免疫实验室基础常识.ppt

2019/4/23,1,免疫实验室基础常识,免疫学检测方法的简介基本原理 免疫学检测方法的应用 抗原、抗体的定义 免疫室检测的项目 感染性疾病检查项目 细胞、体液免疫检查项目 肿瘤标志物电化学发光检测项目 自身免疫性疾病检查项目,2019/4/23,2,免疫学检测方法的简介,方法 原理 免疫间接凝集方法 RBC、乳胶颗粒+Ag 免疫 沉淀反应方法 琼脂板+Ab 酶免疫分析技术（EIA） HRP+Ag或Ab 放射免疫方法（RIA） I*125+Ag或Ab 免疫光散射比浊分析 Ag+Ab=CIC、微粒+Ag 免疫胶体金检测方法 胶体金+抗人IgG 免疫荧光显微镜方法 FITC+抗人IgG 化学发光免疫分析技术 ABEL+抗CEA 电化学发光免疫分析技术Ru（bpy）3* +抗AFP,2019/4/23,3,免疫学检测常用的基本技术,凝集方法 MP-IgM、TPPA、Widal、Weil-F ASO、RF、CRP、冷凝集实验等 沉淀方法 IgG、A、M、C3、C4、CRP、等 酶联方法 病毒抗体IgG、IgM及蛋白抗原 放射方法 肿瘤标志物等 光散射比浊方法 Ig、ASO、RF、微量蛋白 胶体金方法 TB-Ab、HBsAg、HCG、LP-IgM 荧光显微方法 自身抗体、呼吸道V-IgM等 化学发光技术 肿瘤标志、甲状腺功能、 电化学发光技术 肝炎标志、性腺分析等,2019/4/23,4,免疫学检测常用的基本技术,现代常用的免疫方法 酶免疫分析、荧光免疫分析、光散射比浊分析、化学发光技术、电化学发光免疫分析技术、仪器方法。还有凝集、沉淀、金标记等方法。性激素、细胞因子、肿瘤标志、免疫球蛋白等，都为标准曲线定量方法。以上检测都可视为抗原抗体反应的方法。抗原抗体的内容、免疫的基本概念还需复习一下，以便更充分了解免疫实验检测的基本原理。,2019/4/23,5,抗原与抗体,一. 抗原、抗体的定义1 1. 抗原的定义 (1) 凡是能够刺激机体免疫系统产生抗体的免疫物质、并能在体内外与抗体发生特异性结合反应的物质称为抗原。 (2)抗原指能与T细胞的TCR何B细胞的BCR结合，促使其增殖、分化、产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与之结合，发挥免疫效应的物质。 （3）抗原两个特性：免疫原性、抗原性。 2. 医学上重要的抗原2 a. 病原微生物：细菌、病毒、立克次氏体。(表面抗原、核心抗原、鞭毛抗原等),2019/4/23,6,抗原与抗体,a. 自身抗原： 一般自身组织对机体自身没有抗原性，但在外伤、感染、电离辐射、药物等影响下可以发生变性成为自身抗原，刺激机体产生免疫反应引起自身免疫性疾病，ANA.dsDNA等。 a.肿瘤抗原：如AFP、CEA、PSA等。 b.同种异体抗原：红细胞血型抗原、白细胞抗原（人类白细胞抗原又称HLA）等等。 2 抗体的定义： （1） 抗体是机体在抗原物质刺激下所形成的一类具有与抗原发生特异性结合反应的球蛋白。,2019/4/23,7,（2）抗体是介导体液免疫的重要分子，是指B细胞识别抗原后增殖分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中。能与抗原特异性结合，具有免疫功能。 （3）,2019/4/23,8,抗原与抗体,l 抗体产生的一般规律 抗原刺激机体后可产生免疫球胆白G、A、M。一般2-3周后才有抗体产生，其出现顺序；IgM最早,但消失也快,在血液中只维持数周至数月。