湖南农业大学基因工程重点更具老师整理.doc

1909年，丹麦生物学家，创造了基因(gene)一词1944年，美国著名微生物学家O.T. Avery证明了基因的物质基础是DNA 1953年，J. Watson和F. Crick的DNA双螺旋结构模型, 揭示了DNA的分子结构. 特别是DNA半保留复制规律。DNA的半保留复制复制子：由复制起点开始合成的一段DNA序列。复制起点：在大肠杆菌中其复制起点由245个碱基对组成，由两段保守的重复序列组成。1958年，F. Crick提出了描述DNA、RNA和蛋白质三者关系的所谓中心法则(central dogma) 5.基因的表达与调控（操纵子学说）基因依其功能差别可以分成调节基因、操纵基因和结构基因三大类。一、基因工程的概念是指按照人们的科研或生产需要，在分子水平上，用人工方法提取或合成不同生物的遗传物质（DNA片段），在体外切割、拼接形成重组DNA，然后将重组DNA与载体的遗传物质重新组合，再将其引入到没有该DNA的受体细胞，进行复制和表达，生产出符合人类需要的产品或创造出新性状，并能稳定地遗传给下一代。供体、受体和载体称为基因工程的三大要素。技术上的三大发明：DNA分子的体外切割与连接技术、基因工程载体的使用、DNA分子的核苷酸序列分析技术、琼脂糖凝胶电泳和Southern转移杂交等技术基因工程的主要研究内容或步骤分、从复杂的生物有机体基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段。切、在体外，用限制性内切核酸酶切割目的基因和基因载体，以利于将两者连接形成重组体接、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。 转、将重组DNA分子转移到适当的受体细胞（亦称寄主细胞），并与之一起增殖筛、从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆表。外源基因的高效表达的措施：1、提高外源基因的剂量2、筛选、修饰充足基因表达的转录调控元件：启动子，增强子，上游调控序列，操作子，终止子3、修饰和构建蛋白质生物合成的翻译调控元：选择、修饰和重组核糖体结合位点及密码子等mRNA的翻译调控原件，强化受体细胞中蛋白的生物合成过程。这些涉及到基因表达调控的分子生物学原理。4、工程菌的稳定生产与增殖：合理控制微型生物反应器的增值速度和最终数量。第二章 基因操作基本技术 第一节 凝胶电泳技术电泳是指带电粒子在电场中向与自身带相反电荷的电极移动的现象。电泳技术就是利用在电场的作用下，由于待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯的技术。一、电泳的基本原理 在溶液中任何一个带电颗粒在电场作用下的移动大致要受到三方面的影响：颗粒的性质，如：实际电荷，大小及形状，解离强度的难易等。所处的环境，如：电解质或缓冲液的浓度，离子强度，pH，粘度，温度等。应用电场的性质，如：电场强度不同带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同，常用泳动度或迁移率来表示，迁移率是指带电颗粒电场强度下泳动的速度。三、电泳的分类按有无固体支持物区分又可以分为: 自由电泳和支持物电泳两大类四、凝胶电泳 （1）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，是由D半乳糖和3、6脱水L半乳糖结合的链状多糖 。 琼脂糖凝胶电泳的原理概述在 pH 值为 8.08.3 时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入荧光染料（如 EB ）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。2、DNA分子的迁移速率由下列多种因素决定:1） DNA的分子大小: 线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量成反比。 分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中泳动，因而迁移得越慢。分子越小，所受阻力越小，迁移得越快。 2）凝胶浓度凝胶浓度直接影响凝胶的孔径。浓度越高，孔径越小，其分辨力越强。DNA分子电泳迁移率的对数与凝胶浓度成线性关系。3） DNA分子的构型 相同分子量的线状、开环和超螺旋DNA在琼脂糖凝胶中移动速度是不一样的, 共价闭合环环状DNA（cccDNA）直线DNA（ L DNA ）开环的双链环状DNA(ocDNA)。4） 电源电压 一般电压不得超过5v/cm。 5） 离子强度影响 在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶),电导率最小,DNA几乎不移动,在高离子强度的缓冲液中(如误加10电泳缓冲液),则电导很高并明显产热,严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 2）缓冲液系统 常用的电泳缓冲液有EDTA（pH8.0）和Tris-乙酸（TAE），Tris-硼酸（TBE）或Tris-磷酸（TPE）等，浓度约为50mmol/L(pH7.57.8)。3）凝胶的制备 以稀释的电极缓冲液为溶剂，用沸水浴或微波炉配制一定浓度的溶胶，灌入水平胶框或垂直胶膜，插入梳子，自然冷却。