生物技术专业大实验实验指导.doc

生物技术专业大实验 课程课程编号：0741524966实 验 指 导 书主撰人 韩军丽 王雪青 金玉莲 赵培审核人 王素英天津商业大学 生物技术与食品科学学院二零零九 年 十一月前 言1实验总体目标使学生掌握基因工程、分子生物学、细胞生物学及细胞工程实验技术，提高学生实验动手能力、以及在实验中分析问题和解决问题的能力，为今后从事生物技术相关工作和研究打下坚实的基础。 适用专业年级 生物技术专业第6学期 先修课程 生物化学、微生物学、遗传学、细胞与分子生物学、基因工程、细胞工程 实验课时分配实验项目实验要求实验类型每组人数实验学时实验一 目的基因的PCR扩增必做综合24实验二 DNA片段的回收必做综合24实验三 DNA的连接必做综合22实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备必做综合23实验五 重组DNA的转化必做综合23实验六 快速分离大肠杆菌中的重组质粒必做综合23实验七 重组质粒的酶切鉴定必做综合24实验八 外源基因诱导表达及蛋白质检测必做综合212实验九 细胞凝集反应必做综合22实验十 细胞膜的渗透性必做综合22实验十一 细胞工程基础实验技术必做综合24实验十二 无菌操作及愈伤组织诱导技术必做综合24实验十三 微藻规模化培养必做综合24 实验环境 生物技术专业实验室 实验总体要求进入实验室，必须穿实验服。保持实验台的整洁，自己的物品需放置在指定位置，贵重物品随身携带。 本实验的重点、难点及教学方法建议本专业大实验主要包括基因克隆、克隆的鉴定、细胞生物学基本实验以及细胞工程基本实验技术。目 录实验一 目的基因的PCR扩增实验二 DNA片段的回收实验三 DNA的连接实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备实验五 重组DNA的转化实验六 快速分离大肠杆菌中的重组质粒实验七 重组质粒的酶切鉴定实验八 外源基因诱导表达及蛋白质检测实验九 细胞凝集反应实验十 细胞膜的渗透性实验十一 细胞工程基础实验技术实验十二 无菌操作及愈伤组织诱导技术实验十三 微藻规模化培养实验一 目的基因的PCR扩增一、实验目的目的基因的分离技术是基因工程的三大核心技术之一。应用PCR技术分离目的基因是常用的方法之一。通过本实验的学习，要求学生掌握PCR技术的基本原理；掌握用PCR技术扩增目的基因的方法。二、实验内容设计特异引物，以含有目的基因的质粒DNA为模板，用PCR方法扩增目的基因。三、实验要求集中授课四、实验准备在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。五、实验原理、方法和手段PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。PCR反应体系包括五种成分：（1）模板DNA；（2）引物；（3）四种脱氧核糖核苷酸；（4）DNA聚合酶；（5）反应缓冲液（提供Mg2+、pH、离子强度）。PCR反应的基本步骤包括：（1）变性：高温使双链DNA解离形成单链（94）；（2）退火：低温下，引物与模板DNA互补区结合（55）；（3）延伸：DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链延伸反应（7072）。PCR反应体系的总体积一般为25l100 l 。 为了提高PCR的扩增效率，PCR反应体系中各成分的浓度按如下原则调控：（一）反应缓冲液：由纯水、KCl、Tris组成。Tris用于调节反应体系pH值，使Taq酶在偏碱性环境中反挥活性。KCl可降低退火温度，但不能超过50 mmol/L，否则会抑制DNA聚合酶活性。 Mg2+终浓度为1.52.0 mmol/L，其对应dNTP为200 mol/L，注意Mg2 与dNTPs之间的浓度关系，由于dNTP与Taq酶竟争Mg2+，当dNTP浓度达到1 mmol/L时会抑制Taq酶的活性。Mg2+能影响反应的特异性和产率。 （二）BSA：一般用乙酰化的BSA，起着减少PCR管对Taq酶的吸附作用，对Taq酶有保护作用。 （三）dNTPs：dNTPs具有较强酸性，其储存液用NaOH调pH值至7.07.5，一般存储浓度为 10 mmol/L，各成份以等当量配制，反应终浓度为20200mol/L。高浓度可加速反应，但同时增加错误掺入和实验成本；低浓度可提高精确性，而反应速度会降低。（五）Taq酶：能耐95高温而不失活，其最适pH值为8.38.5，最适温度为7580，一般用72。能催化以DNA单链为模板，以碱基互补原则为基础，按53方向逐个将dNTP分子连接到引物的3端，合成一条与模板DNA互补的新的DNA子链。无35的外切酶活性，没有校正功能。用量一般为0.55个单位/100l。（六）模板：PCR对模板DNA的纯度不要求很高，但应尽量不含有对PCR反应有抑制作用的杂质存在，如蛋白酶、核酸酶、TqaDNA聚合酶抑制剂、能与DNA结合的蛋白质。 