（所以临床检测IgM抗体利于早期诊断）IgG出现稍迟于IgM，当IgM接近消失时，IgG达高峰阶段，它在血液维持时间较长可达数年之久。IgA继IgM和IgG后出现。,2019/4/23,9,抗体的基本内容,用电泳的方法可将血清或血浆蛋白分离成白蛋白和球蛋白两个组分。大多数抗体位于r球蛋白区域内。抗体的另一个常用名为免疫球蛋白（Ig），意为r球蛋白中与免疫相关的组分。 抗体在血液中检出，但它在其他部位存在；细胞质内质网和高尔基体的膜和B淋巴细胞膜上、NK细胞和肥大细胞的细胞膜上、组织液和血浆中、还在乳汁和分泌液中。 抗体分类；IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。 IgG亚类IgG1-4、IgA亚类1-2,2019/4/23,10,抗体的基本内容,抗体的功能 对有害因子，如毒素、药物、病毒、细菌、和其它寄生虫可通过与特出细胞受体结合而造成机体的损害，而分泌抗体可通过与其结合了阻止与响应受体结合，起到了中和作用。 IgG的调理作用促进吞噬细胞对抗原的吞噬。 IgG、IgE和IgM介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用。（NC、MC、NK细胞） IgE所介导的超敏反应 IgA介导的粘膜免疫 母体的IgG介导的新生儿免疫,2019/4/23,11,应用抗原抗体结合原理检测的项目,感染性疾病检测项目 肝炎病毒筛查：A、B、C、D、E、G、TTV、CMV 呼吸道病原体筛查：EB、AD、CB、RSV、MP、CP 感染性疾病检查项目：Uu、CT、NG、USR.TPPA、HIV 自身免疫性疾病项目 免疫全项 ：ANA、ds-DNA、AMA、ANCA、ENA、Ig.C3、C4、CRP、ASO、RF、CIC 肝病自身抗体 ：ANA、ds-DNA、SMA、AMA、LKM、SLA可溶性 肝抗原、LC1抗肝溶质型抗原 自身抗体 ：ANA、ds-DNA、AMA、ANCA、ENA 肾病自身抗体：ANA,ds-DNA,GBM,ANCN.ENA 糖尿病自身抗体 ：IAA、ICA、GAD,2019/4/23,12,应用抗原抗体结合原理检测的项目,电化学发光定量分析仪检查项目 参考值 AFP 肝 15.0 ng / ml CEA 结肠、胃、乳腺 3.40 ng / ml PSA / fPSA 前列腺 PSA 4.0 ng / ml CA15-3 乳腺 25.0 U / ml CA125 卵巢 35.0 U/ ml CA19-9 胰腺、胆囊 27.0U / ml CA724 胃、卵巢 6.9U / ml NSE 小细胞肺Ca 12.5 / ml CYFRA2 非小细胞肺Ca 3.3ng / ml,2019/4/23,13,应用抗原抗体结合原理检测的项目,性激素6项 参考值 黄体生成素 （LH） 青春期、成年期 卵泡激素 （FSH） 、 、 泌乳素 （PRL） 3.4-24.1 ng / ml 雌二醇 （E2）卵泡期、黄体期、绝经期 孕酮 （PRO）、 、 、 睾酮 （T） 0.06-0.82 ng / ml 糖尿病项目 胰岛素 C 肽,2019/4/23,14,免疫指标与临床疾病,.HBsAg： 急、慢性乙肝无症状携带者 2.HBsAb： 疫苗接种后、既往感染后，有免疫力。 3.HbeAg： 病毒复制，传染性强。 re-S1 ： 病毒复制，传染性强。 4.HBeAb： 病毒复制降低或消失，传染性很弱。 5.HbcAb： 乙肝感染后产生，持续性强，可终生不消失。 6.HbcIgM：乙肝感染早期，为早期诊断标志。 7.HAVAbIgM：急性甲肝，2个月后阳性消失。 