手足口病的病原学及其诊断(国家疾病预防控制中心.ppt

手足口病的病原学及其诊断,许文波 中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所 国家麻疹/脊灰实验室 2009-03-30,“阜阳13例不明原因肺炎死亡病例”,病例高度散发 不具有传染性，可能为感染性疾病 没有疹子或疹子不典型 以“重症肺炎”为主要临床表现 病情进展迅速，大部分入院几小时-2天死亡 病因不明 EV71感染中枢 神经系统引起的 心肺衰竭,“疫情概况”,阜阳死亡病原学鉴定,4月18，中国CDC组织专家组,流行病学,临床资料,实验室检测,EV71是此次疾病的主要致病原,证实4月23日,分析判定病原和实验室检测方向为=HEV71,手足口病 第38种需上报的传染性疾病,2008.05.02,手足口病皮疹分布 1. 颊粘膜和手指; 2. 手掌 3. 足底 4. 唇粘膜 5.咽峡炎,1,2,3,4,5,2008年中国大陆手足口病报告人数,总共报告489073例病例，发病率为37.01/100,000 严重病例1165例 ，占报告病例数的 0.24 % 死亡126例，死亡率为0.0095/100,000，死亡病例占总病例 0.26,传染病疫情网络数据库统计分析,人肠道病毒简介和分类,小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）的成员，主要在肠道内复制, 但可感染各个系统和器官。 单正链的无包膜RNA病毒，RNA有感染性。 小球形病毒（ 30 nm）， 20面体对称结构。 衣壳有VP1-VP4四种蛋白，VP1-VP3分布在表面，VP4与内部RNA结合。 与鼻病毒不同的是，它们在酸性环境中稳定。 在胞浆增殖，有明显CPE，破胞释放。 引起多种疾病：麻痹性疾病、无菌性脑膜炎、心肌损伤、手足口病，结膜炎，皮疹等。,Courtesy of Linda M. Stannard, University of Cape Town, S.A.h,30nm 二十面体对称 无包膜,人肠道病毒的毒粒结构,脊髓灰质炎病毒：通过将标本接种至猴子体内，1909年首次鉴定出该病毒，1949年，利用细胞培养的方法增殖病毒，为疫苗的研制奠定了基础。 柯萨奇病毒：1948年在美国纽约Coxsackie镇，将两名麻痹患儿的标本接种至乳鼠体内，分离出来的一组病毒定名为柯萨奇病毒。根据它们在乳鼠上产生的组织病理学变化和在细胞培养上的能力，分为柯萨奇病毒A组和B组。 埃可病毒：1951年在一名无症状的儿童的粪便标本中分离到，在细胞培养上可以造成致细胞病变，但对乳鼠和灵长类动物不致病。 新肠道病毒：后来，新发现的病毒被按照序号命名（6971），最近，已经命名至102型,人肠道病毒发现的历史,人肠道病毒传播方式, 粪-口途径传播: 唾液与粪便 呼吸道传播: 空气飞沫 接触传 播:,环境因素影响经水传播的病原体,针对 脊灰病毒、NPEV、 轮状病毒、诺如病毒，甲肝,手足口病（hand-foot-mouth disease，HFMD）,为全球性传染病，世界大部分地区均有流行的报道。 1957年在加拿大首次报告，新西兰Seddon于1957年最早加以描述，1958年加拿大Robinson从患者粪便和咽拭中分离出CoxA16，同时患者血清抗体有四倍增长,初步查明CoxA16为本病病原； 1959年提出HFMD命名，HFMD在全球广泛流行，无明显的地域分布。 之后世界各地均经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒和EV 71引起的手足口病流行。 发热, 不适, 咽喉肿痛, 口腔、手、脚侧面及掌心、屁股出现小泡 传染性极高 病程约1周,HFMD的病原,手足口病可由多种肠道病毒所引起，其中包括 CoxA5,A10, A16, A19, EV71,以及部分埃可病毒和柯萨 奇B组病毒, 以CoxA16 和 EV71最为常见 传播途径: 粪-口途径传播: 唾液与粪便; 呼吸道传播: 空气飞沫; 接触传播 疱疹液中含大量病毒，疱疹破溃后病毒排出。 HFMD为全球性传染病，在全球广泛分布，无明显的地域分布, 但 近年EV71在东南亚一带流行, 引起较多的重症和死亡病例。 在80年代和90年代，中国手足口病的流行主要以 CoxA16为主，2008年，CoxA16 和EV71 共循环引起手 足口病爆发, EV71在大部分省市为优势病毒。