4）样品配制与加样 DNA样品用适量Tris-EDTA缓冲液溶解，缓冲液内含有0.25%溴酚蓝或其他指示染料，含有10%-15%蔗糖或5%10%甘油，以增加其比重，使样品集中5）电泳 为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不宜高于5V/cm。6）染色和拍照 常用荧光染料溴乙锭（EB）染色，在紫外光下观察DNA条带，用紫外分析仪拍照，或用凝胶成像系统输出照片，并进行有关的数据分析。EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐, (Ethidium Bromide)。它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在波长为300nm的紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出荧光，易于检测。可以检测10ng 的DNA。（四）脉冲电场凝胶电泳一般琼脂糖凝胶电泳只能分离小于20kb的DNA。这是因为在琼脂糖凝胶中，DNA分子的有效直径超过凝胶孔径时，在电场作用下，迫使DNA变形挤过筛孔，而沿着泳动方向伸直，因而分子大小对迁移率影响不大。如此时改变电场方向，则DNA分子必须改变其构象，沿新的泳动方面伸直，而转向时间与DNA分子大小关系极为密切。（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶浓度及其分离范围分离DNA大小的范围为1-1000bp蛋白质电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法有考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法银染的机制:来源于摄影银染技术,是将蛋白分子结合的银离子还原作成金属银。优点:检测灵敏度高,较普通考马斯亮蓝染色灵敏度要高50-100倍,可在蛋白质中找到含量较低的蛋白,而且所需的上样量较少(每点仅需0.1)。缺点:可重复性差 耗费人力 质谱测定有一定的干扰聚丙烯酰胺凝胶的主要优点： 分辨率高。具有三种效应：浓缩效应，分子筛效应，电荷效应；长度仅仅相差0.2(即500bp中的1bp)的DNA分子即可分开；（例） 所能装载的DNA量远远大于琼脂糖凝胶； 从聚丙烯酰胺凝胶中回收的DNA纯度很高。 可根据被分离物质的分子大小控制凝胶浓度制成不同孔径的凝胶。 丙烯酰胺较稳定，无色透明，机械强度好，易观察，可用检测仪直接测定。 5、等电聚焦： 在某一PH下，蛋白质分子在电场中不再移动，即静电荷为零，则此PH值即为该蛋白质的等电点。 优点：分辨率很高；样品可混入胶中或加在任何位置，在电场中随着电泳的进行区带越来越窄，克服了一般电泳的扩散作用。电泳结束后，可直接测定蛋白质pI。分离速度快，蛋白质可保持原有生物活性。 缺点： 电泳中应使用无盐样品溶液，否则高压中电流太大而发热。但无盐时有些蛋白质溶解性能差易发生沉淀，可在样品中多加些两性电解质。 许多蛋白质在pI附近易沉淀而影响分离效果，可加些脲或非离子去垢剂解决。蛋白质双向电泳中SDS凝胶检测常采用的染色方法有考马斯亮蓝、硝酸银染色、荧光染色法、免疫染色法以及蛋白质印迹法。8、蛋白质印迹 蛋白质印迹方法将高分辨率的电泳技术与灵敏的、专一的免疫探测技术结合起来,用针对蛋白特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针进行检测.对于蛋白质,通常使用的探针是抗体,它与附着于固定基质上的靶蛋白发生特异性反应.9、免疫电泳1、抗原抗体特异性反应。2、抗原在PH8.6时通常带强负电，而抗体不带电。3、抗原在含有抗体的凝胶中电泳时发生免疫反应，抗原过量，仅产生可溶性的免疫复合物与抗原一起向阳极移动。4、抗原与抗体浓度达到当量点时，形成免疫沉淀带。免疫电泳：是将区带电泳与双向免疫扩散相结合的一种免疫化学分析技术。先将蛋白质抗原在琼脂平板上进行电泳，使不同的抗原成分因所带电荷、分子量及构型不同，电泳迁移率各异而彼此分离。然后在与电泳方向平行的琼脂槽内加入相应抗体进行双向免疫分散。分离成区带的各种抗原成分与相应抗体在琼脂中扩散后相遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的弧形沉淀线。根据沉淀线的数量、位置和形状，与已知的标准(或正常)抗原抗体形成的沉淀线比较，即可对样品中所含成分及其性质进行分析、鉴定。对流免疫电泳：双向免疫扩散与电泳相结合的技术。在pH8.6的缓冲液中，抗原向正极泳动；而抗体大部分属于Ig，由于分子量大，暴露的极性基团较少，在离子琼脂中泳动缓慢，同时受电渗作用的影响向负极泳动 (电渗使液体向负极泳动) 在抗原抗体相遇的最适比例处形成乳白色沉淀线。由于电场的作用，限制了抗原、抗体的自由扩散，而使其定向泳动，因而增加了试验的灵敏度，并缩短反应时间。此法操作简便，仅需3060分钟，灵敏度比双向扩散高1015倍；但缺点是特异性不如双向琼脂扩散高。火箭免疫电泳：是将单向免疫扩散和电泳相结合的一种定量检测技术。电泳时，含于琼脂凝胶中的抗体不发生移动，而在电场的作用下促使样品中的抗原向正极泳动。当抗原与抗体分子达到适当比例时，形成一个形状如火箭的不溶性免疫复合物沉淀峰，峰的高度与捡样中的抗原浓度呈正相关。因此，当琼脂中抗体浓度固定时，以不同稀释度标准抗原泳动后形成的沉淀峰为纵坐标，抗原浓度为横坐标，绘制标准曲线。