质粒的基本知识.doc

质粒质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器和细菌细胞中染色体以外的脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40106以上，较小一类的相对分子质量是10106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有12个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。质粒运载体的最大插入片段约为10 kb(kb表示为千碱基对)。复制原点DNA复制起点，即DNA聚合酶结合位点标记基因一般是运载体上的一段特殊DNA序列，能表达特定形状便于检测运载体是否导入受体（如抗氨苄青霉素基因，绿色荧光基因）启动子转录起始位点，即RNA聚合酶结合位点终止子转录终止位点，也是特殊的DNA序列起始密码子（无启动密码子之说）mRNA上翻译起始的位置，通常为AUG，对应甲硫氨酸，少数细菌（属于原核生物）以GUG(缬氨酸)或UUG为起始密码，线粒体和叶绿体以AUG、AUU、AUA为起始密码子终止密码子翻译终止位置，不对应氨基酸，为UAA,UAG,UGA目的基因插入运载体，就是想要使其表达的那一段DNA序列，比如说想将人生长激素基因导入到小鼠体细胞中使其表达，那么人生长激素基因就是目的基因，经限制性内切酶切后与运载体相连（运载体 新教材上为载体）1. 质粒转化具体操作步骤：l 将1ul 质粒DNA加入1.5ml的离心管；l 将感受态细菌（competent cells）从70冰柜中取出，快速吸取50ul感受态细菌，加入含质粒DNA的1.5ml的离心管；l 轻轻地旋转以混匀内容物，在冰中放置3060 min；l 42度热休克90s（该时间应该非常准确，用Timer记时），冰上放置5min；l 每管加500ul LB培养液，放37水浴1h；l 吸取200ul培养物至含相应抗生素的90mm LB平板上，涂布棒将培养液涂布均匀；l 倒置平皿，于37培养，1216h后可出现菌落。2. 质粒的抽提具体操作步骤：l 用前将RNase A管的液体全部加到 Solution（加好RNaseA的溶液I一般储存在4）；l 将60ml的乙醇加到洗涤缓冲液瓶l 37培养16h的平板中挑取一个单菌落（直径23mm），接种到10ml LB培养液 37剧烈振摇培养16 h；l 取4ml菌液到5ml 离心管，8000rpm室温离心3min；l 去上清，放于面巾纸上吸干痕液，l 加250 ul Solution （注意用前应该加RNase A管），于涡旋振荡器重悬细胞；l 加250 ul 37预热2-3min的Solution ；l 加350 ul Solution ，将5ml离心管置于拇指和食指间柔和地反复颠倒数次；l 将5ml离心管中的溶液倒入1.5ml 离心管中，l 室温孵育2-3min，12000rpm 4离心15 min；l 装配2ml 收集管（白色）和柱状收集管（蓝色）l 将上清倒入柱状收集管（蓝色）中；l 8000rpm室温离心3min；l 去掉收集管中的液体，加500ul Buffer HB 到柱状收集管中，10000rpm室温离心1min；l 去掉柱状收集管中的液体，加750ul Wash Buffer（注意用前加乙醇），10000rpm室温离心1min；l 重复上述步骤一次；l 不加Wash Buffer将管子10000rpm室温离心1min；l 将柱状管放到一个消过毒的1.5ml 离心管中，加65ul灭菌水，室温放置2min，8000rpm室温离心3min 洗提（洗脱）DNA。3. 质粒电泳具体操作步骤（以倒20ml的胶为例）：l 用50ml量筒量取20ml 1XTAE；l 用电子天平称量0.16g琼脂糖，并倒入20ml电泳缓冲液中；l 将称量纸覆盖在装有琼脂糖的电泳缓冲液的三角瓶中，放入微波炉中转1min30s，至肉眼看不到颗粒状琼脂为止；l 至室温待溶液冷却至60度左右，将三角瓶中溶液倒入制胶盒中，并加入上样梳子；l 至室温约30min胶凝固后，拔掉梳子并将凝胶安放到电泳槽内；l 向电泳槽加入电泳缓冲液，刚好没过凝胶约1mm；l 将样品中加入适量的10X上样缓冲液，该上样缓冲液的体积计算如下：如果样品体积是20ul加入2ul 10X上样缓冲液，如果是30ul，加入3ul 10X上样缓冲液；l 将样品加入上样槽中，打开电源，一般为120v，电泳约20-30min，关掉电源，在Dark Reader荧光透射仪观察结果。质粒(Plasmid)质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体(Vector)。许多细菌除了拟核中的DNA外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒(plasmid)（补充：部分质粒为RNA）。