课件：真菌学检验.ppt

真菌学检验,1,2019,-,1,2019,-,2,2019,-,3,病原真菌学概论,4,2019,-,4,真菌门 接合菌亚门 毛霉、根霉 子囊菌亚门 酵母 担子菌亚门 鹅膏菌 半知菌亚门 表皮癣菌、隐球菌,一、真菌的分类,5,2019,-,5,二、真菌与人类的关系,在自然界中分布广泛，约二十余万种，对人致病的约150种。,6,2019,-,6,对人致病性的真菌分为：,病原性真菌 条件致病性真菌 产毒真菌 致癌真菌,7,2019,-,7,真菌是医院感染常见微生物,院内感染的7.5%-15% 血液感染的第四位 肿瘤病人发病率为8% 严重创伤、烧伤病人高达16% 病死率达55%-70%,条件致病菌感染呈上升趋势，为继发性感染 （呼吸道、皮肤、消化道粘膜损伤）,8,2019,-,8,真菌（fungus）属真菌界,真核细胞型微生物。 典型的细胞结构 无根、茎、叶，不含叶绿素。 腐生或寄生方式摄取营养。 细胞壁含几丁质（chitin）、 纤维素。 有性和（或）无性繁殖。,三、真菌的基本特性,9,2019,-,9,真菌的形态特性,真菌,单细胞：酵母型（yeast）、类酵母型（yeast-like ） 圆、卵圆，出芽方式繁殖 新生隐球菌，白假丝酵母菌,多细胞：霉菌型( mold ) 菌丝(hypha)、孢子(spore), 交织成团，称丝状菌 癣菌、霉菌,10,2019,-,10,出芽生长,11,单细胞真菌呈圆形，以出芽方式繁殖，芽生孢子成熟后脱落成独立个体,2019,-,11,二相性真菌（dimorphic fungus）： 某些真菌，可因环境条件改变，由一种形态转变成另一种形态，在体内或含动物蛋白的培养基上37培养时呈酵母型，在普通培养基上25-28培养时呈霉菌型，如球孢子菌、组织胞浆菌及芽生菌。,12,2019,-,12,13,2019,-,13,菌丝按结构可分为：有隔菌丝与无隔菌丝,（1）有隔菌丝： 大部分真菌的菌丝在一定间距见有横隔，称隔膜。将菌丝分成一连串的细胞。,2019,-,14,菌丝中无横隔将其分段，整条菌丝就是一个细胞。在一个细胞内含有许多核，是一种多核单细胞。,（2）无隔菌丝：,2019,-,15,16,2019,-,16,孢子(spore)： 孢子是真菌的繁殖器官，一条菌丝上可长出多个孢子。在环境条件适宜时，孢子又可发芽生出芽管，发育成菌丝体。,2019,-,17,孢子分有性孢子和无性孢子两大类： 有性孢子由同一菌体或不同菌体上的两个细胞融合而成。 无性孢子由菌丝上的细胞分化生成，并不发生细胞融合，包括：分生孢子、叶状孢子和孢子囊孢子。,2019,-,18,19,2019,-,19,（1）分生孢子（condium） 由生殖菌丝末端细胞分裂或收缩形成，也可在菌丝侧面出芽形成，有两种：,大分生孢子（macrocondium）： 多细胞组成，梭状、棍棒状；,小分生孢子（microcondium）： 单细胞组成。,2019,-,20,（2）叶状孢子（thallospore）： 芽生孢子出芽形成； 厚膜孢子胞浆浓缩，胞壁增厚而成； 关节孢子菌丝胞壁增厚，形成链状排列的长方形节段。,芽生孢子,关节孢子,厚膜孢子,2019,-,21,（3）孢子囊孢子（sporangiospore）： 菌丝末端膨大成囊状，内含许多孢子。,2019,-,22,23,2019,-,23,真菌菌落特性,酵母型菌落：单细胞真菌的菌落，较大，光滑、湿润、柔软、边缘整齐。 霉菌型菌落：多细胞真菌的菌落，棉絮状，绒毛状，粉末状、产生色素。如皮肤癣菌。,24,2019,-,24,25,2019,-,25,真菌感染的实验诊断,26,2019,-,26,1. 临床标本的采集,临床标本的类别 皮肤的角质性物质； 各种分泌物和排泄物； 血液和体液； 脓汁及渗出物。,27,2019,-,27,采集标本注意事项,1、采集的标本要适宜：不同真菌感染应采取不同的临床标本。 