模板DNA的量不能太高，否则扩增可能不会成功，在此情况下可适当稀释模板。 （七）引物：引物浓度一般为0.10.5 mol/L，浓度过高会引起错配和非特异扩增，浓度过低则得不到产物或产量过低。引物长度一般1530个碱基，引物过长或过短都会降低特异性。其3末端一定要与模板DNA配对，末位碱基最好选用A、C、G（因T错配也能引发链的延伸）。 引物G C约占4555%，碱基应尽量随机分布，避免嘧啶或嘌呤堆积，两引物之间不应有互补链存在，不能与非目的扩增区有同源性。为了提高PCR的扩增效率，PCR反应温度以及温度持续时间按如下原则确定：（一）变性：模板变性完全与否是PCR成功的关键，一般先于94（或95）预变性310min，然后再进入循环程序94变性3060s。 （二）退火：退火温度一般低于引物本身变性温度5。引物长度在1525bp可通过公Tm=(G C)4 (A T)2计算退火温度，一般退火温度在4060之间，时间为3045s。如果(G C)低于50%，退火温度应低于55。较高的退火温度可提高反应的特异性。（三）延伸：延伸温度应在Taq酶的最适温度范围之内，一般在7075。延伸时间要根据DNA聚合酶的延伸速度和目的扩增片段的长度确定，通常对于1kb以内的片段1min即可。 PCR的循环数主要由模板DNA的量决定，一般2030次循环数较合适，过多的循环数会增加非特异扩增产物，具体要多少循环数可通过预实验确定。六、实验条件1. 生物材料和试剂质粒DNA，引物，Taq DNA聚合酶，10Taq DNA聚合酶反应缓冲液，dNTPs，ddH2O2. 仪器设备PCR仪，台式低速离心机，微量移液器，PCR管七、实验步骤1.在PCR管中依次加入反应体系各成分，混匀，然后低速短暂离心，使液体均位于PCR管底部。（参考备注）2.在PCR仪控制面板上，设定PCR反应的程序，然后将PCR管置于仪器中进行扩增反应。（参考备注）3.反应结束后，取少许PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测扩增产物的量和特异性。备注：20 l PCR反应体系的组成：10DNA聚合酶反应缓冲液 2.0 l正义引物 2.0 l反义引物 2.0 l10dNTPs 2.0 l模板DNA 50 ngDNA聚合酶 1 UddH2O 加至总体积20 lPCR反应参数：根据引物和模板DNA的特点以及扩增片段的长度而定，一般参数为：94C 5 min；94C 50 s，56C 1 min，72C 1 min/2 min，30个循环；72C 10 min。八、思考题本实验中10Taq DNA聚合酶反应缓冲液的成分及各成分的浓度是什么？为什么这样配制？九、实验报告要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。实验报告的内容包括：（1）实验目的；（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析（画出扩增产物电泳结果示意图）；（6）思考题。要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。十、注意事项及其它说明规范使用微量移液器、台式离心机等。注意电源安全。PCR仪的使用必须在老师的指导下进行。实验二 DNA片段的回收一、实验目的DNA片段的分离与回收是基因工程操作中一项重要的技术。通过本实验的学习，要求学生掌握常用的从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的原理和方法。二、实验内容用离液序列高的盐溶解琼脂糖凝胶，结合硅质吸附柱回收琼脂糖凝胶中的DNA。三、实验要求集中授课四、实验准备在进行实验之前，要求学生认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。五、实验原理、方法和手段DNA片段的分离与回收是基因工程操作中一项重要的技术，如可收集特定酶切片段用于克隆或是制备探针、回收PCR产物用于再次鉴定等。迫于基因工程操作的需要，自70年代初期就已开始DNA片段分离与回收的研究，到70年代中期己探索出了2至3种较为有效的方法。理想的DNA片段回收方法应满足以下几个要求。首先，回收片段应有非常高的纯度，如从普通琼脂糖中分离出的片段不可带有即使是微量的凝胶因为它会抑制绝大部分的酶活力；回收过程中加入的各种物质最后也要彻底除干净，因为酶是极其敏感的生物催化剂，杂质可能导致酶的异常反应或是抑制酶的全部活力。其次，回收过程必须是严格的无DNA酶污染的操作过程，不然会发生回收片段降解的现象，有时其至当降解仅仅发生在粘性末端时也会导致连接反应的失败。再者，要求回收技术能用于不同大小的DNA片段，如回收大片段时不发生机械性损伤与断裂作用。第四，要求回收方法有较高的效率，能进行微量DNA操作。最后，要求操作方便、快速，不需要昂贵的试剂与特殊的器材。DNA片段回收方法包括电泳回收法、收集孔电泳回收法、机械破碎凝胶回收法、溶（熔）胶回收法、琼脂糖酶降解凝胶回收法等五大类方法。