根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测抗原的含量；反之，当琼脂中抗原浓度固定时，便可测定待测抗体的含量(即反向火箭免疫电泳)。 DNA序列分析法:双脱氧末端终止测序法十二烷基磺酸钠SDS：是一种阴离子去污剂，它在水溶液中以单体和分子团的混合形式存在。这种阴离子去污剂能破坏蛋白质分子之间以及与其他物质分子之间的非共价键，使蛋白质分子内的二硫键被还原剂打开并不易再氧化，这就保证了蛋白质分子与SDS充分结合从而形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。第四章 基因工程载体载体：是一类可供外源DNA插入并携带重组DNA分子进入适当宿主细胞的DNA分子。绝大多数分子克隆实验所使用的载体是DNA双链分子。它的本质是DNA复制子。复制子(Replicon) ：DNA 中发生复制的独立单位称载体的功能：1. 为外源基因提供进入受体细胞的转移能力。2. 为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力。3. 为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力。一个理想的载体至少应具备以下几个条件：（1）能自我复制并能带动插入的外源基因一起复制。（2）具有合适的限制性内切酶位点。（3）具有合适的筛选标记，如抗药性基因等。（4）在细胞内拷贝数要多，这样才能使外源基因得以扩增。（5）载体的相对分子质量要小，这样可以容纳较大的外源DNA插入片段。（6）在细胞内稳定性高，这样可以保证重组体稳定传代而不易丢失。克隆载体的基本结构1） 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制； 2） 至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入；多克隆位点区（multiple cloning site MCS）。即载体上人工合成的含有多种限制性核酸内切酶的酶切位点DNA片段。 3） 至少应有一个选择标记基因，以指示载体或重组DNA分子是 否进入宿主细胞。 标记基因的功能是：指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 指示哪些细胞是转化细胞。标记基因的种类: 1）抗性标记基因: 抗生素抗性基因氨苄青霉素抗性基因（Ampr）、四环素抗性基因（Tcr）、氯霉素抗性基因（Cml r）、卡那霉素抗性基因（Kanr）、G418抗性基因（G418r）、潮霉素抗性基因（Hygr）、新霉素抗性基因（Neor）。ii. 重金属抗性基因。目前所用的重金属抗性基因有：铜抗性基因(Cur)，锌抗性基因(Znr)，镉抗性基因(Cdr)。iii. 代谢抗性基因。抗除草剂基因，胸苷激酶基因(TK)。2）营养标记基因。这类基因主要是参与氨基酸，核苷酸及其他必需营养物合成酶类的基因，如色氨酸合成酶基因(TRP1)，尿嘧啶合成酶基因(URA3)，亮氨酸合成酶基因(LEU2)，组氨酸合成酶基因(HIS4)等。 3) 生化标记基因。这类标记基因的表达产物可催化某些易检测的生化反应，常用的基因有-半乳苷酶基因（lacZ）、葡萄糖苷酸酶基因（GUS）、氯霉素乙酰转移酶基因（CAT）。载 体 类 型从构建载体的DNA来源分，有质粒载体、病毒载体、噬菌体载体、黏粒载体、噬菌粒载体、人工染色体等。从应用范围分，有表达载体、克隆载体、启动子探测载体、转化载体、穿梭载体、测序载体、多功能载体等。从表达所用的受体细胞分，有原核细胞和真核细胞载体，大肠杆菌载体、酵母载体、植物细胞载体和动物细胞载体。质粒载体噬菌体载体：噬菌体丝、状噬菌体粘粒载体综合型载体细菌与酵母人工染色体第一节 质粒载体质粒载体是以质粒的各种元件为基础组建而成的基因工程载体。它必须包含3种共同的组成成分。复制必需区、选择标记基因和限制性核酸内切酶的酶切位点（克隆位点） 。一、质粒的种类质粒是存在于细胞中的一类独立于染色体外的自主复制的共价、闭合、环状双链DNA分子，其大小通常为1-500kb范围内。1）F质粒：又称F因子或性质粒。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中。2）R质粒：通称抗药性因子。编码一种或数种抗菌素抗性基因，并且能将抗性转到缺乏该质粒的受体细胞，使后者也获得该抗性。3）Col质粒：大肠杆菌素因子。编码抗制大肠杆菌素（可使不带Col质粒的亲缘关系的细菌菌株致死的蛋白质）合成的基因。双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：1.当其两条链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA，（CCC）这样的DNA通常呈超螺旋的构型（SC）；2.如果两条核苷酸链中只有一条保持完整的环形构型，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA （OC） ；3.若双链均发生断裂而形成线性分子，则通称为L构型。质粒的基本特征 1 ）自主复制性。 质粒DNA含有自己的复制起始位点（Origin，简称ori）以及控制复制频率的调控基因，有些质粒还携带特定的复制因子编码基因，形成一个独立的复制子结构。有些质粒处于“严紧控制”之下，即它们的复制是同宿主细胞的复制偶联同步的。