,肠道病毒CoxA16,1957年在加拿大首次报告HFMD，新西兰Seddon于1957年最早加以描述，1958年加拿大Robinson从患者粪便和咽拭中分离出CoxA16，同时患者血清抗体有四倍增长,初步查明CoxA16为本病病原； 1959年提出HFMD命名，之后世界各地均经常发生由各型柯萨奇、埃可病毒等引起的手足口病,属于小RNA病毒科，肠道病毒属，A组肠道病毒。 1972年EV71在美国被首次确认，1974年Schmidt等首次发表从美国加利福尼亚州20例具有中枢神经系统症状患者（19691973年）中分离到EV71。 随后，世界上众多国家都有EV71流行的报道。 EV71感染可引起HFMD、疱疹性咽峡炎、无菌性脑炎、脑膜炎和脊髓灰质炎样麻痹，但更多情况下是产生隐性感染。同脊灰病毒相似，EV71对脊髓前角细胞具有一定的组织嗜性，是最常见的引起急性迟缓性麻痹（acute flaccid paralysis，AFP）的非脊灰肠道病毒（non-polio enterovirus，NPEV）,EV71潜伏期一般为37天。 感染EV71后，患者发病12周内可自咽部排出病毒，从粪便中排毒可持续至发病后35周。 疱疹液中含大量病毒，疱疹破溃后病毒排出。,肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）,虽然EV71最初分离于具神经系统症状患者，曾在澳大利亚、欧洲、亚洲和美国引起严重神经系统疾病，而近年来，EV71则多与HFMD的暴发相关，并在暴发中引起患者神经系统症状，甚至死亡。 1975年保加利亚44个婴幼儿死于HFMD 20世纪90年代后期，EV 71开始肆虐东亚地区。1997年马来西亚发生了主要由EV 71引起的手足口病流行，48月共有2628例发病，仅46月就有29例病人死亡，死者平均年龄1.5岁。 1998年我国台湾省发生EV 71引起的手足口病和疱疹性咽峡炎暴发流行，在6月和10月两波流行中，共监测到129106例，重症病人405例，死亡78例，死亡病例大多为5岁以下的儿童，并发症包括脑炎、无菌性脑膜炎、肺水肿或肺出血、急性迟缓性麻痹和心肌炎等。,人肠道病毒感染的一般致病机制,隐性感染多见，很少引起腹泻，婴幼儿、免疫力低下的成人易感。 病毒在机体肠道中增殖，很少引起肠道症状，是以消化道为原发灶的全身感染。 不同人肠道病毒可引起相同症状，同一种人肠道病毒可引起不同临床表现。 感染过程中形成病毒血症。,致病特点,中国HFMD的流行,1981年，我国在上海首次报道了HFMD病例 1987年在中国分离到CVA16 1995年以来，我国陆续在武汉、深圳、上海、重庆、山东和安徽等地的HFMD患者中分离到EV71病毒。 2007年，山东发生了手足口病爆发流行，累计报告HFMD病例39，606例，其中14例病例死亡。实验室检测发现EV71是引起山东临沂HFMD的主要病原，同时还检测到Echo3 和/或 CVA16。 2008年全国出现HFMD爆发流行,以HEV71为优势,CVA16还有其它EV共循环引起,EV71毒株各个基因型/亚型流行的地理和年代分布,（一）粪便标本 采集病人发病7日内的粪便标本，用于病原检测。粪便标本采集量58g/份，采集后立即放入无菌采便管内，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。 （二）脑脊液标本 出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标本，进行病原和抗体检测。采集时间为出现神经系统症状后3日内，采集量为1.02.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。 （三）血清标本 采集急性期(发病05天)和恢复期(发病1430天)双份配对血清用于抗体检测。检测IgM时，采集 (发病720天)血。静脉采集35ml全血，置于真空无菌采血管中，自凝后，分离血清，将血清置于20以下冰箱中冷冻保存。,标本采集种类、运输和保藏-HFMD,（四）咽拭子标本 采集病人发病3日内的咽拭子标本，用于病原检测。用专用采样棉签，适度用力拭抹咽后壁和两侧扁桃体部位，应避免触及舌部；迅速将棉签放入装有35ml保存液（细胞维持液）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封，4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。 （五）疱疹液 可同时采集多个疱疹作为一份标本，用消毒针将疱疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有35ml保存液（维持液或生理盐水）的采样管中，在靠近顶端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4暂存立即(12h内)送达实验室，20以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于70冰箱。,手足口病病例标本采集要求,备注：（1）采集新发或新入院病人的相关标本；（2）样品采集时，如果标本需分装或分地检测，注意适当增加单份样品采集量；（3）采样时，做好样品登记工作，详细记录病人姓名、性别、年龄、发病时间、出疹时间，采样时间、主要临床表现、是否用药等信息，并注意和个案调查资料相匹配。,用于病毒分离的标本包括粪便、咽拭子和疱疹液 如果患者出现神经系统症状，应该采集脑脊液标本。 在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液或脑脊液中分 离病毒具有很高的诊断价值。 用于采集咽拭子的无菌拭子要放在适当的保存液中， 如维持液或生理盐水，以防干燥。 为了保证检测结果的准确性和有效性，标本应在病例 发病后尽早采集，尽快检测。 不能立即检测的标本应冷冻保存。 对于血清学诊断，急性期血清应该在发病后尽早采 集，恢复期血清在发病2-4周后采集。,标本采集注意事项,加强HFMD病原检测和监测的十分必要,依据台湾1998-2008和中国大陆2007-2008年的经验 掌握手足口病病原谱，特别是EV71感染所占的比例，对分析 判断HFMD疫情导致重症和死亡的比例有重要的科学参考价值。,1998年台湾手足口病暴发疫情中，在48.7%轻症病例中、75住院 病例中、92死亡病例中均分离到HEV71。 2. 2007年山东临沂发生了手足口病暴发，有8例死亡病例，手足口病的病原谱构成中，HEV71约占84%，CVA16约占16%；2008年当地手足口病病例数仍较高，但病原谱发生较大的变化，病毒毒株是以CVA16为主（占62）,并且没有重症死亡病例。 3. 2008年阜阳HEV71手足口病99 以上有是,手足口病的病原构成比例 (实验室EMAIL统计),严重病例： EV71 占 实验室确诊的严重病例的81.59,死亡病例： EV71 占 实验室确诊的死亡病例的96.43,手足口病的诊断一般是通过采集适当的临床标本后进行基因检测、抗原检测、血清学抗体检测、病毒分离和病毒鉴定，如果没有采到合格的临床标本，或无法进行实验室检测。 很多血清型的肠道病毒能引起手足口病，不同细胞系对不同病毒的敏感性是有所不同的，而不同时期肠道病毒的流行株也不同。 通常用于肠道病毒分离的细胞系为RD、HEp-2、Vero等，联合使用上述的两种或更多细胞有助于分离到更多的肠道病毒。,手足口病的实验室检测,病毒实验室检测类型-病毒实验室诊断方法,检测抗体/抗原,检测病毒,检测核酸,ELISA/HI/PA,蛋白印迹,免疫荧光,病毒分离,ELISA,中和试验,电镜,基因芯片,中和试验,RT-PCR,实时荧光定量PCR,套式PCR,LAMP,免疫荧光,基因芯片,每种方法 各有优势, 依据病毒 来定检测策略,New molecular tools for epidemiology studies and diagnosis,手足口病的实验室检测流程见下图：,实验室诊断原则,人肠道病毒在自然界广泛存在且种类繁多，一病多原、一原多症是肠道病毒感染的重要特征。因而应对血清诊断及病原诊断的实验室结果作严格评价，必须结合临床症状及环境因素流行病学分析，以确立病毒与疾病的病原学关系。 一般采取的原则为： （1）病毒分离阳性率远高于对照人群； （2）病程中有特异性抗体变化并排除其他病毒感染； （3）从病变组织中分离出病毒或检测到病毒核酸。,病毒疾病常出现的阴性结果分析, 病毒培养： - 标本采集时间太迟 - 标本采集部位错误 - 标本采集技术不过关 - 标本保存不好 - 病毒培养细胞株选择错误 - 实验室质量控制 - 其他, 血清抗体： - 血清标本采集时间不对 - 非特异性抑制物质干扰 - 抗体反应微弱：抗原变异 - 病毒或病毒株选择错误 - 检测方法错误 - 实验室质量控制： - 其他,造成人肠道病毒感染与流行的因素,宿主因素：营养、卫生、抵抗力 病毒的种类 侵入易感个体的人肠道病毒量 病毒的毒性强弱 整个族群里含有抗体的个体（群体免疫） 少数研究：特定HLA基因较易出现肢体麻痹症候群 有些研究：新生儿与婴儿易遭受严重的柯萨奇B型 、 ECHO和EV71病毒感染,人肠道病毒感染后的病程,人肠道病毒病例死亡时间,死 亡 机 率,心衰竭,早期死亡,14,28,天,神经系统损伤,脑死亡