植物组织培养脱毒快繁技术的综述.doc

广西职业技术学院毕业论文（设计） 第- - 10 - -页植物组织培养脱毒快繁技术的综述李西雁（广西职业技术学院农业技术工程系2002级应用生物技术专业）摘要：脱除病毒是植物组织培养深入探讨研究中的一个技术难题。本文结合在桂林莱茵生物科技股份有限公司的实践情况，简要介绍植物组织培养的基本原理和方法，综述植物脱除病毒的热处理、茎尖培养和抗病毒药剂三种方法的原理、发展史和技术方法，并介绍了几种常用的病毒检测方法。本文以马铃薯为例，重点介绍了利用热处理加茎尖组织培养法获得马铃薯脱毒苗的具体技术方法，脱毒率可达100%。同时还对植物组织培养脱毒快繁技术的应用前景作了分析。关键词：茎尖培养，组织培养，快繁脱毒技术，病毒检测，应用前景1 植物组织培养研究概况1.1 研究简史自从1943年怀特（White）提出植物细胞“全能性”（Totipotency）学说及诸多后学者（Steward，1958，Guha和Marteshwari，1964）相继证实后，引发植物组织和细胞培养快繁技术的勃然兴起。我国的专家学者在20世纪70年代后也在此领域做了大量的研究和开发工作，创造了很多新方法、新技术，提出不少新成果，开拓了植物组织培养快繁技术的新局面1。目前采用组织培养脱病毒快繁及离体快繁生产株苗的技术已发展相当成熟2。脱毒株苗具有无杂菌、适应能力较强、繁育较快、质量优、抗性好、分蘖性强、繁殖系数高、大批量生产、周年供应、便于运输等优点，已得到有关专家的鉴定及高度评价和种植试验区、种植产区果农的认可。例如脱毒马铃薯、脱毒红薯、脱毒生姜、脱毒大蒜、脱毒草莓、脱毒苗木、脱毒花卉等等，已成为现代农民致富的新宠2。1.2 植物组织培养和脱毒快繁的定义植物组织培养（Plant tissue culture）是指在无菌的条件下，将离体的植物（根、茎、叶、花、果实、种子等）、组织（形成层、花药组织、胚乳、皮层等）、细胞（体细胞和生殖细胞）以及原生质体，培养在人工配制的培养基上，给予适当的培养条件，使其长成完整的植株。由于培养物是脱离植物母体，在玻璃瓶中进行培养，所以也叫做离体培养。其完整过程是： 脱分化 再分化 生长 根茎叶外植体愈伤组织 生长点 或 完整植株 发生 胚状体在有些情况下，再分化也可不经愈伤组织阶段，而直接发生于脱分化的细胞1。植物组织培养脱毒快繁是人工在无菌条件下利用植物体的一部分，在人工控制的营养和环境条件下繁殖植物，脱除病毒得到无毒苗株，继而在大田快速繁殖的技术。脱毒及离体快繁，这是目前植物组织培养应用最多、最广泛和是有效的一个方面。主要是进行茎尖培养脱除病毒。对于脱毒苗、新育成、新引进、稀缺良种、优良单株、濒危植物和基因工程植株等可通过离体快速繁殖，同时可不受地区和气候的影响，比传统的繁殖方法快数万倍。植物组织培养已发展成为一门富有生命力的学科。追究植物组织培养脱毒快繁技术的发展简史，在11世纪就出现的热处理脱毒法，最早解决一些作物的病毒病害问题1。本世纪50年代发展的植物组织培养技术为脱毒提供了一条有效途径。现在植物的脱毒技术有多种，其中应用最广泛的有三种：热处理法、茎尖培养脱毒法、抗病毒药剂法，将不同的方法相结合起来应用效果更好。它们的脱毒原理各不相同。