8.HCV-Ab： 感染过丙肝，阳性可持续 1年以上。 9.HDV-Ab： 感染过丁肝，一般在乙肝感染后出现。 10.HEV-IgM：戊肝感染的早期。 11.HGV-Ab： 感染过庚肝。 12.CMV-IgM：感染CMV，偶发可引起肝细胞炎症。 13.TTV-Ab ：感染TTV而引起的肝细胞炎症。,2019/4/23,15,免疫指标与临床疾病,乙型肝炎标志物模式分析及临床意义 临床诊断、免役接种、临床分期、传染判断、母婴检查等 常见乙肝的8种模式： sAg sAb eAg eAb cAb 临床意义 HBV感染，急、慢性乙肝，传染性强 急、慢性乙肝，传染性弱，或携带者 急慢性乙肝，或携带者。查HBV-DNA 既往感染过乙肝病毒，有免疫力 既往感染，乙肝恢复期，有免疫力 接种乙肝疫苗后，HBV感染后的恢复 既往感染，乙肝恢复期基本无传染 既往感染，排除检查HBV-DNA,2019/4/23,16,免疫指标与临床疾病,不常见乙肝的6种模 sAg sAb eAg eAb cAb 临床意义 早期HBV感染.慢性携带传染性强 急性HBV，趋向恢复，慢性肝炎 不同亚型HBV二次感染，感染早期 同上 非典型性急性感染 同上 + + + + + 不同亚型HBV二次感染Ag-Ab转换期,2019/4/23,17,免疫指标与临床疾病,呼吸道病菌抗体IgM检测的临床意义 呼吸道病毒并非分类上的名称，而是习惯上指由呼吸道传播并能引起呼吸道感染的病毒总称。 1 MP-IgM(肺炎支原体抗体IgM) MP通过呼吸道传播引起原发性非典型肺炎（肺炎病历10-20%），可并发鼻窦炎、皮炎、心包炎、心肌炎等，检出MP-IgM阳性可判断进期有的感染。 2 CP-IgM(肺炎衣支体抗体IgM) CP是一类介于细菌和病毒之间的微生物，传播途径主要是呼吸道，可引起肺炎有时还侵犯心脏、心包、脑膜、肝脏等部位，检出CP-IgM阳性可判断进期有CP的感染。,2019/4/23,18,免疫指标与临床疾病,3 EBV-IgM(EB病毒抗体IgM) EBV是传染性单核细胞增多症的病原体，主要通过唾液传播，EBV对儿童及青少年易感，阳性见于儿童期扁桃体炎和炎颊炎偶发的病历，EBV偶发波及中枢神经系统和肝炎，EBV与非洲儿童恶性淋巴瘤和鼻烟癌密切相关。 4 CBV-IgM(柯萨奇病毒抗体IgM) CBV可经口或呼吸道侵入人体，在局部繁殖，通过病毒血症扩散，除局部症状外可产生一系列综合症，如感冒、急性心肌炎、心包炎、无菌性脑膜炎、疱疹性咽炎、皮炎、肝炎等疾病。,2019/4/23,19,免疫指标与临床疾病,5 ADV-IgM(腺病毒抗体IgM) ADV从脾体细胞分离而得名，能引起呼吸道和眼部的疾患，急性病为发热、咽炎、咳漱，常有角、结膜炎、鼻炎、气管炎、非典型肺炎等，并伴有全身症状，检出ADV-IgM阳性可判断进期有ADV的感染。 6 RSV-IgM(合胞病毒抗体IgM) RSV是引起婴幼儿下呼吸道感染的病原体，也是肺炎和支气管炎的病因，成年多表现发热性感冒，老年人可使气管炎和肺气肿加重，检出RSV -IgM阳性可判断进期有RSV 的感染。,2019/4/23,20,应用抗原抗体结合原理检测的项目,7 冷凝集素实验 冷凝集素本质是IgM，正常人血清中可含少量，1%的人.1：32以上，60%的肺炎支原体肺炎病人病后2周可达1：32-64或更多，某些疾病如传单增多症、重症贫血、雷诺氏症、肝硬化等亦可呈阳性。 8. 肥达（Widal）氏凝集实验 伤寒和副伤寒是由伤寒沙门氏菌及甲、乙、丙3种副伤寒沙门氏菌所致的肠道传染病。“O”菌体”H”鞭毛抗原菌液检查血清中的抗体。 