课件：培养可能并非最终答案.pptx

培养可能并非最终答案 Culture may not be the answer,山东省聊城市人民医院 重症医学科 吴铁军,2019,-,1,社区/医院获得性感染 全球每年约4000万感染，50万死亡。中国每年约1000万感染(WHO2017报告） 细菌耐药形势严峻 WHO保守估计到2050年全球因细菌耐药问题每年死亡人数将逾越100万人。中国提出遏制细菌耐药国家行动计划 新发病原体层出不穷 病原微生物中超过70%的病毒来源于动物传播，而自然界超过99%微生物尚未明确,重症肺炎 20-25%病原不明,脓毒血症 40-50%病原不明,脑炎脑膜炎 50-60%病原不明,Allegranzi B, Bagheri Nejad S et al. Lancet. 2011 Jan 15;377(9761):228-41,重症感染发病率逐年升高、疑难危重感染威胁巨大,2019,-,2,重症感染的诊断,早期诊断,发热、咳嗽、咳痰 呼吸急促、寒战、 皮疹、肌肉疼痛、 尿路刺激症状， 局部红肿热痛等,临床表现,器官功能（SOFA）,辅助检查,生物标记物,病原学检查,病原学诊断,呼吸、凝血、 肝脏、肾脏、 循环、神经、,白细胞计数 中性粒细胞百分比 影像学检查,降钙素原 超敏C反应蛋白,涂片镜检、培养、 抗原抗体检测、 PCR技术、质谱分析、核酸二代测序,重症感染早期诊断和病原学诊断至关重要,2019,-,3,病原微生物鉴定的检测技术分类,2019,-,4,传统微生物培养方法局限性,传统培养方法 耗时长：平均3-5天，难以培养的细菌，真菌需要超过一周 培养阳性率低：血培养 8-12%，脑脊液培养 8-10% 检测种类有限，病毒和非典型病原无法培养 未知或变异病原体的鉴定准确性,抗菌素选择困难,2019,-,5,正确看待培养阳性结果,多部位采集、多次送检可以解决大多数的问题，而不是全部,定植指局部培养出病原微生物，但是病人没有表现出感染的症状，一般不需要抗感染治疗。 感染则是局部培养出病原微生物同时伴有感染的症状，需要抗感染治疗方可痊愈。,2019,-,6,咳痰标本的采集方法 -医师或护士直视下采集标本，如有必要，可用吸痰器采集 -病人先用无菌生理盐水漱口，去除表面的菌群 -教育病人深咳，收集从下呼吸道咳出的痰液 时间要求 -清晨的痰含菌量最多，是最佳采集时间 -在抗生素应用前采集痰标本 -标本采集后12h内必须立即进行实验室处理 -如果无痰可用35NaCl 5ml雾吸约5min导痰， 也可用物理疗法、体位引流、鼻导管抽吸等法取痰 -不建议24h内多次采集，除非痰液外观性状出现改变,怎么样才算是一份合格的痰标本？,2019,-,7,合格的BALF含非病原性菌很少,BALF可能会受到上呼吸道分泌物的污染 采用远端带气囊的保护性导管可避免标本采集环节的污染,BALF能获取肺泡表面衬液 一份合格的BALF含非病原性菌很少 BAL检查在下呼吸道感染的检查中占有重要的地位,标本污染,感染,临床上，严格无菌操作可很大程度上避免这种污染,常见的两种情况,肺部感染：临床主要症状及危害主要由某种细菌感染引起 混合感染：检出多种致病菌，有多重细菌引起的混合感染,支气管肺泡灌洗较常用于ICU病房的重症患者、经抗生素治疗未获改善的患者、 机械通气肺部感染的患者、疑似肺部真菌或支气管结核患者 肺部感染性疾病支气管肺泡灌洗病原体检测中国专家共识-中华医学会呼吸病学分会,2019,-,8,培养阳性的扩展意义,病原体培养阳性并非就是感染，或一定是该病原菌感染 需依据感染部位、病人临床表现的特点以及病人不同病理、生理特点来综合分析 正常无菌的体腔（血液，脑脊液，胸腹水等）中分离到的病原体，考虑感染病原体 非无菌部位（皮肤，黏膜或创面）分离的病原体，需结合临床、影像、化验以及组织病理依据，区别定植或感染 但如果脓液培养，或反复为同一结果，或保护性标本，或菌落计数达到一定量-倾向于感染,2019,-,9,针对微生物 形态学： 染色法 革兰染色 抗酸染色 墨汁染色 荧光染色 六胺银染色 培养： 普通培养 厌氧培养 真菌培养 结核培养 分子生物学 Real-time PCR 检测肺炎支原体、衣原体、结核分枝杆菌、肺炎链球菌和军团菌等 X-PERT诊断 基因芯片 新技术 质谱分析 高通量基因组测序 针对微生物抗原或结构 G/GM试验、隐球菌抗原、结核抗体检测 免疫反应检测 T-SPORT和病毒检测,病原微生物实验室诊断策略,培养并非唯一或最终答案,2019,-,10,方便快捷，主要诊断寄生虫、特殊染色的细菌 不适用于病毒，无法分清感染源,-不染色镜检 -革兰染色 -抗酸染色 -弱抗酸染色 -六胺银染色 -KOH压片 -免疫荧光染色,形态学检查-显微镜检查,2019,-,11,革兰氏染色,肺炎链球菌,葡萄球菌,大肠杆菌,鲍曼不动,粘液性铜绿,2019,-,12,抗酸染色,结核分枝杆菌,奴卡菌,荧光显微镜,2019,-,13,真菌形态学,竹节状菌丝,菌丝孢子,隐球菌（墨汁染色）,2019,-,14,血清学与免疫学检测,血清学检测：是通过已知的抗体或抗原来检测病原体的抗原或抗体，从而对病原体进行快速鉴定的技术，简化了鉴定步骤，常用的方法包括： 血清凝集技术 乳胶凝集实验 荧光抗体检测技术 协同凝集试验 酶联免疫测试技术 免疫磁珠分离技术(IMBS)等,IMBS：基本原理是将特定病原体的单抗或多抗或二抗偶联到磁珠微球上，通过抗原抗体反应形成磁珠一目标病原体复合物或磁珠一抗目标病原体复合物，在外部磁场磁力的作用下，将目标病原体分离出来。