2 脱毒技术及其原理2.1 热处理法2.1.1 概述热处理法是利用病毒和寄主植物对高温的忍耐性的差异，使植物的生长速度超过病毒的扩散速度，得到一小部分不含病毒的植物分生组织，然后进行无毒个体培育。热处理法中，最主要的影响因素是温度和时间。热处理可通过热水浸泡或湿热空气进行。热水浸泡对休眠芽效果较好，湿热空气对活跃生长的茎尖效果较好，既能消除病毒又能使寄主植物有较高的存活机会。热空气处理比较容易进行，把旺盛生长的植物移入到1个热疗室中，在3540下处理一段时间即可，处理时间的长短，可由几分钟到数月不等4。热处理的方法有恒温处理和变温处理，处理的材料可以是植株，也可以是接穗。2.1.2 原理热处理脱毒是根据病毒与寄生细胞对高温的忍耐程度不同，选择适当的温度和处理时间，植物组织中的很多病毒被部分地或完全地钝化而可控制其的活动，但很少伤害甚至不伤害寄主组织，从而让植物细胞加快生长，使生长点附近不带病毒，从而达到脱毒的目的。2.1.3 简史用热处理脱除马铃薯卷叶病毒（PLRV）是世界上脱除已知病毒最早的例子。早在1889年，印度尼西亚爪哇人就把繁殖用的甘蔗切断放在50左右的热水中浸泡30min来防止枯萎病（现已知是病毒病）的发生。现在世界许多国家在种植前仍使用这种方法处理甘蔗。但是后来人们发现热水对植物的伤害大，Bake (1972)研究表明在热水处理中，由于植物组织经过淋洗，在水中长期浸泡常常会窒息死亡，并且这种处理也会打破或延长植物的休眠期。所以现在更常用的方法是将病毒感染的植物用3538热空气处理24周或者更长时间进行脱毒4。此法尤其适合处理生理干旱的材料和处于休眠状态的果树。热处理脱毒法已应用多年，被世界多个国家利用。该项技术要求的设备条件比较简单，脱毒操作也比较容易。主要缺点是脱毒时间长，脱毒不完全，例如TMV这类杆状病毒就不能用这种方法脱除，因而该方法有一定的局限性。2.2 茎尖培养脱毒法2.2.1 概述茎尖培养脱毒就是采取茎尖分生组织离体培养的方法获取无病毒试管苗，其方法是在解剖镜下，用锋利的解剖刀进行迅速准确地茎尖剥离，因为茎尖分生组织基本不带病毒，利用植物茎尖分生组织进行离体培养，再结合病毒检测，就可以获得无病毒的植株。茎尖培养中最主要的影响因素就是切取茎尖的大小，一般要求茎尖长度小于1mm。技术上通常切取茎尖越小，脱毒效果越好，但是茎尖培养成活率变低。曹为玉等研究发现葡萄茎尖长度与存活率成正相关，与脱毒率成反相关。当切取茎尖长度为0.20.3mm时，存活率为21%38%，脱毒率为91.4%97%；当切取0.5mm以上时，存活率为75%83%，脱毒率仅为70.6%76.5%8。茎尖培养脱毒法脱毒率高，脱毒速度快，能在较短的时间内得到较多的原种繁殖材料，但这种方法存在的缺点是植物的存活率低。为了克服这一缺点，现在经常是将茎尖培养与热处理相结合来使用。茎尖培养与热处理相结合之所以能够提高脱毒效果，是由于热处理可使植物生长本身所具有的顶端免疫区得以扩大，有利于切取较大的茎尖（在1mm左右），从而能够提高培养或嫁接的成活率。如大樱桃置于45的恒温培养室内，培养35天，再切取0.20.4mm的茎尖培养，平均脱毒率为98%。