参考值 ：“O” 、甲、乙、丙 1：40 ”H” 、 1：80 诊断肠道传染病,2019/4/23,21,应用抗原抗体结合原理检测的项目,外裴氏（Weil-Felix）反应 变形杆菌OX19与斑疹伤寒病原体有共同抗原 变形杆菌OXk与恙虫病病原体有共同抗原 变形杆菌OX2与落矶山斑疹热病原体有共同抗原 诊断与鉴别诊断立克次氏体病（高热等一系列症状） 感染性疾病检查项目：Uu、CT、NG、USR、TPHA、HIV,2019/4/23,22,抗链球溶血素O (ASO),A群溶血性链球菌的代谢产物刺激机体产生的抗体。 ASO升高见于A群溶血性链球菌感染及感染后免疫反应所致的疾病，如：感染性心内膜炎、扁桃体炎、风湿热、链球菌感染后急性肾小球肾炎。ASO在溶血性链球菌感染后一周开始升高，46周达高峰，并持续数月，故ASO增高提示曾有溶血性链球菌感染，但不一定是近期感染。链球菌感染后ASO动态升高，结合CRP升高及血沉阳性，有利于风湿热的诊断。 高胆固醇血症、巨球蛋白血症、多发行骨髓瘤患者，ASO也可升高。,2019/4/23,23,类风湿因子 (RF),RF是一种以变性IgG为靶抗原的自身抗体，RF可分为IgM、IgG、IgA、IgE四型。类风湿性关节炎（RA）患者的阳性率为7080，其中尤其以病变广泛、病情严重、病程长、活动期及有关节外病变者的阳性率高、滴度高并长久存在。 除类风湿外，还见于正常人和其他疾病，例如正常人，尤其老年人，阳性率占；各种感染性疾病如乙肝、结核病、亚急性细菌性心内膜炎和慢性支气管炎等；结缔组织病如红斑狼疮、干燥综合征、皮肌炎、血管炎、硬皮病、预防接种后以及某些恶性疾病。在这些疾病中，的阳性率可达。因此，在RA的诊断上，一般认为RF只有参考价值而无特异性诊断价值。,2019/4/23,24,C反应蛋白 (CRP),是一种由肝细胞合成的急性时相反应蛋白，是在炎症和组织坏死疾病的急性期出现于病人血清中的一种糖蛋白，它能与肺炎双球菌的荚膜成分C-多糖蛋白质起反应，故称为C-反应蛋白。具有激活补体和促进粒细胞及巨噬细胞吞噬作用。 正常值为：800-8000g/L。 CRP是急性时相反应的一个极为灵敏的指标，血浆中CRP浓度在急性心肌梗死、创伤、感染、炎症、外科手术、肿癌浸润时迅速显著地增高，可达正常水平的2000倍。结合临床病史，有助于随访病程。 特别在炎症过程中，CRP可作为风湿病、系统性红斑狼疮、白血病等的随访指标。 细菌和病毒感染鉴别，细菌感染急性期一般均增高，病毒感染多数不变。 国外有研究认为，CRP是引发心脏病的最强烈的危险因素，其危险程度是血液中过量胆固醇的2倍。CRP含量高的人患高血压的危险率比胆固醇高的人大1倍。如果炎症和过高的胆固醇同时出现的话，那么患心脏病和中风的危险率比正常的人要高出9倍。由此可见，CRP含量高和患心脏病呈正相关。 此外，最近一项研究发现，血中高浓度的CRP是结肠癌发病的危险因素，并认为CRP可能是结肠癌的一个早期标志物。,2019/4/23,25,免疫球蛋白及亚类,其浓度在不同年龄段有所差异，在某些疾病情况下，这些指标的浓度将出现升高或降低，从而具有疾病诊断价值。 IgG：正常情况下，脐血7.617gL， 新生儿7.014.8gL， 0.56月310.0gL ，6月2岁512gL ，26岁513gL， 612岁716.5gL ，1216岁715.5gL ，成人616gL。 在慢性肝病，亚急性或慢性感染，结缔组织疾病，骨髓瘤，无症状性单克隆病等，出现增高；在遗传性或获得性抗体缺乏症，混合性免疫缺陷综合症，选择性缺乏症，蛋白丢失性肠病，肾病综合症，强直性肌营养不良，免疫抑制剂治疗等降低。