溶（熔）胶回收法是常用的方法之一，包括低融点胶法、碘化钠法、碘化钾密度梯度离心法和NaClO4玻璃纤维纸吸附法。碘化钠法的原理是琼脂糖能溶解于离液序列高的盐(也称促溶剂)中，常用的盐有NaI、KI与NaClO4，所以称化学法溶胶。NaI溶胶后可与玻璃粉吸附法或是丙酮(乙醇)沉淀法配合使用，前者用得更广泛些。另有文献报道，TBE制的胶不易被NaI溶解，所以最好选用TAE缓冲液进行回收电泳。六、实验条件1. 实验材料 PCR扩增产物2. 试剂 （1）50TAE电泳缓冲液： 242.0 g Tris 57.1 mL 冰醋酸 (后加) 100 mL 0.5 mol/L EDTA (pH8.0) 加水至1000 mL，0.103 MPa湿热灭菌15 min，冷却后加入冰醋酸混匀，置于4冰箱长期保存，用时稀释50倍。(2) EB溶液称取EB溶于无菌水中，母液质量浓度为10 mg/mL。配后4冰箱保存，如经常使用可于室温避光放置。使用浓度为0.5 g/mL。注意：EB是强诱变剂，配制与使用都应极为小心并要防止污染环境。(3) 琼脂糖(4) DNA分子量标记(5) 10上样缓冲液(6) DNA回收试剂盒（离心柱型）(TIANGEN)3. 器材PCR仪、电泳仪（一套）、微波炉、微量移液器、台式离心机、紫外分析仪、刀片七、实验步骤1. 将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳2. 在紫外分析仪中，用刀片将凝胶中的目的DNA片段切下4. 用DNA回收试剂盒（离心柱型）回收凝胶中的目的DNA（操作步骤见试剂盒使用说明书）5. 用电泳检测方法对回收产物的纯度和回收率进行分析八、思考题DNA片段的分离与回收在DNA重组技术中的作用是什么？九、实验报告要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。实验报告的内容包括：（1）实验目的；（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析（画出回收片段电泳结果示意图）；（6）思考题。要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。十、注意事项及其它说明规范使用实验仪器，并注意电源安全。涉及挥发性有毒试剂的操作，需在通风蹰进行。其他有毒试剂需戴手套进行操作。本实验电泳、切胶步骤需戴手套进行操作。溶胶液含有诱变剂溴化乙锭，避免接触。废液集中处理。实验三 DNA的连接一、实验目的DNA重组技术是基因工程的三大核心技术之一。DNA连接反应是重组过程的关键步骤，通过本实验的学习，要求学生掌握DNA的连接方法，了解连接反应中各因素对连接效率的影响；掌握T-A克隆的原理与方法。二、实验内容用DNA连接酶将回收的DNA片段和T载体连接形成重组DNA。三、实验要求集中授课四、实验准备在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。五、实验原理、方法和手段连接反应在DNA重组技术中是非常关键的一步，切割并纯化后的目的基因片段只有经过与带有自主复制起点的载体连接后，进行转化，才能得到真正的克隆，所以说连接酶的发现也是对基因工程发展的一个巨大贡献。早在1967年世界上就有5个实验室同时发现了大肠杆菌中有DNA连接酶；1970年美国威斯康新大学的Khoro发现，经T4噬菌体感染的大肠杆菌中有T4基因所编码的DNA连接酶；到1972年底人们已经掌握了多种连接DNA的方法，在这些工作的基础上，于1972年首次实现了DNA的体外重组。当时的实验是用T4DNA连接酶将EcoR切割的噬菌体与同样切割的猴病毒SV40连接，结果在电子显微镜的观察下，证实出现了重组DNA。DNA连接酶能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键。DNA连接酶的作用条件是：（1）需要在一条DNA链的3末端具有一个游离的羟基(OH)，和在另一条DNA链的5末端具有一个磷酸基团(P)。（2）在大肠杆菌及其它细菌中，DNA连接酶催化的连接反应，是利用NAD+（氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸）作能源的；而在动物细胞及噬菌体中，则是利用ATP（三磷酸腺苷）作能源。（3）只能封闭缺口（nick），不能封闭裂口（gap）。影响DNA连接酶连接效率的主要因素有：（1）温度 ，一般采用4至15；（2）插入片断与载体分子的摩尔比3；（3）连接反应的时间12小时以上。 TA克隆系统由Invitrogen公司发展而来的商业性试剂盒，它用于PCR产物的克隆和测序。其原理是利用Taq DNA酶能够在PCR产物的3末端加上一个非模板依赖的A，而T载体是一种带有3T突出端的载体（图1），在连接酶作用下，可以快速地把PCR产物直接插入到质粒载体的多克隆位点（MCS）中。