2.2.2 原理 茎尖培养脱毒的原理是植物体内病毒靠维管束系统移动，分生组织中没有维管束存在，病毒只靠胞间连丝移动，速度很慢，难以追上生长活跃的分生组织，所以旺盛生长的根尖、茎尖一般都无病毒或很少有病毒分布。2.2.3 简史 White于1943年首先发现在感染烟草花叶病毒的烟草生长点附近病毒的浓度很低，甚至没有病毒。这一发现为茎尖培养脱除病毒提供了理论依据。怀特（White ,1934）在体外培养感染了TMV病毒的马铃薯根，并用枯斑寄主法测定了根不同部位的病毒含量，发现根尖部位的病毒含量比其他部位少，甚至不存在病毒。Morel等1952年首先从感染了花叶病毒和斑萎病毒的大丽花植株上切取茎尖，通过组织培养获得了无病毒的大丽花，证明了前人假设的正确性1。此后，人们采用茎尖培养技术相继获得了多种植物的无病毒植株。现在茎尖培养脱毒法已经成为植物无毒苗生产中应用最广泛的一种方法。1998年，桂林市大地生物技术研究所与广西山河经济发展公司联合开展罗汉果脱毒苗的培育生产技术科技攻关，在选出的健康植株中选取营养体,经过茎尖培养与其它脱毒方法相结合脱毒后进行组织培养，从而获得不带病的健康苗。经农业种植区试点种植表明，这些经茎尖培养脱毒快繁得到的罗汉果脱毒苗植株健壮无病，长势旺，结果早，数量多，品质高，与传统压蔓技术种植的普通苗相比，种后第一年结果的植株达50%70%，增加近一倍；平均每株挂果约30个，增加了两倍，一级果增加了15%，有效成分罗汉果甜甙的收取率则提高了5%。广西农科院生物所杭玲等在罗汉果茎尖脱毒快繁技术一文中试验，选择罗汉果青皮果品种，采用种子播种的实生苗,经接花叶病毒而致病的植株，运用茎尖培养与热处理相结合的方法对供试材料进行除病毒，经用生物学指示植物鉴定,脱毒率达100%。据研究，植物体内某一部分组织器官不带病毒的原因是：分生组织的细胞生长速度快，病毒在植物体内繁殖的速度相对较慢，而且病毒的传播是靠筛管组织进行转移或通过细胞间连丝传递给其他细胞，因此病毒的传递扩散也受到一定限制，这样便造成植物体的部分组织细胞没有病毒。根据这个原理，可以利用茎尖培养来培育无病毒苗木。2.3 抗病毒药剂法2.3.1 概述抗病毒药剂法，这是一种新的脱毒方法，运用一些抗病药剂的作用影响病毒RNA的复制形成，干扰病毒的正常生长，从而达到除去病毒的目的。常用的抗病毒化学药物有三氮唑核苷（病毒唑），5-二氢尿嘧啶（DHT）和双乙酰-二氢-5-氮尿嘧啶（DA-DHT）。这些药物常常通过直接注射到带病毒的植株上，或者加到植株生长的培养基上。这种方法一般要与茎尖培养相结合应用。经过抗病毒药剂处理的嫩茎，切取茎尖，再进行组织培养，就会提高脱毒率和成活率。采用病毒抑制剂与茎尖培养相结合的脱毒方法，可以较容易的脱除多种病毒，而且这种方法对取材要求不严，接种茎尖可大于1mm，易于分化出苗，提高存活率。2.3.2 原理抗病毒药剂法的作用原理是抗病毒药剂在三磷酸状态下会阻止病毒RNA帽子结构形成而达到除去病毒的效果。3.3.3 简史罗晓芳等于1996年曾在培养基中加入病毒唑，脱除了两种苹果潜隐病毒1。除了以上三种脱毒方法以外，花药培养法、茎尖嫁接脱毒、愈伤组织培养法、胚珠培养法也可用于植物组织培养快繁脱毒。3 脱毒效果的检测方法 经过脱毒处理的植株是否还存在病毒，必须经过病毒学检测才能确定。