因此在每个细胞中的质粒只有一份拷贝，或最多只有几份拷贝。这称为“严紧型”质粒。另一些质粒则是处于“松弛控制”之下的“松弛型”质粒。每个细菌中可以有101000份拷贝。更重要的是松弛型质粒的拷贝数可因宿主细胞停止合成蛋白质而增加至几千份。宿主细胞不合成蛋白质时，染色体和严紧型质粒的复制都中止。但松弛型质粒仍继续进行复制。2 ）可转移性。 tra基因mob基因 部分质粒含有tra基因，指令宿主细胞产生菌毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞接合，导致遗传物质从一个细胞转移到另一细胞中。含tra基因的质粒称为接合质粒。部分质粒虽不含有tra基因，但是有bom位点，当宿主细胞同时存在含有mob基因的辅助质粒和接合质粒时，mob基因产物可打开非接合质粒的bom位点，借助于接合质粒tra基因的产物，使非接合质粒被动迁移到受体细胞中，这种由共存的接合型质粒引发的非接合型质粒的转移过程称为迁移作用。3 ）不相容性:在无选择压力下，两种亲缘关系密切的不同质粒不能共存于同一宿主的现象。质粒DNA的提取：1.氯化铯密度梯度离心法:在细胞裂解和分离DNA的过程中，大分子量的细菌染色体DNA容易发生断裂形成相应的线性DNA片段，而质粒DNA则由于其分子量小、结构紧密仍保持完整的环状分子。当将含有溴化乙锭（EB）的氯化铯溶液加入大肠杆菌裂解液中，EB扁平分子就会插入到碱基对间而结合在DNA链上，并因此导致双螺旋结构发生解旋。线性和开环的分子，因其具有游离末端而易于解旋，故可结合大量的EB分子。而质粒由于具有共价闭合环状的结构，没有游离的末端，只能发生有限的解旋反应，结果限制了EB分子结合的数量。因此染色体DNA片段要比质粒DNA结合更多的EB分子。在EB-DNA复合物中，结合的EB分子越多起密度越低。因此在EB达到饱和浓度的条件下，质粒DNA-EB复合物比线性DNA-EB复合物具有更高的密度，通过氯化铯密度梯度离心后，它们将停留在不同的位置。2.碱裂解法在pH值介于12-12.5间时，线性DNA双链间的氢键断裂变成两条完全分开的单链。虽然质粒cccDNA双链间的氢键也断裂，但两条单链并没有完全分开，仍然紧密的结合在一起。一旦pH值恢复成中性，线性DNA和质粒cccDNA度都会复性，质粒cccDNA两条单链并没有完全分开，因此复性快速而准确。但线性DNA两条单链完全分开，复性作用就没有cccDNA那样快速和准确，它们聚集形成线性网络结构，通过离心便和变性的蛋白质及RNA分子一起沉淀下来。 三 .构建理想质粒载体必须具备的条件 1）分子量较小 2）具有复制起始点3）带有可供选择的标记 4）带有尽可能多的单一限制性酶切位点 5）质粒拷贝数较高6）缺失mob基因7）插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达选择标记：抗生素作用机制：氨苄青霉素与细菌膜上的与细胞壁合成有关的酶类结合并抑制其活性。而氨苄青霉素抗性基因（Ampr）编码的酶可水解-内酰胺环，从而解除氨苄青霉素的毒性。四环素与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。而四环素抗性基因（tetr）编码一个膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。氯霉素与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。氯霉素抗性基因（Cmlr 或cat）编码一个四聚体细胞质蛋白，在乙酰辅酶A存在的条件下，该蛋白催化氯霉素羟乙酰氧基衍生物的形成，使之不能与核糖体结合而解毒。卡那霉素和新霉素是一类与30S核糖体结合并抑制蛋白质合成的脱氧链霉胺氨基糖苷，可被氨基糖苷磷酸转移酶所灭活。载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段(细菌lac操纵元中的lacI基因，启动子和lacZ的a肽基因) ，即lacZ基因，lacZ基因编码-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的（ a肽）。宿主菌具有缺失突变LacZ基因，合成的是一种缺失N端11-41氨基酸的缺陷性的-半乳糖苷酶，简称肽。由于缺失故不能将无色底物X-gal水解成蓝色物质。若将带有lacZ基因的载体导入该宿主，当培养基中含有诱导物IPTG和生色底物X-gal时，lacZ基因被诱导表达产生的-半乳糖苷酶N端a肽与宿主菌表达的肽实现基因内的互补而产生具有活性的-半乳糖苷酶。质粒和宿主编码的肽段各自都没有酶活性，两者由于功能互补而具有-半乳糖苷酶活性，这种现象成为称为a -互补（complementation）。 -半乳糖苷酶水解X-gal而使菌落呈现蓝色，在lacZ的5端又插入了一段人工设计合成的DNA序列MCS ，当外来序列插入后则破坏了lacZ编码的半乳糖苷酶氨基端片段活性，从而破坏了a互补作用，生长的菌落就呈白色，这种颜色标志的变化就很容易区分和挑选含有和不含有插入序列或基因的转化菌落，称为蓝白筛选法。 插入失活：因DNA插入而导致基因失活的现象。四 .质粒载体的改造与构建早期: pSC101, ColE1和pCR1缺点：复制效率低；选择标记不合适；限制性酶切位点少（2）发展期：pBR313优点：松弛型复制；两个选择标记（tetr和ampr） 缺点：太大成熟期：pBR322（4.36kb） 衍生质粒长度尽可能小：转化效率高（ 15kb）；容纳外源DNA长；复制拷贝数高。