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进细菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40106以上，较小一类的相对分子质量是10106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有12个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。质粒运载体的最大插入片段约为10 kb(kb表示为千碱基对)。（1）高拷贝数的质粒载体适于分离大量的高纯度的克隆基因的DNA片段。如ColE1、pMB1或它们的派生质粒。它们不仅具有低分子量、高拷贝数的优点，而且在没有蛋白质合成的条件下仍能继续复制。因此，若在处于对数生长晚期的含有ColE1一类质粒的大肠杆菌培养物中，加入适量的蛋白质合成抑制剂讲如氯霉素或壮观霉素处理之后，每个细胞中的质粒拷贝数则可扩增到10003000个之多。如果加入高浓度的尿核苷，质粒DNA又可进一步扩增23倍。（2）低拷贝数的质粒载体适合于克隆含量过高对寄主代谢有害的DNA。例如，pLG338、pLG339及pHSG415。这类质粒载体的一个普遍性问题是，由于它们体积小、拷贝数低，与此相应的基因剂量也就较少，因此要制备大量的克隆DNA就很困难。（3）失控的质粒载体失控的质粒载体（runaway plasmid vectors）：是一些低拷贝的质粒，其复制控制是温度敏感型的，也就是说在不同的温度下，拷贝数会有显著的变化。B.E.Uhlin等人（1979）首先发展了失控的质粒载体pBEU1和Pbeu2。这种质粒载体在30下，每个寄主细胞中只含有适量的拷贝数，而当培养温度超过35时，质粒的复制便失去了控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长蛋白质的合成可按正常的速率持续23小时。这期间编码在质粒载体上的基因产物便超过了常量。最后，细胞生长受到了抑制，并失去了存活的能力，但在这个阶段质粒DNA可累积到占细胞总DNA的50%。（4）插入失活型的质粒载体选用插入失活型质粒，将外源DNA片段插入在会导致选择记号基因（如tetr、ampr、cmlr等）失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度地提高获得阳性克隆的几率。除了pDF471和Pdf42之外，都具有基因插入失活的克隆位点，因此都属于插入失活型的质粒载体。（5）正选择的质粒载体正选择质粒载体（direct selection vectors）：这种质粒载体具有具有直接选择记号并赋予寄主细胞相应的表型。通过选择具这种表型特征的转化子，便可大大降低需要筛选的转化子的数量，从而减轻了实验的工作量，提高了选择的敏感性。（6）表达型的质粒载体使克隆在大肠杆菌中特定位点的外源真核基因的编码序列置于大肠杆菌的转录-转译信号控制之下，并能在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体特称为表达载体（expression vectors）。它分为表达型质粒载体和表达型噬菌体载体两种不同的类型。质粒（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的质粒虽然都是环状构形，然而目前也发现有少数的质粒属于线性构形，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中。目录简介质粒在细胞内的复制质粒载体质粒的不兼容性从细菌中提取质粒的方法1 从细菌中分离质粒 DNA 的具体操作材料、设备及试剂1 操作步骤特征培养pBR322质粒载体的构建pBR322的应用展开简介质粒在细胞内的复制质粒载体质粒的不兼容性从细菌中提取质粒的方法1 从细菌中分离质粒 DNA 的具体操作材料、设备及试剂1 操作步骤特征培养pBR322质粒载体的构建pBR322的应用展开编辑本段简介质粒（Plasmid）是附加到细胞中的非细胞的染色体或核区DNA原有的能够自主复制的较小的DNA分子（即细胞附殖粒、又胞附殖粒）。大部分的质粒虽然都是环状构形，然而目前也发现有少数的质粒属于线性构形，它存在于许多细菌以及酵母菌等生物中，乃至于植物的线粒体等胞器中。天然质粒的DNA长度从数千碱基对至数十万碱基对都有。质粒天然存在于这些生物里面，有时候一个细胞里面可以同时有一种乃至于数种的质粒同时存在。质粒的套数（copy number）在细胞里从单一到数千都有可能。有时有些质粒含有某种抗药基因（如大肠杆菌中就有含有抗四环素基因的质粒）。有一些质粒携带的基因则可以赋予细胞额外的生理代谢能力，乃至于在一些细菌中提高它的致病力。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。它是基因工程最常见的运载体。