可靠的病毒检测方法与建立有效的脱毒方法同等重要。传统上一直沿用的检测方法是目测法，但是这种方法无法剔除潜隐性病毒。后来出现的指示植物法，扩大了检测范围。近年来随着生物科学的迅猛发展，免疫学方法，分子生物学方法等许多先进的理化技术的应用，促进了病毒检测技术的改进与发展。下面简要介绍几种检测脱毒苗的方法。3.1 植株直接测定法 直接观察植株茎叶有无某种病毒引起的可见症状，是最简单的测定方法。不过，由于某些寄主植物感染病毒后需要较长的时间才出现症状，有的并不能使寄主植物出现可见的症状，因而无法快速检验。3.2 指示植物法此法最早是美国的病毒学家Holmes l929年发现的1。利用病毒在其他植物上出现症状的特征，作为鉴别种类的标准。当原始寄主的症状不明显时，就可用指示植物法，这是因为指示植物比原始寄主更容易表现症状。具体做法是将病叶研磨，把汁液接种到寄主植物上，对于木本植物，是将原始寄主嫁接到指示植物上。指示植物法简便易行，成本低，但它灵敏性差，所需时间长，难以区分病毒种类。3.3血清学方法 抗血清鉴定法要进行抗原的制备(包括病毒的繁殖，病叶研磨和粗汁液澄清等)，抗血清的采收、分离等。血清可分装到小玻璃瓶中，贮存在1525的冰冻条件下。测定时，把稀释的抗血清与未知的病毒植物在小试管内混合，这一反应导致形成可见的沉淀，然后根据沉淀反应来鉴定病毒。此法灵敏度高，获得检测结果迅速，是目前检测病毒的一种最好方法。此外，PCR微量板杂交法5、蛋白质电泳法、嫁接检测法、 电子显微镜检定法、病毒症状学诊断法等也可以用来检测植物病毒。4 马铃薯组织培养脱毒快繁技术鉴于当前农业经济作物生产上苗木（主要是无性繁殖作物）存在着严重病毒累积、品种退化、产量和品质大幅度的下降等问题，探索一种脱毒效果好、繁殖系数高、简易且经济的繁育良种及健苗技术，是当前农业经济作物种苗木生产中急需研究和探讨的课题。下面通过以马铃薯为例，进行热处理加茎尖培养结合病毒检测法获得脱毒苗的方法，简述植物组织培养脱毒快繁技术的应用。4.1 研究简史 马铃薯在种植过程中易感染病毒，当条件适合时，就会在植株体内增殖，转运和积累于所结薯块中，并且世代传递，逐年加重4。病毒的增殖与植物正常代谢极为密切，目前尚没有发现既能杀死病毒又不损伤植物的药剂，病毒危害一度成为马铃薯的不治之症。1953年Nirris将孔雀石绿（Malachite green）加入培养基中抑制病毒繁殖，并通过茎尖组织培养，获得青山（Green mountain）品种无PVX（马铃薯X病毒）的马铃薯植株。此后，通过茎尖组织培养获得无病毒植株的技术迅速发展，为解决马铃薯病毒危害提供了有效途径，为生产提供优良种薯。目前，国际上用茎尖培养产生的马铃薯品种已达150个左右1。科学研究结果证明，侵染马铃薯的病毒有20多种。这些病毒一旦侵入马铃薯植株和块茎，就会引起马铃薯退化，出现各种各样的病态，造成不同程度的减产。研究的结果还证明，病毒在植物组织中分布是不均匀的，并且受一定环境条件影响，在靠近马铃薯茎的顶端病毒浓度很低或不含病毒。根据这一特点，通过茎尖培养可以获得马铃薯无病毒苗3。另外，马铃薯病毒，有的对温度比较敏感，有的不敏感，但对植株或发芽的块茎进行高温处理后再作茎尖培养，一般脱毒率都比较高。