限制性酶切位点尽可能多：多克隆位点(MCS) 。辅助序列：肉眼鉴定重组克隆；外源蛋白质表达。五常用的质粒载体 1）pSC101质粒2）pBR322质粒载体3）pUC系列 pBR322质粒作为克隆载体的缺陷：一是很多常用的限制性内切酶没有单一切点；二是选择重组子和转化子时费时又繁琐。 一种典型的pUC系列的质粒载体，包括如下四个组成部分： （1）来自pBR322质粒的复制起点(ori)； （2）氨苄青霉素抗性基因，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的核酸内切限制酶的单识别位点； （3）大肠杆菌b-半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端a-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ 基因； （4）位于lacZ基因中的靠近5端的一段多克隆位点(MCS)区段。pUC系列的优点：la:具有更小的分子量和更高的拷贝数。（500-700copy/cell）； b:引入人工合成的具有多个限制性内切酶位点的序列，使质粒上带多个限制酶的单一切点；多克隆位点（MCS: Multi-cloning Site）； c:引入细菌染色体上乳糖操纵元的一段区域，使转化子可以实现蓝白筛选。4）穿梭质粒载体：人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记而可在两种不同的寄主中存活和复制的质粒载体。如：大肠杆菌-啤酒酵母穿梭质粒载体。5）表达质粒载体：专用于在宿主细胞中高水平表达外源蛋白质的质粒载体。除具有一般载体的基本特性外，还需要如启动子，核糖体结合序列（S-D序列），转录终止子。目的基因必须处于正确的阅读框架中。7.T载体 （ T-A克隆） T-vector两条链的5端含有一个游离的T PCR过程中，普通的Taq酶在产物的3端多加一个A第二节 病毒（噬菌体）载体 一l-双链DNA噬菌体载体 三单链DNA噬菌体载体噬菌体(bacteriophage,phage)：是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒。噬菌体具有病毒的一些特性：个体微小，可以通过滤菌器；没有完整的细胞结构，主要由蛋白质构成的衣壳和包含于其中的核酸组成；只能在活的微生物细胞内复制增值，是一种专性细胞内寄生的微生物。噬菌体分布极广，凡是有细菌的场所，就可能有相应的噬菌体的存在。一l-双链DNA噬菌体载体 l噬菌体是一种中等大小的温和噬菌体。lDNA为线状双链分子，长度为48502bp。迄今已经定位的l噬菌体的基因至少有61个，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动-l噬菌体的必要基因。 另一部分基因，当它们被外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能-l噬菌体的非必要的基因。 lDNA两端具有由12个核苷酸组成的粘性末端（这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点）。当噬菌体感染宿主细胞后，双链DNA分子通过COS而成环状。 l噬菌体可以进行体外包装，只要被包装DNA在36.450.9kb的双链处有两个COS序列。 lDNA可通过噬菌体特异性感染高效进入宿主细胞或受体细胞，以及l-DNA在大肠杆菌细胞中的高拷贝复制，这是l-DNA在分子克隆技术发展早期就被选作载体使用的原因。l重组噬菌体分子的体外包装所谓lDNA的体外包装，就是在试管中完成噬菌体在寄主细胞内的全部组装过程。其基本原理是：l噬菌体头部和尾部的装配是分开进行的。头部基因发生了突变的噬菌体只能形成尾部，而尾部基因发生了突变的噬菌体只能形成头部。将这两种不同突变型的噬菌体提取物混合起来，就能够在体外装配成有生物活性的噬菌体颗粒。Ter体系：位点特异的切割体系，能识别两个相距适宜的cos位点，将多连体分子切割成单位长度的片段，并将它们包装到噬菌体头部中去。包装限制：l噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力：75%-105%；包装底物：多连体的DNA分子。1）l DNA载体的构建 :（1）缩短野生型l-DNA的长度，提高外源DNA片段的有效装载量。l-DNA的包装范围为l-DNA总长度的75%-105% （36.450.9kb ）。（2）删除重复的酶切位点，引入单一的多酶切位点接头序列，增加外源DNA片段克隆的可操作性。 （3）灭活某些与裂解周期有关基因，使l-DNA载体只能在特殊的实验条件下感染裂解宿主细菌，以避免可能出现的生物污染现象的发生。（4）引入合适的选择标记基因，便于重组噬菌体的检测2）l噬菌体载体的主要类型（i）插入型载体：只具有一个限制性内切酶位点以便于外源DNA的插入。外源的DNA克隆到插入型的l载体分子上，会使噬菌体的某种生物功能丧失效力，即所谓的插入失活效应。根据插入失活效应的特异性，插入型的l载体分为免疫功能失活和大肠杆菌-半乳糖苷酶失活两种亚型。插入型载体的长度正好是l噬菌体包装的下限，因为本身也能被包装，因而所承受的外源插入DNA片段较小（014.5kb）（50.9-36.4），一般在10kb以内，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。