六、实验条件1. 试剂回收的目的基因、T-A克隆试剂盒（TIANGEN）2. 器材保温瓶、台式离心机、微量移液器、温度计图1 T-载体图谱七、实验步骤1. 在微量离心管中依次加入下列试剂（1）目的DNA片段 （2）T-载体 （3）10连接反应buffer （4）T4DNA连接酶 （5）ddH2O 加至终体积10l2. 稍加离心，14-16水浴连接过夜。注意事项：1.要获得目的基因的TA克隆，PCR产物的特异性要好。2.PCR产物在TA克隆前要通过纯化。八、思考题DNA连接反应中如何确定供体DNA与载体DNA的加入量？九、实验报告要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。实验报告的内容包括：（1）实验目的；（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析；（6）思考题。要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。十、注意事项及其它说明规范使用实验仪器，并注意电源安全。实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备一、实验目的通过本实验的学习，要求学生掌握CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。二、实验内容用CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞三、实验要求集中授课四、实验准备在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。五、实验原理、方法和手段感受态，即指受体细胞容易接受外源DNA片段的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。大肠杆菌是分子生物学常用的实验材料，但是在自然条件下，大肠杆菌很难吸收外源DNA。后来的研究发现，用CaCl2处理大肠杆菌细胞，能够诱导细胞进入感受态。将正在生长的大肠杆菌在0下加入到低浓度CaCl2溶液中，便会使细胞膨胀成球形，外源DNA和钙离子作用形成抗DNase的复合物并粘附在细胞表面。42短暂热激处理，粘附在细胞表面的DNA进入到细胞内。六、实验条件1. 材料 大肠杆菌DH52. 试剂(1) 无菌100 mmol/l CaCl2(2) LB培养基胰蛋白胨 10 g酵母提取物 5 gNaCl 10 g加入蒸馏水至终体积1000 mL，调节pH值至7.0，高温高压灭菌后备用。(3) 50 mg/mL 卡那霉素(4) 20 mg/mL X-gal(5) 200 mg/mL IPTG （异丙基硫代-D-半乳糖苷）3. 器材恒温摇床、分光光度计、冷冻离心机、恒温水浴、37恒温培养箱、涂布棒、微量移液器七、实验步骤1) 将0.5 ml第一次活化的菌液加入至20 ml LB培养基中，37C振荡培养至OD6000.4；2) 取1.5 ml菌液，冰浴30分钟，4C，4000 rpm，离心10分钟收集菌体；3) 用400 l冰预冷的100 mmol/l CaCl2重悬沉淀，冰浴10分钟后，4C，4000 rpm，离心10分钟收集菌体；4) 用100 l冰预冷的100mmol/l CaCl2重悬沉淀 八、思考题大肠杆菌感受态细胞的制备的第一步，为什么要严格监控细菌的生长情况？九、实验报告要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。实验报告的内容包括：（1）实验目的；（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析；（6）思考题。要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。十、注意事项及其它说明规范使用实验仪器，并注意电源安全。实验五 重组DNA的转化一、实验目的转基因技术是基因工程的三大技术之一。通过本实验的学习，要求学生掌握大肠杆菌的转基因方法。二、实验内容将重组DNA转入大肠杆菌，通过微生物培养，得到含有重组DNA的大肠杆菌菌株。三、实验要求集中授课四、实验准备在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。五、实验原理、方法和手段转化一词最初是指一种细菌菌株由于捕获了来自另一种细菌菌株的DNA，而导致性状发生遗传性改变的生命过程。后来这个术语的范围扩大，可以指任何细胞吸收外源DNA而发生的可遗传的性状改变的过程。外源DNA进入大肠杆菌的方式有四种：转化、转导、电穿孔法、接合转移。转化是常用的一种方式，通常受体细胞要经过一定的处理进入感受态，然后进行转化。本实验对CaCl2法制备的大肠杆菌细胞进行转化。将连接产物加入到处于感受态的大肠杆菌中，42短暂热激处理，粘附在细胞表面的DNA进入到细胞内。