1编辑本段质粒在细胞内的复制质粒在细胞内的复制一般有两种类型：紧密控制型（Stringent control 大肠杆菌质粒的分子结构示意图）和松弛控制型（Relaxed control）。前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，当染色体不复制时，它也不能复制，通常每个细胞内只含有1 个或几个质粒分子，如F 因子。后者的质粒在整个细胞周期中随时可以复制，在每个细胞中有 许多拷贝，一般在20 个以上，如 Col E1质粒。在使用蛋白质合成抑制剂-氯霉素时，细胞内蛋白质合成、染色体DNA 复制和细胞分裂均受到抑制，紧密型质粒复制停止，而松弛型质粒继续复制，质粒拷贝数可由原来20多个扩增至1000-3000个，此时质粒DNA占总DNA的含量可由原来的2%增加至40-50%。利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性（Incompatibility）。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。质粒通常含有编码某些酶的基因，其表型包括对抗生素的抗性，产生某些抗生素，降解复杂有机物，产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。编辑本段质粒载体把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体（Vector）。细菌质粒是重组DNA 技术中常用的载体。质粒分子本身是含有复制功能的遗传结构。质粒还带有某些遗传信息，所以会赋予宿主细胞一些遗传性状。其自我复制能力及所携带的遗传信息在重组DNA操作，如扩增、筛选过程中都是极为有用的。质粒载体是在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的。与天然质粒相比，质粒载体通常带有一个或一个以上的选择性标记基因（如抗生素抗性基因）和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量尽可能减少，以便于基因工程操作。大多质粒载体带有一些多用途的辅助序列，这些用途包括通过组织化学方法肉眼鉴定重组克隆、产生用于序列测定的单链DNA、体外转录外源DNA序列、鉴定片段的插入方向、外源基因的大量表达等。一个理想的克隆载体大致应有下列一些特性：分子量小、多拷贝、松弛控制型；具有多种常用的限制性内切酶的单切点；能插入较大的外源DNA片段；具有两个以上的遗传标记物，便于鉴定和筛选。对宿主细胞无害。常用的质粒载体大小一般在1kb至10kb之间，如PBR322、PUC系列、PGEM系列和pBluescript（简称pBS）等。编辑本段质粒的不兼容性利用同一复制系统的不同质粒不能在同一宿主细胞中共同存在，当两种质粒同时导入同一细胞时, 它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争。在一些细胞中，一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒却占上风。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在细胞后代中只有两种质粒的一种，这种现象称质粒的不相容性(Incompatibility)。但利用不同复制系统的质粒则可以稳定地共存于同一宿主细胞中。质粒通常含有编码某些酶的基因，其表型包括对抗生素的抗性，产生某些抗生素，降解复杂有机物，产生大肠杆菌素和肠毒素及某些限制性内切酶与修饰酶等。2编辑本段从细菌中提取质粒的方法从细菌中分离质粒DNA的方法都包括3个基本步骤：培养细菌使质粒扩增；收集和裂解细胞；分离和纯化质粒DNA。采用强碱液、加热或溶菌酶（主要针对革兰氏阳性细菌）可以破坏菌体细胞壁，十二烷基磺酸钠（SDS）和TritonX-100（一般很少使用）可使细胞膜裂解。经溶菌酶和SDS或Triton X-100处理后，细菌染色体DNA会缠绕附着在细胞碎片上，同时由于细菌染色体DNA比质粒大得多，易受机械力和核酸酶等的作用而被切断成不同大小的线性片段。当用强热或酸、碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA(Covalently closed circularDNA，简称cccDNA）的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线状染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相中。在细菌细胞内，共价闭环质粒以超螺旋形式存在。在提取质粒过程中，除了超螺旋DNA外，还会产生其它形式的质粒DNA。