利用这类载体必须使用载体所携带的选择标记基因来筛选重组噬菌体。（ii）替换型载体又叫做取代型载体：具有两个限制性内切酶位点，其中央的DNA区段可以被外源DNA分子所取代的克隆载体。取代型载体的l-DNA分子长度约为40kb，在其非必需区域内含有两个相同的酶切口，两者间的距离为14kb，使用时用酶切开载体分子，分离去除非必需DNA片段，然后用外源DNA片段取而代之，形成重组分子。这类载体的装载量不仅比插入型载体大，而且被克隆的DNA片段必定在10.4kb24.9kb之间(去除14kb非必需DNA片段后的载体片段总长为26kb)。取代型载体不再需要标记基因，因为空的载体分子只有26kb，不能被包装成成熟的噬菌体颗粒。含有小于10kb和大于25kb外源DNA片段的重组分子也不能形成噬菌斑。3）l重组噬菌体的筛选与质粒载体不同，l噬菌体载体不具有抗菌素抗性选择记号。对重组体分子的选择，主要是依据噬菌斑的形态学特征和X-gal-IPTG显色反应作出判断的。（i）cI基因功能选择法：c基因编码的阻遏蛋白质，是促使感染了大肠杆菌的l噬菌体在寄主细胞进入溶源化状态的必要条件。如果在噬菌体载体的cI基因区域插入了或替换了外源DNA片段，l重组体分子的表型将是cl-，重组噬菌体因不能建立溶源状态形成透明噬菌斑；而非重组体分子的则是c+表型，形成混浊型的噬菌斑。所以，根据噬菌斑形态学特征的差异，便可以选择出l重组体分子。（ii）LacZ基因功能选择法： 根据lacZ基因编码产物-半乳糖苷酶在X-gal-IPTG培养基平板上显色反应的原理，并且在某些l噬菌体载体的lacZ基因中，引入了若干常用的核酸内切限制酶识别位点。 当外源DNA片段插入到这些克隆位点时，形成的是无功能活性的-半乳糖苷酶。于是被感染的大肠杆菌寄主细胞，就将在含X-gal-IPTG的培养基平板上形成无色的噬菌斑；而相反的，只噬菌体载体将会形成蓝色的噬菌斑（iii）Spi-选择法(Sensitive to P2 inhibition): 基本原理：l噬菌体的red和gam基因的编码产物，会抑制l噬菌体在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌细胞中正常生长，其表型为Spi+。而red-gam-突变型的l噬菌体，却可以在P2溶源性的细菌中正常生长并形成噬菌斑，即Spi-。4）l重组噬菌体分子导入受体细胞转染 ：l重组体DNA分子直接感染大肠杆菌，使之侵入寄主细胞内。5）质粒和噬菌体载体比较： 质粒载体克隆外源DNA片段的大小一般不超过15Kb； 噬菌体载体容纳的外源DNA片段较大；以感染途径进入宿主细胞的效率比转化高； 但对克隆基因的分析鉴定较难。6）常用的l噬菌体载体 lambda gt10 插入型载体、lambda gt11 插入型载体 容量：5kb，适用于cDNA文库构建EMBL3 替换型载体 9-23kb的置换容量 二柯斯质粒载体柯斯质粒载体又称粘粒是一类由人工构建的含有lDNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。1）柯斯质粒的特点 ：（i）具有噬菌体的特性：在克隆了外源片段后可在体外被包装成 噬菌体颗粒，高效地感染对噬菌体敏感的大肠杆菌细胞。（ii）具有质粒载体的特性：在寄主细胞内如质粒一样进行复制，携带有抗性基因和克隆位点，并具氯霉素扩增效应。（iii）具有高容量的克隆能力 柯斯质粒用于克隆大片段的DNA分子特别有效2）柯斯质粒的优越性： 1高效进入受体细胞内2柯斯质粒可以大规模扩增3具有很强的选择性4质粒上的选择性标记可直接用来筛选感染的转化细胞。与l-噬菌体DNA不同的是： 柯斯质粒重组分子进入受体细胞后，依靠质粒DNA部分的复制子结构进行自主复制，其拷贝数取决于质粒本身的性质，而且由于重组分子失去了体内包装的能力，故其分离纯化只能采用质粒的方法。3）柯斯克隆应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫做“柯斯克隆”。三单链M13 DNA噬菌体载体M13基因组为环状单链DNA，大小为6407bpM13噬菌体有下述特点：不论是RF DNA还是单链DNA，都能够转染感受态的大肠杆菌；M13单链DNA噬菌体可大可小，只受DNA的大小控制。因此M13不受外壳蛋白的包装限制。 RF DNA可作为克隆载体使用，单链DNA适合测序等。2. M13单链DNA噬菌体载体的构建: 1)在IG内插入一个大肠杆菌的lac操纵子片段。2)在M13mp2的EcoR I位点上，加入一种化学合成的具有多克隆位点的多聚衔接物(polylinker)，使其成为适用于多种核酸内切限制酶的克隆载体。M13克隆载体的缺陷是克隆外源DNA的能力较小，一般只适于克隆300400bp的外源DNA片段，其最大容量1500bp。插入外源片段后，遗传稳定性下降。第三节 噬菌粒载体噬菌粒载体：一类由质粒载体和单链噬菌体而成的新型载体系列。它们均具有以下的基本结构：（1）在多克隆位点区(MCS)的两侧，存在一对T3和T7噬菌体的启动子，用以定向地指导插入在多克隆位点上的外源DNA或(基因)的转录活动；（2）同时具有一个单链噬菌体M13或f1的复制起点和一个来自ColE1质粒的复制起点，pBluescript噬菌粒载体便可按照不同的复制形式分别合成出单链或双链的DNA；（3）编码有一个氨苄青霉素抗性基因，供作转化子克隆的选择记号；（4）含有一个lacZ基因，可以按照Xgal-IPTG组织化学显色反应法筛选噬菌粒载体的重组子。