转基因大肠杆菌细胞的筛选方法是蓝白筛选。T载体带有一个大肠杆菌DNA的短区段。其中含有-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。这个编码区中插入了一个多克隆位点。它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到-半乳糖苷酶的氨基端，而不影响功能。这种载体适用于可编码-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。虽然宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们可以融为一体，形成具有酶活性的蛋白质。此宿主细菌易于识别，因为它们在生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷(X-gal)存在下形成蓝色菌落（X-gal在半乳糖苷酶的作用下分解生成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯靛蓝）。然而外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，导致一半乳糖苷酶无活性。因此，带重组质粒的细菌形成白色菌落。这一简单的颜色试验大大简化了在这种质粒载体中鉴定重组体的工作。仅仅通过目测就可以轻而易举地筛选数千个菌落，识别可能带有重组质粒的菌落。然后通过小量制备质粒DNA进行限制酶切分析，就可以确证这些质粒的结构。六、实验条件1. 材料 感受态大肠杆菌2. 试剂(1) LB培养基胰蛋白胨 10 g酵母提取物 5 gNaCl 10 g加入蒸馏水至终体积1000 mL，调节pH值至7.0，高温高压灭菌后备用。(2) 50 mg/mL 卡那霉素(3) 20 mg/mL X-gal(4) 200 mg/mL IPTG （异丙基硫代-D-半乳糖苷）3. 器材恒温摇床、恒温水浴、37恒温培养箱、涂布棒、微量移液器七、实验步骤1) 向冰浴保存的感受态大肠杆菌细胞中加入3-5 l连接产物，轻轻混匀，冰浴30分钟；2) 42C热激90秒，冰上迅速冷却1-2分钟，加入600 l LB培养基，37C振荡培养至少2小时；3) 在含抗生素的平板上加入一定体积的X-gal和IPTG溶液，用无菌玻璃涂布器把溶液涂布于整个平板的表面，于37C培养至所有液体消失;4) 取200 l菌液涂布于筛选培养基平板上，吹干，37C倒置培养12-16小时；5）观察平板上菌落的数量和颜色，并统计白色菌落的比例。八、思考题本实验中将外源DNA导入大肠杆菌，还可以采用哪种方法？这种方法的原理是什么？九、实验报告要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。实验报告的内容包括：（1）实验目的；（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析；（6）思考题。要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。十、注意事项及其它说明规范使用实验仪器，并注意电源安全。实验六 快速分离大肠杆菌中的重组质粒一、实验目的质粒DNA是应用最广泛的基因克隆载体。分离得到高质量的质粒，是基因克隆载体和目的基因进行重组以及对重组载体进行鉴定的前提条件。通过本实验的学习，要求学生掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法。二、实验内容用碱裂解法提取大肠杆菌中的质粒DNA三、实验要求集中授课四、实验准备在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。五、实验原理、方法和手段质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb 不等，为双链、共价闭合环状DNA ，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。质粒主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中，它具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数并表达所携带的遗传信息。环形双链的质粒DNA分子具有三种构型： 共价闭合环形DNA，两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构，这样的DNA通常呈现超螺旋构型，在电泳时泳动速度最快； 开环DNA，两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口； 线形DNA，质粒DNA发生双链断裂而形成线性分子 。质粒是重组DNA 技术中常用的载体。