如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松弛型的环状分子，称开环DNA(Open circularDNA，简称ocDNA）；如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA(LinearDNA）。当提取的质粒DNA电泳时，同一质粒DNA其超螺旋形式的泳动速度要比开环和线状分子的泳动速度快。 编辑本段从细菌中分离质粒 DNA 的具体操作材料、设备及试剂一、材料含PBS的E.coliDH5或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管（又称eppendorf管），离心管架。二、设备微量取液器（20l，200l，1000l），台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅），涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。三、试剂1、LB液体培养基（Luria-Bertani）：称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。3、氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20保存备用。4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTrisCl（pH8.0）溶液配制成10mg/ml，并分装成小份（如1.5ml）保存于-20，每一小份一经使用后便予丢弃。5、3mol/lNaAc（pH5.2）：50ml水中溶解40.81gNaAc3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4冰箱。6、溶液1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4冰箱。7、溶液：0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1%SDS。8、溶液：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，Ac5mol/L。9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTrisCl（pH7.5），15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml的溶液，于100加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20。10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联，应在160用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1%的8-羟基喹啉（作为抗氧化剂），并用等体积的0.5mol/LTrisCl（pH8.0）和0.1mol/LTrisCl（pH8.0）缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，因为酸性条件下DNA会分配于有机相。11、氯仿：按氯仿：异戊醇=24：1体积比加入异戊醇。氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的分开，异戊醇则可起消除抽提过程中出现的泡沫。按体积/体积=1：1混合上述饱和酚与氯仿即得酚/氯仿（1:1）。酚和氯仿均有很强的腐蚀性，操作时应戴手套。12、TE缓冲液：10mmo/LTrisCl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。高压灭菌后储存于4冰箱中。13、STET：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTrisCl（pH8.0），10mmol/LEDTA（pH8.0），5%TritonX-100。14、STE：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTrisCl（pH8.0），1mmol/LEDTA（pH8.0）。15、电泳所用试剂：TBE缓冲液（5）：称取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5MEDTA（pH8.0）20ml，定溶至1000ml。上样缓冲液（6）：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液。操作步骤一、细菌的培养和收集将含有质粒pBS的DH5菌种接种在LB固体培养基（含50g/mlAmp）中，37培养12-24小时。