酵母人工染色体染色体含有三种必需成分：着丝粒、端粒和自主复制序列 。着丝粒(CEN)在有丝分裂时结合微管并调控染色体的运动，接收细胞信号而使姐妹染色体分开到各子细胞中去。 端粒（TEL）：主要功能是防止染色体融合、降解、确保其完整复制。维持染色体的稳定。自主复制序列(ARS),即复制起点： DNA复制通常由起始蛋白与该序列相互作用开始,含有酵母菌中 DNA 进行双向复制所必须的信号。无义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变。 其中密码子改变为UAG的无义突变又叫琥珀突变，密码子改变成UAA的无义突变又叫赭石突变。细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome, BAC）：用F质粒及其调控基因构建细菌载体，克隆大片段DNA。是通过去除了F质粒的转移区及整合区等复制非必需区段，并引入了多克隆位点及选择标记而构成的。BAC的优点1 易于用电击法转化E.coli（转化效率比转化酵母高10-100倍）；2 超螺旋环状载体，易于操作；3 F质粒本身所带的基因控制了质粒的复制；4 很少发生体内重排，稳定； 5. 克隆容量可达300kb。第三节 表达型载体1.基因表达的过程 转录是基因表达的第一步，是遗传信息从DNA分子转移到RNA分子的过程。基因表达的第二步是转译，是mRNA分子指导蛋白质多肽链合成的过程。 基因的编码区叫做开放阅读框架表达型载体：包括转录起始必需的启动子、翻译起始所必需的核糖体识别序列，正确的阅读框架等。 3分泌型表达载体4原核生物的表达载体大多数原核生物表达载体的启动子主要是噬菌体的Pl启动子、大肠杆菌乳糖操纵子的lac启动子、色氨酸操纵子的trp启动子以及pBR322质粒的-内酰胺酶启动子 第三章 工具酶核酸酶:通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，使核酸分子多核苷酸发生水解断裂的酶。 核糖核酸酶(Rnase)专门水解断裂RNA分子, 脱氧核糖核酸酶(DNase)特异水解断裂DNA分子 。 按水解断裂核酸分子的不同方式核酸酶分为两种类型： 核酸外切酶(exonuclease) :从核酸分子的末端开始，一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链。核酸内切酶(endonuclease):从核酸分子 内部切割磷酸二酯键使之断裂形成小片段。限制性核酸内切酶切割DNADNA连接酶生成3- 5磷酸二酯键DNA聚合酶探针标记、补平3末端反转录酶cDNA合成多聚核苷酸激酶5磷酸化、探针标记末端转移酶3末端多聚尾碱性磷酸酶切除末端磷酸基第一节限制性内切酶Restriction Enzyme (RE)修饰作用：第二个寄主菌株赋予噬菌体非遗传的变化，使之再感染时能够有效生长，而没有再次受到限制的现象。限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并在识别位点或其附近切割DNA双链的核酸内切酶。3.限制酶的种类根据限制酶识别和切割DNA的特点，可将限制酶分为I、II、III三种类型.I型：能识别专一的核苷酸顺序，在距识别点数千碱基处随机切割DNA分子中的双链。III型：有专一的识别顺序。它在识别顺序下游约25bp处几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对则是任意的。 II型：识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内或附近的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。所以总能得到同样核苷酸顺序的DNA片段，并能构建来自不同基因组的DNA片段，形成杂合DNA分子。 4. 型限制性核酸内切酶的基本特性：4.1型限制性内切酶的识别序列 绝大多数的型核酸内切限制酶，都能够识别由4一6个核苷酸对组成的特定的核苷酸序列，我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。而限制酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此识别序列又称内切酶的靶子序列。 识别序列通常具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构（palindromic structure）。即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”核苷酸顺序都完全相同。识别序列在DNA分子中出现的频率 : 如果四种碱基按完全随机分布的原则，则某种限制性内切酶识别序列在DNA分子中出现的频率为（ 1/4 ）n n为识别序列的核苷酸数目。4.2型限制性内切酶的酶切特点 绝大多数型限制性内切酶在其识别顺序切割双链DNA，水解磷酸二酯键，产生3OH和5 P片段。 这种酶的切割可以有两种方式。