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。分离得到高质量的质粒，是基因克隆载体和目的基因进行重组以及对重组载体进行鉴定的前提条件。从细菌中分离质粒DNA 的方法都包括3 个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。质粒分离纯化主要有两种方法，即氯化铯溴化乙锭密度梯度离心法和碱裂解法。氯化铯溴化乙锭密度梯度离心法的基本原理是质粒DNA和染色体DNA结合溴化乙锭的量不同。 溴化乙锭通过嵌入碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。质粒具有超螺旋结构，解旋的程度有限，因此结合的溴化乙锭较少。片段化的染色体DNA是线性分子，能够结合较多的溴化乙锭分子，直至饱和( 每个碱基对大约结合个溴化乙锭分子) 。结合溴化乙锭后，DNA分子的密度减小。因此在饱和浓度的溴化乙锭溶液中质粒具有更高的密度。然后用氯化铯密度梯度离心分离质粒DNA。多年来，氯化铯溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA 的首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。碱裂解法是目前最常用的质粒提取方法。该方法最基本的原理是利用染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异来分离质粒DNA。首先强碱条件下，使染色体DNA与质粒DNA变性，然后降低体系pH值。共价闭合环状DNA由于具有超螺旋结构，它的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。线状染色体DNA 片段难以复性,，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，形成沉淀。 本实验采用碱裂解法结合硅质吸附柱分离纯化质粒DNA。在离液剂（例如盐酸胍）存在的条件下，DNA选择性的吸附在硅质吸附柱，其他杂质均可以过滤去除，然后将DNA洗脱下来，得到高纯度DNA。六、实验条件1. 材料 蓝白筛选平板上的白色菌落2. 试剂（1）质粒快速提取试剂盒（TIANGEN）溶液：50 mmol/l 葡萄糖；25 mmol/l Tris-HCl pH 8.0； 10 mmol/l EDTA pH 8.0溶菌酶水解菌体细胞壁EDTA为溶菌酶提供低离子强度的环境；抑制DNase活性葡萄糖增加溶液粘度，防止细菌染色体DNA受机械剪切力作用降解，从而污染质粒溶液：0.2 mol/l NaOH；1% SDS NaOH使染色体DNA及质粒DNA强碱变性 SDS破坏细胞膜、使蛋白变性 溶液：3 mol/l KAC （pH 4.8） pH从碱性调至中性时，质粒DNA复性，以原来的构型存在于溶液中，而染色体DNA和蛋白等以沉淀的形式存在。（2）LB培养基（3）DNA琼脂糖凝胶电泳所需试剂3. 器材台式离心机、恒温摇床、恒温水浴、37恒温培养箱、微量移液器、DNA电泳设备七、实验步骤实验之前先将蓝白筛选平板上的白色菌落接种在含有氨苄青霉素50 mg/L的LB液体培养基中，37C过夜培养。1碱裂解法提取质粒1) 取1.5 ml菌液12,000 rpm离心30秒，收集菌体；2) 100 l预冷的溶液重悬菌体，剧烈振荡，使菌体在溶液中完全分散；3) 加入200 l新配制的溶液，盖紧管口，快速颠倒离心管数次，混匀后冰浴3分钟；4) 加入预冷的150 l溶液，盖紧管口，将离心管倒置后温和地振荡数次，使溶液在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后冰浴5分钟；4) 4C，12,000 rpm离心5分钟，取上清，加入等体积酚/氯仿(1:1)，振荡混匀，4C，12,000 rpm离心5分钟；5) 取上清液，加入两倍体积的无水乙醇，冰浴10分钟，4C，12,000 rpm离心10分钟；6) DNA沉淀用70%乙醇洗两遍，吹干，100 L TE溶解，加入10 g/l RNAase 1l, 37C保温30分钟；7) 加入等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次；8) 取上清液，加入1/10体积的3 mol/l NaAC和两倍体积的无水乙醇，混匀，冰浴30分钟；9) 4C，12,000 rpm离心10分钟，沉淀用70%乙醇洗两遍，吹干，30 l TE或ddH2O溶解；10）取少许质粒溶液进行电泳，观察质粒提取的量和纯度。