用无菌牙签挑取单菌落接种到5mlLB液体培养基（含50g/mlAmp）中，37振荡培养约12小时至对数生长后期。二、质粒DNA少量快速提取质粒DNA小量提取法对于从大量转化子中制备少量部分纯化的质粒DNA十分有用。这些方法共同特点是简便、快速，能同时处理大量试样，所得DNA有一定纯度，可满足限制酶切割、电泳分析的需要。（一）、煮沸法1、将1.5ml培养液倒入eppendorf管中，4下12000g离心30秒。2、弃上清，将管倒置于卫生纸上几分钟，使液体流尽。3、将菌体沉淀悬浮于120mlSTET溶液中，涡旋混匀。4、加入10ml新配制的溶菌酶溶液（10mg/ml），涡旋振荡3秒钟。5、将eppendorf管放入沸水浴中，50秒后立即取出。6、用微量离心机4下12000g离心10分钟。7、用无菌牙签从eppendorf管中去除细菌碎片。8、取20ml进行电泳检查。注意1.对大肠杆菌可从固体培养基上挑取单个菌落直接进行煮沸法提取质粒DNA。2.煮沸法中添加溶菌酶有一定限度，浓度高时，细菌裂解效果反而不好。有时不同溶菌酶也能溶菌。3.提取的质粒DNA中会含有RNA，但RNA并不干扰进一步实验，如限制性内切酶消化，亚克隆及连接反应等。（二）、碱法1、取1.5ml培养液倒入1.5mleppendorf管中，4下12000g离心30秒。2、弃上清，将管倒置于卫生纸上数分钟，使液体流尽。3、菌体沉淀重悬浮于100l溶液中（需剧烈振荡），室温下放置5-10分钟。4、加入新配制的溶液200l，盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf管数次，以混匀内容物（千万不要振荡），冰浴5分钟。5、加入150l预冷的溶液，盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10秒，使沉淀混匀，冰浴中5-10分钟，4下12000g离心5-10分钟。6、上清液移入干净eppendorf管中，加入等体积的酚/氯仿（1:1），振荡混匀，4下12000g离心5分钟。7、将水相移入干净eppendorf管中，加入2倍体积的无水乙醇，振荡混匀后置于-20冰箱中20分钟，然后4下12000g离心10分钟。8、弃上清，将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出，加入1ml70%乙醇洗沉淀一次，4下12000g离心5-10分钟。9、吸除上清液，将管倒置于卫生纸上使液体流尽，真空干燥10分钟或室温干燥。10、将沉淀溶于20lTE缓冲液（pH8.0，含20g/mlRNaseA）中，储于-20冰箱中。注意1.提取过程应尽量保持低温。2.提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要，采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好，要将蛋白尽量除干净需多次抽提。3.沉淀DNA通常使用冰乙醇，在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全。沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积），且沉淀完全，速度快，但常把盐沉淀下来，所以多数还是用乙醇。（三）、Wizard少量DNA纯化系统Promega公司的Wizard少量DNA纯化系统可快速有效的抽提质粒DNA，整个过程只需15分钟。提取的质粒可直接用于DNA测序、酶切分析和体外转录等。该系统中所含试剂和柱子可以用于50次1-3ml质粒培养液的分离和纯化，试剂包括10ml细胞悬浮液，10ml细胞裂解液；10ml中和液，50mlWizard少量DNA纯化树脂，50ml柱洗液（使用前加95%乙醇至120ml）和50支Wizard微型柱。1、1-3ml过夜培养细胞液4下12000g离心1-2分钟。2、去除上清液，菌体细胞悬浮于200l细胞悬浮液中，充分混合，并移入eppendorf管中。3、加200l细胞裂解液，颠倒离心管数次，直到溶液变清亮。4、加200l中和液，颠倒离心管数次。5、4下12000g离心5分钟，取上清液于新的eppendorf管中。6、加1mlWizard少量DNA纯化树脂，颠倒离心管数次以充分混匀。7、取一次性注射器，取出注塞，并使注射筒与Wizard微型柱连接，用移液枪将上述混合液加入注射筒中，并用注塞轻推，使混合物进入微型柱。8、将注射器与微型柱分开，取出注塞，再将注射筒与微型柱相连，加入2ml柱洗液，并用注塞轻推，使柱洗液进入微型柱。9、取出微型柱置于eppendorf管中，离心2分钟以除去微型柱中的柱洗液。10、将微型柱放在一个新eppendorf管中，加50lTE（或水）于微型柱中，静止1分钟后，4下12000g离心20秒。11、丢弃微型柱，将eppendorf管中的质粒DNA贮于4或-20冰箱。注意树脂使用前应充分混匀，如有结晶，可将树脂用25-37水浴处理10分钟。