,2019/4/23,26,免疫球蛋白及亚类,IgA：正常情况下，脐血050mgL，新生儿022mgL，0.56月3820mgL，7月2岁1401080mgL，26岁2301900mgL，612岁2902700mgL，1216岁8102320mgL，成人7603900mgL。 在慢性肝病，亚急性或慢性感染性疾病（如结核、真菌感染等），自身免疫性疾病（如、类风湿性关节炎），囊性纤维化，家族性嗜中性粒细胞减少症，乳腺癌，肾病，骨髓瘤等情况下增高；在遗传性或获得性抗体缺乏症，免疫缺陷病，选择性缺乏症，无球蛋白血症，蛋白丢失性肠病，烧伤等。抗抗体现象，免疫抑制剂治疗，妊娠后期等情况下降低。,2019/4/23,27,免疫球蛋白及亚类,IgM：正常情况下，脐血40240mgL，新生儿50300mgL，0.56月1501090mgL，6月2岁4302390mgL，26岁5001990mgL，612岁5002600mgL，1216岁4502400mgL，成人4003450mgL。 在胎儿宫内感染，新生儿症群，慢性或亚急性感染，疟疾，传染性单核细胞增多症，支原体肺炎，肝病，结缔组织疾病，巨球蛋白血症，无症状性单克隆病等情况下增高。在遗传性或获得性抗体缺乏症，混合性免疫缺陷综合症，选择性缺乏症，蛋白丢失性肠病，烧伤，抗抗体综合症（混合性冷球蛋白血症），免疫抑制剂治疗等情况下降低。,2019/4/23,28,IgG和IgA亚类,IgG有四种不同的亚类，IgA有两种不同的亚类。每种亚类具有不同的功能，其含量过低或过高或者缺陷会导致相应的免疫功能低下，造成相应的疾病的发生。 儿童常见的反复呼吸道感染、经常腹泻、发育迟缓等症状以及经常发生的许多呼吸道疾病如中耳炎、鼻窦炎、肺炎、气管炎、慢性阻塞性肺疾病、支气管扩张以及哮喘等疾病，往往都与IgG或IgA亚类缺陷有关。,2019/4/23,29,补体C3和C4,正常情况下，C3(1C-球蛋白) 8001550mgL，C4(1E-球蛋白) 130370mgL，血液补体含量与活度在许多病理情况下都会发生变化。所以，临床上应动态观察补体水平的变化。 补体含量下降并不一定代表免疫功能障碍或免疫缺陷，因为在缺血、凝固性坏死和中毒性坏死时，组织能释放较多的蛋白分解酶，导致补体溶血活度和补体组分的下降。 血补体浓度升高：见于各种炎症性疾病及阻塞性黄疸，急性心肌梗塞，溃疡性结肠炎，糖尿病，急性痛风，急性和急性甲状腺炎，急性风湿热，皮肌炎，多发性肌炎，混合性结缔组织病，结节性动脉周围炎等。,2019/4/23,30,一 肿瘤标志物的简介,（一）肿瘤标志物概念,2019/4/23,31,所谓肿瘤标志物(tumormarker，TM)， 是指由肿瘤组织产生的存在于肿瘤组织本身， 或分泌至血液或其他体液， 或因肿瘤组织刺激， 由宿主细胞产生而含量明显高于正常参考值的一类物质。,2019/4/23,32,（二）肿瘤标志物的分类,肿瘤胚胎性抗原标志物 该类蛋白质即癌变时因返祖现象的出现，而产生的肿瘤标志物。 例：甲胎蛋白(AFP） 癌胚抗原(CEA) 糖类抗原标志物 该类物质是肿瘤细胞表面的抗原物质，或肿瘤细胞所分泌的物质。该类标志物又可分为两类 1，糖类高分子粘蛋白抗原 例：癌抗原CA125癌抗原CAl5-3,2019/4/23,33,2，血型类抗原 例：癌抗原CAl9-9、癌抗原CA50 酶类标志物 例： 前列腺特异性抗原(prostatespecificantigen，PSA) 神经原特异性烯醇化酶 (neuronspecificenolase，NSE) 激素类标志物 例： 人绒毛膜促性腺激素 (humanchorionicgonagotropin，HCG) 人胎盘催乳素 (PL),2019/4/23,34,其它蛋白质类标志物 例：2-微球蛋白(2-microglobulin， 2-MG) 血清铁蛋白(SerumFerritin，SF),2019/4/23,35,（三）肿瘤标志物 的临床应用,1.