2碱裂解法结合硅质离心吸附柱快速、高效提取质粒（具体操作步骤请参看试剂盒配套的说明书）1) 收集1.5-3 ml菌液的沉淀于1.5 ml离心管中，加入100 l溶液，振荡至彻底悬浮；2) 加入150 l溶液，立即轻柔颠倒离心管数次，使菌体充分裂解，裂解后的菌体变得清亮，随后将离心管放置于冰上1-2分钟；3) 加入150 l溶液，立即温和颠倒离心管数次，室温放置5分钟，12,000 rpm离心10分钟；4) 将420 l结合缓冲液加入硅质离心吸附柱中，然后将步骤3中得上清液加入离心吸附柱中，混匀，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液收集管中的废液；5) 加入750 l漂洗缓冲液于离心吸附柱中，12,000 rpm离心30秒，倒掉废液收集管中的废液；6) 重复步骤（5）一次，再次于12,000 rpm离心2分钟，尽量除去漂洗缓冲液；7) 小心取出离心吸附住，将其套入一个干净的离心管中，加入适量洗脱缓冲液，室温放置2-5分钟后，12,000 rpm离心1分钟,离心收集的液体即可用于下游操作（对于大于10 kb的大质粒，可将洗脱缓冲液于70C水浴放置5-10分钟，以确保质粒的完全洗脱）；8）取少许质粒溶液进行电泳，观察质粒提取的量和纯度。八、思考题1. 你提取质粒的电泳结果中有几条带？为什么？在碱裂解法提取质粒DNA操作过程中应注意哪些问题？2. 在碱裂解法提取质粒的方法中，染色体DNA与质粒DNA分离的主要依据是什么？九、实验报告要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。实验报告的内容包括：（1）实验目的；（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析（画出电泳图谱示意图）；（6）思考题。要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。十、注意事项及其它说明规范使用实验仪器，并注意电源安全。基因工程菌种不可随意丢弃，要统一进行灭菌处理。实验七 重组质粒的酶切鉴定一、实验目的1. 了解转基因细胞的筛选方法2. 掌握限制性核酸内切酶酶解分析法鉴定转基因细胞的原理和方法二、实验内容用限制性内切酶对质粒进行酶切反应,然后电泳检测。三、实验要求集中授课四、实验准备在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。五、实验原理、方法和手段转基因细胞的筛选方法包括遗传表型直接筛选法、分析重组DNA结构特征、核酸分子杂交检测法、免疫化学检测法等多种方法。其中分析重组DNA结构特征是常用的方法之一，包括快速裂解菌落鉴定质粒DNA分子大小、限制性核酸内切酶酶解分析法、利用PCR方法筛选转基因细胞等方法。限制性核酸内切酶酶解分析法的原理是选用DNA重组时用到的限制性内切酶，或根据重组DNA的结构特征选用一种或两种限制性内切酶，对重组DNA进行酶切反应，然后电泳检测酶切产物。如果是重组DNA，会出现已知大小的目的基因片段和载体 DNA片段。六、实验条件1. 试剂(1) LB培养基(2) 50 mg/mL 卡那霉素(3) 质粒快速提取试剂盒 (TIANGEN)(4) 限制性内切酶EcoR I (Promega)(5) 50TAE电泳缓冲液：(6) 10 mg/mL EB(7) 琼脂糖(8) DNA分子量标记 (TIANGEN)(9) 10上样缓冲液2. 器材恒温摇床、无菌牙签、涡旋振荡器、台式离心机、微量移液器、37恒温培养箱、电泳仪（一套）、微波炉、紫外分析仪、七、实验步骤1在微量离心管中依次加入如下试剂：DNA 1.0-2.0 g10酶切反应buffer 3 l限制性内切酶 10 U-15 UddH2O 加至终体积30 l2. 37C反应2个小时左右3电泳检测酶切结果八、思考题本实验中还可以选用哪些限制性内切酶对重组DNA进行鉴定？九、实验报告要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。实验报告的内容包括：（1）实验目的；（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析（画出电泳图谱示意图）；（6）思考题。要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。十、注意事项及其它说明规范使用实验仪器，并注意电源安全。实验八 外源基因诱导表达及蛋白质检测一、实验目的学习并掌握外源基因在原核细胞中表达的特点及其在蛋白的电泳检测方法和技术.二、实验内容用IPTG诱导大肠杆菌表达重组蛋白，然后SDS-PAGE电泳，用考马斯亮兰染色方法检测重组蛋白，同时用免疫印迹方法检测重组蛋白。三、实验要求集中授课四、实验准备在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。五、实验原理、方法和手段通过基因重组可将外源基因导入细胞,并使之扩增或表达.外源基因被克隆在Lac启动子下游,与表达质粒载体连接构成重组体,经CaCl2转化导入感受态大 肠杆菌细胞内.当有IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖苷)时, Lac启动子被诱导而启动其下游基因 进行表达,从而在转化导入感受态大肠杆菌细胞中产生外源基因表达的产物.