2、用药前采集标本： 3、采集的标本量要足：血液和脑脊液5ml，胸腔液20ml 4、严格无菌操作： 5、采集的标本立即送检：,28,2019,-,28,二、真菌学检验,直接镜检：形态学检查是重要依据 抗原的检测： 分离培养与鉴定： 核酸检测： 毒素检测：,29,2019,-,29,真菌标本直接检查,1.直接镜检：方法简便，快速,10%KOH,微加热,低倍/高倍镜检查有无菌丝/孢子,角质标本,（皮肤癣菌）,直接观察/染色后观察,30,2019,-,30,标本直接检查,31,2019,-,31,32,2019,-,32,33,2019,-,33,直接镜检评价,阳性结果意义 1.有诊断意义； 2.代表组织相、确定某些致病性真菌属或种； 3.判断某些真菌种的致病性等,34,2019,-,34,直接镜检局限性,1.阴性结果不能排除真菌感染; 2.有假阳性结果。,35,2019,-,35,采用免疫学方法检测真菌抗原，常用的方法有胶乳凝集试验、ELISA、半定量放射免疫测定法。,2.抗原检测:,36,2019,-,36,3.分 离 培 养,真菌培养是目前鉴定真菌的唯一方法; 培养成功与否与采集的标本是否适当、是否新鲜、培养基的选择、培养温度与时间等有关; 二相性真菌培养,37,2019,-,37,常用培养基及用途,38,2019,-,38,平皿培养：只能培养生长繁殖较快的真菌; 大试管培养:用于皮肤癣菌的培养和真菌菌种的保存; 玻片培养(微量、小培养):可用于真菌菌种的鉴定。,39,2019,-,39,观察菌落形态应注意：,1、菌落的性质：酵母菌还是霉菌； 2、菌落的大小：病原性真菌菌落小，条件致病 性真菌则大； 3、菌落颜色：病原性真菌色淡，污染性真菌色深； 4、致病性真菌菌落下沉，有时使培养基开裂，污染性真菌菌落不下沉，很少引起培养基开裂。,40,2019,-,40,真 菌 鉴 定,全面生化反应、分子生物学鉴定，必要时将菌种送有关单位鉴定。 检验真菌常用的生化反应有糖(醇)类发酵试验、同化碳源试验、同化氮源试验或利用硝酸钾试验、牛乳分解试验、酚氧化酶试验、明胶液化试验和脲酶试验等。 试验方法同细菌试验，主要用于检验深部感染真菌如假丝酵母菌、隐球菌等。,41,2019,-,41,分类 根据侵犯的部位不同分为： 浅部感染真菌 深部感染真菌,42,2019,-,42,浅部感染真菌,43,2019,-,43,定义：侵犯皮肤、毛发、指甲等角化组织。 分类：皮肤癣真菌(临床最多见） 表皮感染真菌 皮下组织感染真菌,44,2019,-,44,侵犯皮肤、毛发、指甲等角蛋白组织引起癣症（发癣、体癣、甲癣等），分三属，约45种,皮肤癣真菌,45,2019,-,45,2019,-,46,47,2019,-,47,毛癣菌属,48,菌落蜡状，开始为白色继续培养呈灰黄或深褐色、皱折。有大、小分生孢子、厚孢子。,2019,-,48,表皮癣菌属,49,菌落棕黄色，扁平至放射状皱折、粉状或绒状，反面黄褐色。棒状壁光滑大分生孢子，陈培养中厚孢子增多。,2019,-,49,小孢子菌属,50,生长快，菌落浅黄褐色、粉末或绒毛状，反面黄橙色；梭形厚壁大分生孢子,2019,-,50,皮肤癣真菌引起癣症的特点： 接触传染 同种皮肤癣菌可在不同部位引起病变 相同部位的病变也可由不同的皮肤癣菌引起（如灰指甲可由毛癣菌或表皮癣菌引起）,51,2019,-,51,红色毛癣菌,52,2019,-,52,53,2019,-,53,甲 癣,54,2019,-,54,微生物学检验,1、标本采集：70%乙醇消毒,55,2019,-,55,2、直接镜检： 10%KOH（皮屑）； 25%KOH或 NaOH + 5%甘油（指甲）； 透明、有隔、有分支的菌丝及成链的关节孢子 发外型感染或发内型感染,56,2019,-,56,57,2019,-,57,断发毛癣菌引起的发内型感染的头发,疣状毛癣菌感染的大孢子发外型感染的头发,犬小孢子菌引起的小孢子发外型感染的头发,58,2019,-,58,3. 分离培养与鉴定,标本处理及培养： 皮屑、甲屑和病发标本，用70%乙醇处理，接种在沙氏琼脂斜面，25培养，直至第四周。挑菌落镜检菌丝和孢子。 鉴定试验： 如毛发穿孔试验、脲酶试验等。