目前已经开发出了针对各种病原体的免疫磁珠，如大肠埃希菌、李斯特菌、白色念珠菌、军团菌等，广泛应用到各级科研和实验室,2019,-,15,血清学与免疫学检测-G、GM试验,G试验检测的是真菌的细胞壁成分-1,3-D-葡聚糖（BG），人体的吞噬细胞吞噬真菌后，能持续释放该物质，使血液中含量增高。 定植时BG很少释放入血，因此可有助于鉴别真菌侵袭与定植。,半乳甘露聚糖（Galactomannan,GM）曲霉菌细胞壁上的一种多聚抗原，从薄弱的菌丝顶端释放，曲霉菌感染的患者血液内存在该物质，而且长于临床症状和影像学出现异常之前数日出现。 GM试验可用于曲霉菌感染的早期诊断的筛查指标,适用于除隐球菌和接合菌（毛霉菌）外的所有深部真菌感染的早期诊断，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能确定菌种,2019,-,16,2019,-,17,血清学与免疫学检测,结核抗体 隐球菌抗原 艰难梭菌抗原检测,呼吸道病源八项,2019,-,18,基因检测,随着分子生物学检测技术日新月异，对病原微生物的鉴定已深入到了分子水平、核酸水平。病原微生物的核酸序列即基因片段都是特异的，有别于其他种或属，检测其特有的基因片段序列可用来鉴别病原微生物。 核酸杂交技术 基因芯片技术 PCR技术 二代基因测序等其他检测技术,2019,-,19,呼吸道13种病原体核酸检测,2019,-,20,宏基因组学（mNGS）方法应用,宏基因组学测序法（metagenomic shotgun sequencing) 可分析复杂样本中微生物组的多样性及丰度,传统微生物 流程复杂 周期漫长 方法学复杂 全基因组测序 流程简单 一站式解决 精准数据,2019,-,21,病原宏基因 诊断方法学优势,灵敏度高：DNA序列明确，信号清晰 特异性高：物种特异性序列 覆盖度广：一次检测可测上千个病原菌 检测能力强：可检测所有已知/新的病原菌,2019,-,22,新英格兰经典案例,Wilson MR et al. N Engl J Med； 2014 ;370(25):2408-17,14岁,联合免疫缺陷综合征男孩 4个月, 多次发热，诊断脑膜炎并发展为脑积水和癫痫状态 2013年波多黎各旅行 6周内-38项 感染病原检测 5种 抗生素经验治疗 48小时,脑脊液高通量测序 钩端螺旋体,475条序列,更换青霉素 32天, 痊愈出院,mNGS鉴定疑难感染病原,38项 感染病原检测,5种 抗生素先后联用,NGS,32天 出院,2019,-,23,宏+全基因组学实现腺病毒分型,Journal of Infection, Zou and Cao 三例重症肺炎病人通过传统PCR方法检测到人类腺病毒（HAdV）但无法分型 样本进行宏基因组学测序（mNGS)后获得三株HAdV的全基因组序列，成功确定型别分别为两株B7和一株B3，并进一步通过特异PCR确定突变位点。 mNGS还可检测到样本中所有的病原体,Zou X, Fan Y et al. J Infect. 2018 Aug;77(2):158-164.,-,病原宏基因组诊断方法学优势,1.Parize, P., Muth, E.,et al. B. (2017). Untargeted next-generation sequencing-based first-line diagnosis of infection in immunocompromised adults: a multicentre, blinded, prospective study. Clinical Microbiology and Infection. 2.Brown, J. R., Bharucha, T., & Breuer, J. (2018). Encephalitis diagnosis using metagenomics: application of next generation sequencing for undiagnosed cases. Journal of Infection.,科研大项目：国家微生物组计划,临床诊断：FDA 感染病NGS诊断指南,2016年5月美国行动计划,科研项目：百万微生物基因组计划,二代测序病原快检PMseqTM,2014年 华大基因开展研究,-,高通量测序技术首次被写入呼吸相关指南,2019,-,27,小结,感染病原学诊断方法种类多，各有利弊，精准抗感染治疗的前提是找到致病微生物 培养的结果尚需甄别，如假阴性、假阳性、污染、定植、感染；培养结果并非唯一或最终结果 联合检测，优势互补，提高检测的敏感性和特异性 新型监测手段如mNGS检测病原微生物可以作为临床的一个补充，虽费用高，但用时短，且可以一网打尽，病情复杂、诊断困难