通过电泳可检测表达产物蛋白质的存在.聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)是在蛋白质溶液中加入SDS和巰基乙醇后, 巰基乙醇还原蛋白质分子的二硫键; SDS能打开蛋白质的氢键疏水键,同时结合成SDS-多肽复合物.在一定条件下, SDS-多肽复合物(1.4:1克), SDS与变性蛋白结合使蛋白质均带负电荷.所 以,在电泳中的迁移率只与分子量有关而与其本身的电荷无关.六、实验条件1. 菌株,载体,培养液及培养用试剂: BL21, GST-GFP vector, LB培养液，kanamycin (50ug/ml), 溶菌酶, IPTG。2. 制备聚丙烯酰胺凝胶用试剂: 丙烯酰胺，N,N 亚双丙烯酰胺， 过硫酸胺， 四甲基乙二胺， 十二烷基硫酸钠。3. 聚丙烯酰胺凝胶电泳用试剂及材料:甘氨酸， protein marker; 溴酚蓝，转印膜，甘油滤纸，Tris-HCl(pH8.8)， Tris-HCl(pH6.8), 10%SDS，n-butanol；Running buffer: 25mM Tris base, 192mM glycine, 1% SDS; Transfer buffer: 20mM Tris, 150mM glycine, 20% methanol(膜转移用);5xsample buffer: 250mM Tris-HCl(pH6.8), 10%SDS(电泳级), 0.5M DTT, 10%glycerol,100mM 2-Mercaptoethanol4. 阳性对照样品制备用试剂及材料: 10X PBS，脱脂奶粉，自制一抗，酶偶联二抗，小鼠脑组织，lysis buffer(50mM TrispH7.4, 150mM NaCl, 1mM EGTA, 1mM EDTA, 1mM NaVO4, 10% glycerol, 1%Triton X-100)5. 检测所需试剂及材料: 考马斯亮蓝染液: 0.25% brilliant blue, 50% methanol, 7.5% glacial acetic acid； 脱色液: 10%methanol, 10% glacial acetic acid;自制一抗，酶偶联二抗，tween-20，胶片，压片暗盒，增感屏，显影液，定影液6. 仪器及用具: 垂直电泳装置， 电泳转移装置， 组织匀浆机;，37培养箱， 台式高速离心机，水浴箱，水平摇床， 制冰机，电磁炉，加热锅， 染色缸，脱色缸，镊子; 托盘，乳胶手套; Tip, 1.5ml离心管，锥形瓶; 离心管 等七、实验步骤(1) 外源基因诱导表达 (gene expression) 预培养过夜.将过夜培养的菌液按1:100比例接入新的含有抗生素的LB培养液中.在37震荡培养3-5小时使 OD600=0.6-0.8之间.加IPTG诱导过夜.离心,用1xPBS洗两次,菌体-20保存.(2) 上样, SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(electrophoresis)加入5X点样液,100沸水浴加热五分钟,使蛋白质充分变性.到室温后, 将样品上样SDS-PAGE凝胶加样孔内.,同时用蛋白质标准品作阳性对照. 当溴酚蓝到达胶的末端时停止电泳. 将凝胶从中间切开, 一半作膜转移,留下一半作染色检测。 将凝胶移入染缸内, 放在平缓的摇床上于室温染色3-4小时。 回收染液以备后用, 将凝胶浸泡于脱色液中, 放在平缓的摇床上于室温色3-5小时, 其间更换脱色液3-5次.脱色越充分, 蛋白质检出下限越低, 一般可检测到单一条带中含量低至0.1ug的蛋白质.八、思考题1SDS-PAGE中上下层胶中为什么用不同pH的Tris-HCl(pH6.8 和pH8.8)?2电泳液中为什么用甘氨酸?3比较蛋白质检测方法中染色法与印迹法的异同4比较ELISA和western blotting的异同5Western blotting中如何减少非特异性条带的出现？九、实验报告要求学生在实验之前认真阅读实验指导及相关资料，进行归纳总结，完成实验预习报告。实验过程中，认真记录实验步骤，观察实验现象，记录实验结果。实验报告的内容包括：（1）实验目的；（2）实验原理；（3）生物材料、试剂、实验仪器；（4）实验步骤；（5）实验结果和分析；（6）思考题。要求学生在实验指导及实验操作的基础上，独立进行归纳总结，完成一份内容完整、条理清晰、重点突出的实验报告。十、注意事项及其它说明规范使用实验仪器，并注意电源安全。实验九 细胞凝集反应一、实验目的观察细胞凝集现象并了解其原理。二、实验内容用土豆凝集素对鸡血细胞进行凝集反应。三、实验要求集中授课四、实验准备在进行实验之前，要求学生在对课堂相关知识点理解和掌握的基础上，认真阅读本实验指导，并进行归纳总结，完成预习报告。五、实验原理、方法和手段细胞膜是双层脂镶嵌蛋白质结构，脂和蛋白质又