三、质粒DNA的大量提取和纯化在制作酶谱、测定序列、制备探针等实验中需要高纯度、高浓度的质粒DNA，为此需要大量提取质粒DNA。大量提取的质粒DNA一般需进一步纯化，常用柱层析法和氯化绝梯度离心法。（一）、碱法1、取培养至对数生长后期的含pBS质粒的细菌培养液250ml，4下5000g离心15分钟，弃上清，将离心管倒置使上清液全部流尽。2、将细菌沉淀重新悬浮于50ml用冰预冷的STE中（此步可省略）。3、同步骤1方法离心以收集细菌细胞。4、将细菌沉淀物重新悬浮于5ml溶液I中，充分悬浮菌体细胞。5、加入12ml新配制的溶液，盖紧瓶盖，缓缓地颠倒离心管数次，以充分混匀内容物，冰浴10分钟。6、加9ml用冰预冷的溶液，摇动离心管数次以混匀内容物，冰上放置15分钟，此时应形成白色絮状沉淀。7、4下5000g离心15分钟。8、取上清液，加入50mlRNA酶A（10mg/ml），37水浴20分钟。9、加入等体积的饱和酚/氯仿，振荡混匀，4下12000g离心10分钟。10、取上层水相，加入等体积氯仿，振荡混匀，4下12000g离心10分钟。11、取上层水相，加入1/5体积的4mol/LNaCl和10%PEG（分子量6000），冰上放置60分钟。12、4下12000g离心15分钟，沉淀用数ml70%冰冷乙醇洗涤，4下12000g离心5分钟。13、真空抽干沉淀，溶于500mlTE或水中。注意1.提取过程中应尽量保持低温。2.加入溶液和溶液后操作应混和，切忌剧烈振荡。3.由于RNA酶A中常存在有DNA酶，利用RNA酶耐热的特性，使用时应先对该酶液进行热处理（801小时），使DNA酶失活。（二）、Wazard大量DNA纯化系统碱法大量提取DNA往往需要很长的时间.Promega公司的Wiazrd大量DNA纯化系统既简单又快速，只需要离心和真空抽干，这个系统可以从500ml培养液中在3小时以内获得1mg以上的高质量的质粒DNA（200-20000bp）。该系统不需要酚和氯仿抽提，纯化后的DNA溶于水或TE缓冲液中，不含任何盐份，可以直接用于DNA序列分析和酶切反应，也可以用于在核酸酶抑制剂（如RNasin）存在的条件下进行体外转录反应等。该系统中含有的试剂和柱子可以用于10次100-500ml质粒培养液的分离和纯化，试剂包括：150ml细胞悬浮液，150ml细胞裂解液，150ml中和液，100mlWizard大量DNA纯化树脂，125mlWizard柱子洗脱溶液和10支Wizard带有存储离心管的柱子。1、100-500ml细胞培养液置离心管中，22-25下5000g离心10分钟，所得细胞沉淀充分悬浮于细胞悬浮液中。2、加15ml细胞裂解溶液并轻轻混合，可以反复倒置混合，但不能用涡旋振荡，细胞裂解完全时，溶液会变清，这一步需要20分钟。3、加15ml中和溶液，立即反复倒置离心管数次，并使之混匀。4、14000g，22-25离心15分钟。5、小心地将上清液吸出并移至一个新离心管中。6、加0.5倍体积的异丙醇，混合均匀，14000g22-25下离心15分钟。7、弃上清，悬浮DNA沉淀于2mlTE缓冲液中。这一步中也许有的沉淀不能溶解。8、加10mlWizard大量DNA纯化树脂溶液，并涡旋混合。9、每一个样品，使用一支Wizard大量柱子，柱子的头插在真空器上（Promega产品，与此配套）。10、将树脂/DNA混合液转入柱子中，真空抽取树脂/DNA混合液。11、将树脂/DNA混合液抽干后，加13ml柱子洗脱溶液至离心管中，对管底部的树脂/DNA进行洗脱（柱子一边旋转一边加入洗脱液），并加入柱子中。12、真空抽干所加入的洗脱。13、再加12ml柱子洗脱液进柱子并抽干。14、加入5ml80%乙醇漂洗柱中的树脂，柱子真空抽干后将柱子放入用户提供的离心管中，2500rpm（1300g）离心5分钟。15、取出柱子，真空抽干5分钟，再将柱子放入系统中所提供的离心管中，2500rpm（1300g）离心5分钟。16、在柱子中加入1.5ml65-70预热过的灭菌重蒸水或TE，1分钟后2500rpm（1300g）离心柱子/离心管5分钟。17、取出柱子，离心管中溶液即为提取的质粒DNA，可以直接放在离心管中，盖上盖子，储存在4或-20备用。注意1.在使用之前，系统所提供的柱子洗脱液按1：1加入125ml95%乙醇。2.纯化树脂必须混匀后再用.（三）、Sephrose2B柱纯化质粒DNA碱法提取的质粒DNA即使用RNA酶处理，仍会含有少量RNA。当有些试验需无RNA污染的DNA制品时，则需进行进一步纯化。一般常用Sepharose2B或Sepharose4B进行纯化，该方法具有快速，条件温和，重复性好，载体物质可以再利用等优点，因而已广泛用于质粒DNA纯化。1、将Sepharose2B经含0.1%SDS的TE（pH8.0）平衡后上柱。2、将至多1ml的DNA溶液铺在Sepharase2B柱上。3、待DNA溶液完全进入柱内后立即在柱的上部连接含有0.1%SDS的TE（pH8.0）贮液瓶。4、以1ml流出液为1份进行收集。