一是交错切割，结果形成两条单链末端，这种单链末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端如果切点在中轴的左上侧和右下侧, 则产生5突出粘性末端（cohesive end）:5GAATT C3 5GOHpTTAAC33C ATAAG5 EcoR 3CTTAAp OHG5如果切点在中轴的右上侧和左下侧, 则产生3突出的粘性末端： 5CTGCAG3 5CTGCAOHpG33GACGTC5Pst 3GpOHACGTC5另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端，即碱基 配对完好的末端。5. 同裂酶同裂酶：来源不同的限制酶却识别和切割相同的序列。 “完全同裂酶”能识别和切割完全相同的序列，如Hind III与Hsu I，（A/AGCTT） “不完全同裂酶”虽能识别相同序列，但切割方式不同，如Xma I和Sma I。（CCCG/GG和CCC/GGG） 6. 同尾酶 同尾酶：来源不同的限制酶，识别及切割序列各不相同，但却能产生出相同的粘性末端。7. 限制酶的识别位点与切割方式之间的关系： （1）识别顺序不同，切割方式也不同; (如EcoR和Pst I，前者产生的是5粘端，后者产生的是3粘端。) （2）识别顺序不同，切割产生的粘末端相同；(同尾酶) （3）识别顺序相同，切割方式不同； (如Sma I与ma I) （4）相同的识别顺序，切割方式亦相同； 8影响核酸内切限制酶活性的因素 ：核酸内切限制酶的单位是这样定义的，在20ul终反应体系中，1h完全酶解1 g 底物DNA所需要的酶量，为l个单位的内切酶（1U）。 （1）DNA样品的纯度： 纯度越高越有利酶切（2）DNA的甲基化程度：甲基转移酶对DNA修饰后，使得自身DNA不受到体内限制性内切核酸酶的酶切（3）酶切消化反应的温度：不适合的温度酶会失活。（4）DNA的分子结构：酶切超螺旋DNA和病毒DNA需要的的酶量比线性DNA多（5）核酸内切限制酶的缓冲液： 放止酶变性 (6) 酶的纯度：越高越好内切酶的星号活性：在某些反应条件下，识别顺序的特异性可能发生变化，可能切割一些与特异识别序列相类似的序列。促使内切酶产生星号活性的因素有多种，主要由如下一些因素引起。（1）甘油浓度过高。这是引起星号反应的常见原因。（2）离子强度不合适。某些内切酶需要在高盐缓冲液中进行反应，盐浓度降低也可能引起星号反应。（3）阳离子变化。若将Mg2+改为Mn2+可能促使EcoR和Hind 产生星号活性。（4）溶液中pH变化。如用EcoR I酶切时，反应溶液的pH值由7.5升高到8.5时也会出现星号反应。（5）有机溶剂残留的影响。 9. 核酸内切限制酶在分子克隆中的应用DNA重组，组建新质粒，DNA分子杂交， 制备DNA放射性探针，绘制DNA物理图谱， DNA序列分析，DNA甲基化碱基的识别与切割， 基因定位及DNA同源性研究。第二节甲基化酶甲基化酶使识别顺序中的某个碱基发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开。第三节DNA连接酶DNA连接酶(Iigase)：能借助ATP或NAD水解提供的能量催化2条双链DNA片段紧靠在一起的3羟基末端与5磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接的酶。1. DNA连接酶的作用机理DNA连接酶与细胞内的能源分子形成复合物，“用力拉住”5-P末端并将其“送到”3-OH末端上，促使两者形成磷酸二酯键，实现两个DNA分子的连接。细胞内的能源分子主要是指烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和腺苷三磷酸（ATP）。 2. 连接酶的种类 E. coli DNA连接酶：简称DNA连接酶，是由大肠杆菌染色体编码的。只能催化双链DNA片段黏性末端之间的连接，不能催化双链DNA片段平末端之间的连接。用NAD+作能源辅助因子 。T4DNA连接酶：是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的。既可用于双链DNA片段黏性末端之间的连接，也能催化双链DNA片段平末端之间的连接，但平末端之间连接的效率比较低。用ATP作作能源辅助因子。 连接反应的最佳温度为4-153. DNA片段的连接特点和连接方式（1）粘性末端连接：由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的粘性末端，或由两种不同的限制性核酸内切酶切割的DNA片段，具有相同类型的粘性末端，都可以在DNA连接酶催化作用下形成共价结合的重组DNA分子。（2）平末端连接：用T4DNA连接酶直接将平末端的DNA片段连按起来，或是用末端脱氧核苷酸转移酶给具平末端的DNA片段加上poly(dA)-poly(dT)同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来。 （3）同聚物加尾连接：运用末端脱氧核苷酸转移酶，将核苷酸一个一个加到DNA分子的单链延伸末端的3-OH上形成长度可达100个核苷酸的尾。（4）人工接头连接：人工接头连接法分为两种：一种是DNA连接子（linker)法,一种 DNA接头法。DNA连接子也称衔接物：是指一段人工合成的具有平末端的双链寡核苷酸片段，长度为8-12个，具有一种以上限制酶识别位点。 DNA接头法：也是指一段人工合成寡核苷酸片段，它的序列中包含了限制酶粘性末端，不需要用限制酶酶切。 第四节 DNA聚合酶 能够把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3-O