因此，在茎尖培养前，对植株和发芽块茎进行3035，28天的高温预处理，能收到良好的效果。4.2 马铃薯茎尖培养脱毒方法利用茎尖组织培养结合病毒检测，对马铃薯进行脱毒，进而生产脱毒种薯用于生产，可有效地防止种薯退化，大幅度提高马铃薯产量3。其主要脱毒方法如下：4.2.1 取材和消毒将欲脱毒地品种块茎催芽，芽长45cm时，剪芽并剥去外叶，自来水下冲洗40min，于无菌室内用漂白粉溶液消毒后，无菌水冲洗23次。4.2.3 剥离茎尖和接种在无菌室内，于40倍地解剖镜下，剥取带1个叶原基地茎尖，接种于MS茎尖培养基地试管中。试管中的MS茎尖培养基包括大量元素、微量元素、有机成分和生长素、细胞分裂素、蔗糖和琼脂，pH值为5.8，经过高压蒸汽灭菌后使用，每试管接种1个茎尖。4.2.4 培养基和培养条件茎尖培养的关键是奖脱毒后的茎尖透导生成带有完整根、茎、的植株，因此选择适合的培养基十分重要。对于马铃薯的茎尖培养来说，需要较多的NO3和NH4+营养，MS和Miller基本培养基都是较好的培养基，而且附加少量（01.mol/l0.5mol/l）的生长素或细胞分裂素或二者都加，培养的效果更好。接种的茎尖培养于25、15003000LX光照条件下培养室内，3个月则长成34片叶的小植株在无菌条件下，进行切段扩繁一次，取部分苗进行病毒检测6。4.2.5 病毒检测 病毒检测是茎尖脱毒不可缺少的步骤。常用鉴别寄主即指示植物或血清学方法进行检测，及时淘汰血清学阳性反应或在指示植物上有症状的茎尖苗，无任何反应的茎尖苗即脱毒苗用作大田快速繁殖。4.2.6 结果通过利用茎尖组织培养结合病毒检测法获得马铃薯脱毒苗，经病毒检测，除去了马铃薯中的病毒病，脱毒率可达100%。5 植物组织培养脱毒快繁技术应用前景的简述植物组织培养技术在作物上主要用于育种和良种繁殖，其次用于无性繁殖作物的脱毒和快繁以及种质的保存等，可见植物组织培养脱毒快繁技术对于农作物苗木的生产具有极其重要的地位1。一些农作物或是花卉植物等因长期的栽培和种植，植物体内被侵染携带病毒、种性退化现在能利用组织培养及快繁脱毒方法开发出的植物脱毒新品种有马铃薯、甘薯、生姜、大蒜、草莓、罗汉果、棕榈、剑麻、香蕉、甘蔗以及花卉植物等几百种再生植株。目前这种技术已得到了广泛应用，前景及范围非常广阔。脱毒株苗的快繁技术是，经过茎尖培养和检测取得的脱毒苗，首先按不同品种保存在管瓶中。在需要时对脱毒苗进行切段繁殖，繁殖试管苗一般都用MS培养基，在100ml的三角瓶接种46节段。每节含一个叶片。在无菌条件下进行培养。培养的节段经过35天即可生根，幼芽也从叶腋发出，10天左右可形成23片叶的幼苗。20天左右即长成56片叶的小植株。一个三角瓶有46株脱毒苗。这些小植株又可按上述方法进行切段繁殖，从而扩大无病毒苗株的数量7。6 结论由微生物所引起的植物组织培养污染一直是当前制约植物组培发展的主要障碍，特别在接种和培养过程中，污染率常常高达80% 以上。如何解决这个问题已经引起很多人的重视.国内许多研究人员开展了这方面的一些研究，但还欠缺更深入的研究探讨。这是有待去探讨开发的一个课题。本文结合了笔者在桂林莱茵生物科技股份有限公司的实习实践，综合了自己通过做实验和工作实践中获得的知识与想法，对国内外植物组织培养的研究概况作了简