甲胎蛋白（AFP） 原发性肝癌的诊断 急慢性肝炎和肝硬化的鉴别诊断 先天性胎儿畸形诊断 恶性畸胎瘤的诊断,2019/4/23,36,2 .癌胚抗原(CEA) 胃肠道等空腔脏器肿瘤诊断。 肺癌、乳腺癌、卵巢癌也升高，大多显示为肿瘤浸润，70%为转移性癌。 肿瘤手术评价。 动态监测提示肿瘤预后。 连续随访监测肿瘤复发。,2019/4/23,37,3. 糖类抗原19-9（CA19-9） CA19-9是肿瘤细胞膜上的糖脂质，因由鼠与骨髓瘤杂交制备的116NS19-9单克隆抗体识别而命名，是一种异质性的高分子量粘糖蛋白。在消化道腺癌中明显升高，又称胃肠癌抗原。 胰腺癌、胆管细胞癌、肝细胞癌、胃癌、结直肠癌的诊断。 术前水平与预后有关。 监测病情的进展、复发和转移。 急性胰腺炎、胆汁淤积性胆管炎、急性肝炎、肝硬化短暂的升高。,2019/4/23,38,4. 糖类抗原50（CA50） CA50是由单抗C-50识别的一种糖类抗原，其抗原决定簇存在于糖脂和高分子糖蛋白中。 胰腺癌、胆囊癌、肝癌、结直肠癌的诊断。 卵巢癌、子宫癌的诊断。 监测病情的进展、复发和转移。,2019/4/23,39,5. 糖类抗原242（CA242） CA242是由单抗C-242识别的一种糖类抗原。 胰腺癌、胆道癌、胃癌、结直肠癌可增高。,2019/4/23,40,6.糖类抗原125 （CA125） CA125因从人卵巢浆液囊泡腺癌抗原可被单克隆抗体OC125识别而命名，是一种卵巢癌相关抗原。 卵巢癌的早期筛查，比临床诊断至少提前一年。 连续监测鉴别肿瘤良性还是恶性生长。 判断病理类型及临床分期：浆液性卵巢上皮癌阳性率89%，粘液性癌16%，卵巢内胚窦瘤不升高。 疗效评价，动态监测复发、转移。 妊娠头3个月、月经期、子宫内膜炎可升高，注意鉴别。,2019/4/23,41,7. 糖类抗原15-3（CA15-3） 用人乳脂球上分离的糖蛋白MAM-6和肝转移的乳腺癌细胞免疫小鼠，制成针对相应抗原的单克隆抗体：115-D8和DF-3，这两株抗体识别的抗原是上皮细胞上的一种粘蛋白MUC-1的唾液酸糖抗原，该抗原命名为CA15-3。 乳腺癌诊断，期水平正常，、期升高。 术前水平与预后相关。 治疗后动态监测提示体内残余肿瘤或肿瘤转移、复发。 慢性肝炎、结核、自身免疫病可轻度升高。,2019/4/23,42,8.人绒毛膜促性腺激素（HCG） 是由胎盘的滋养层细胞分泌的一种糖蛋白激素。 正常妊娠检测。 检测异位妊娠。 正确指导人工流产。 检测亚临床自然流产。 葡萄胎、绒癌的诊断及动态监测治疗和预后。,2019/4/23,43,9. 神经原特异烯醇化酶（NSE） 在神经组织中发现的高酸蛋白，仅存在于神经组织中。 肺小细胞性肺癌（SCLC）的诊断，SCLC患者阳性率70%，其他组织型肺癌仅10-20%。 神经母细胞瘤、神经内分泌瘤血NSE升高。 脑组织机械性损伤时，脑脊液NSE升高，升高幅度与速度与损伤程度及部位密切相关。 部分脑梗塞、一过性脑缺血病人脑脊液NSE升高。,2019/4/23,44,10.细胞角蛋白19片段（Cyfra21-1） 鳞癌型肺癌病人血中明显升高（50-701%）。 结肠癌、胃癌仅轻度升高。 非肿瘤性疾病一般不升高。,2