5、对每一管测定其OD260值，以确定哪些管中含有质粒DNA。通常质粒DNA在柱上流出的第一个峰中。6、合并所有含质粒的洗脱液，用等体积的酚/氯仿（1:1）抽提，4下12000g离心2分钟，将上层水相转入新管。7、加入2倍体积的冰冷无水乙醇，-20下沉淀10分钟，然后4下12000g离心10分钟，弃去上清液。8、沉淀加70%乙醇洗涤，4下12000g离心10分钟，弃去上清液。9、沉淀真空抽干，重新溶于TE或无菌水中。注意在装柱过程中，要防止柱床中出现断裂或气泡现象，要使界面保持平整。对新装成的柱，应用含0.1%SDS的TE平衡，以使柱内的凝胶均匀。编辑本段特征质粒是真核细胞细胞核外或原核生物拟核区外能够进行自主复制的遗传单位，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA）分子。现在习惯上用来专指细菌(大肠杆菌）、酵母菌和放线菌等生物中细胞核或拟核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体(Vector）。许多细菌除了拟核中的DNA外，还有大量很小的环状DNA分子，这就是质粒（plasmid）（补充：部分质粒为RNA）。质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体（episome），这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。质粒在宿主细胞体内外都可复制！目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子（简称cccDNA）。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40106以上，较小一类的相对分子质量是10106以下（少数质粒的相对分子质量介于两者之间）。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有12个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。这些质粒的复制是在寄主细胞的松弛控制之下的，每个细胞中含有10-200份拷贝，如果用一定的药物处理抑制寄主蛋白质的合成还会使质粒拷贝数增至几千份。如较早的质粒pBR322即属于松弛型质粒，要经过氯霉素处理才能达到更高拷贝数。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。编辑本段培养在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因（Tcr）和抗氨苄青霉素基因（Apr），并含有27种限制性内切酶的单一识别位点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到Hind 、Bam H I 或 Sal I切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。质粒运载体的最大插入片段约为10 kb(kb表示为千碱基对）。1973年，科学家将质粒作为基因的载体使用，为基因工程的诞生奠定了基础。最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。这种质粒常含有抗生素抗性基因，例如，卡那霉素抗性基因。pBR322质粒pBR322质粒DNA分子的长度为4363bp，此载体中有两个标记基因，一个是氨苄青霉素抗性基因（Apr），另一个是四环素抗性基因（Tetr）。现在已知pBR322DNA分子共有24种核酸内切限制酶的单一识别位点。其中7种限制酶（从12：00位置按顺时针方向）即EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、Xma和NruI的识别位点位于四环素抗性基因内部，另外有2 种限制酶即ClaI和Hind的识别位点是存在于这个基因的启动区内，在这9个限制位点上插入外源DNA都会导致tetr的失活。3种限制酶即ScaI、PvuI和PstI的识别位点位于氨苄青霉素抗性基因内，在这些位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。由pBR322质粒载体的结构可知其具有如下优点：具有较小的分子量。经验表明，为了避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂，克隆载体的分子大小最好不要超过10Kb。pBR322质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段；具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。标记基因往往可以赋予宿主细胞一种新的表型，这种转化细胞可明