基因Dde限制酶切片段电泳结果,例1:镰状细胞贫血,人类珠蛋白基因簇,例2,a地中海贫血缺失基因检测,PCR-RFLP检测基因缺失和插入的示意图,案例9-2基因诊断分析(P99),地贫的基因缺失的RFLP基因诊断,2,正常对照,aa/aa,1,1,aa/a-,aa/-,a-/-,人类珠蛋白基因簇,例2,a地中海贫血缺失基因检测,3DNA 测序,DNA测序即测定DNA的一级结构中碱基的顺序。 包含特定位点的PCR产物再作DNA测序，比较正常基因与突变的序列，可检测出突变的碱基类型和位点。,DNA自动测序仪生成的序列,DNA自动测序仪采用4种不同颜色的荧光分别标记4种双脱氧核苷酸，基本实现了测序自动化。,概念：基因芯片技术是DNA杂交探针与半导体工业技术相结合的产物。将各种探针固定于支持物上后与带有荧光标记的DNA样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号，进而获取被测样品中DNA分子的数量和序列信息。该技术可用于大规模筛查由基因突变引起的疾病。,4. DNA 芯片,检测原理和步骤： （1）制作芯片：根据疾病基因中的突变位点区域的核苷酸序列，合成20个核苷酸长的探针，将其固定于芯片上，芯片上可固定成千上万个探针。 （2）从被测对象的细胞中提取DNA，用酶切成较小的片段，对DNA作荧光标记，并熔解成单链。 （3）将样品滴加到芯片上并与芯片上的探针杂交，凡是与探针互补的酶切片段会固定于特定位置上，不能互补的片段会被洗脱掉。 （4）对芯片上的荧光作扫描和分析。,Gene screening using a DNA microarray.,非放射性原位杂交方法 用特殊荧光素标记DNA探针，在染色体、细胞和组织切片标本上进行DNA杂交，检测细胞内DNA或RNA的特定序列存在与否。,6荧光原位杂交（FISH）,案例19-1,罗xx ，女，34岁，曾生育过一个智力低下患儿，现再次妊娠，因惧怕再生同病患儿前来咨询。其患儿，男，6岁，智力低下，IQ值42。染色体核型分析为46，XY，-14，+t(14q;21q)。检查患儿父亲的核型正常；而母亲是平衡易位携带者，核型为45，XX,-14,-21,+t(14q;21q)。 脐血FISH分析结果如图。,21q探针对脐血间期细胞FISH分析结果,遗传疾病的基因诊断方法,教