,59,2019,-,59,被石膏样毛癣菌穿孔的毛发,60,2019,-,60,花 斑 癣,其它浅部真菌,61,糠秕马拉色菌,2019,-,61,着色真菌,62,花瓶型分生孢子,2019,-,62,孢子丝菌,63,2019,-,63,64,孢子丝菌,2019,-,64,深部感染真菌,65,2019,-,65,定义：能侵袭深部组织和内脏及全身的真菌. 主要致病菌： 假丝酵母菌 隐球菌 曲霉菌 毛霉菌 组织胞浆菌 卡氏肺孢菌,66,2019,-,66,一、假丝酵母（Candida）,俗称念珠菌，有81种，11种对人致病； 引起女性的假丝酵母菌性阴道炎、 外阴炎。男性念珠菌龟头炎、包皮炎。 体弱婴儿鹅口疮； 假丝酵母菌性肠炎、肺炎等。 AIDS最常见并发症之一。,白假丝酵母菌皮肤黏膜感染 （鹅口疮）,67,2019,-,67,微生物特性：,圆形或卵园形； 出芽方式繁殖，在组织内可见芽生孢子、假菌丝；,68,2019,-,68,假菌丝 (pseudohypha): 指酵母菌菌种进行一连串的芽殖后，长大的子细胞仍不脱落分离，并继续出芽，细胞成串排列，在分隔处缢缩, 这种菌丝状的细胞串就称为假菌丝。,2019,-,69,微生物特性：,在玉米粉培养基中可产生假菌丝和厚膜孢子。,70,厚膜孢子形成试验,2019,-,70,微生物检验,1、标本直接检查： a、直接显微镜检查：G b、抗原检测：ELISA、免疫印迹 c、核酸检测：PCR扩增其DNA后以分子探针检测。,71,2019,-,71,2、分离培养与鉴定 沙氏培养基，25或37 培养1-4d，可见奶油色菌落。镜检可见假菌丝和芽生孢子。,72,2019,-,72,2、分离培养与鉴定 芽管形成试验：细菌接种在0.2-0.5ml人或动物血清，37 1.5-4h可见芽管；设立阴性对照。,73,2019,-,73,产色培养基,74,2019,-,74,3、药物敏感试验：对二性霉素B、5-FC敏感，但对后者易耐药； 4、抗体检测：ELISA、免疫酶斑点试验测抗原或用乳胶凝集、对流免疫电泳试验测抗体； 5、动物试验：1ml菌悬液注射兔耳静脉或0.2ml菌悬液注射鼠尾静脉，观察5-7d，剖检。脏器多种小脓肿即为白假丝酵母菌感染。,75,2019,-,75,二、隐球菌,隐球菌属，17个种，7个变种。 广泛分布于自然界，也可存在于人的体表、口腔和肠道。 外源性感染，经呼吸道侵入。侵犯肺、脑、脑膜，也可侵犯皮肤，骨和关节。 在国外，是AIDS的最常见并发症之一，是AIDS死亡的首要原因。 在我国已被列为乙类传染病。 致病物质为荚膜。,76,2019,-,76,电镜下新生隐球菌的荚膜,77,2019,-,77,微生物特性,圆或卵圆形、4-6m，有荚膜，较菌体大1-3倍。,78,2019,-,78,微生物学检验,1、标本直接检查 （1）直接镜检: 墨汁负染，PAS染色 （2）抗原检测：乳胶凝集试验、ELISA、单克隆抗体法 （3）核酸检测：PCR探针、DNA探针,79,2019,-,79,（新生隐球菌的酵母被一个很宽的荚膜包围） 脑脊液的印度墨汁染色标本,80,2019,-,80,2、分离培养与鉴定 （1）分离培养：沙氏培养基25和37，2-5d观察。非致病性隐球菌在37不生长。 （2）鉴定： A、酚氧化酶试验：棕黑色菌落 B、脲酶试验：培养基由黄转粉红色 C、糖同化及发酵试验：同化葡萄糖、半乳糖、蔗糖和肌醇，但不发酵糖类、不同化硝酸盐 。非致病性隐球菌不同化肌醇。,81,2019,-,81,新生隐球菌菌落,粘液样新型隐球菌在血琼脂上生长（发亮的表面是由于酵母形成而产生大量的荚膜多糖）,82,2019,-,82,小结,1、真菌的分类、微生物学特征。 2、真菌的微生物学检查主要有：标本直接涂片镜检、分离培养和鉴定； 3、浅部感染真菌直接镜检的标本处理方法； 4、深部感染真菌： （1）白假丝酵母菌芽管形成试验，厚膜孢子形成试验； （2）隐球菌印度墨汁负染色镜检。,83,2019,-,83,思考题,1. 常见致病性真菌的有哪些种类？ 2. 常见致病性