DNA的溶液配制方法.doc

1.0.5mol/LEDTA 配制组分浓度： 0.5mol/l EDTA， PH=8配制量：500ml配制方法(1)称取93.06克EDTA.Na2.2H2O，置于500 ml烧杯中 (2)加入约400ml dd H2O.用热磁力搅拌器充分搅拌 (3)用NaOH调节PH值到8，约用10克固体NaOH (4)在溶液冷却后，再用NaOH调节至PH=8 (5)加dd H2O将溶液定容到500 ml (6)高温高压灭菌后，室温保存2.NaOH溶液的配制组分浓度：5 mol/l NaOH配制量：100 ml配制方法(1)称取固体NaOH20克于容器中(2)加入dd H2O定容到100 ml3.100 mmol/l Tris-HCl的配制组分浓度： mmol/l Tris-HCl， PH=6.4配制量：250 ml配制方法(1)称取3.025克Tris于250 ml烧杯中.(2)加入约200ml dd H2O充分搅拌溶解.(3)用浓盐酸调节PH值到6.4.所用浓盐酸约3 ml(4)将溶液定容至250ml(5)用棕色瓶分装于4度冰箱中(6)如使用，用水浴加热溶解.4.氯仿-异戊醇的配制：配制方法(1)简单的体积混合，既要求比例为24：1即可 (2)储存于棕色玻璃瓶子中 (3)置于4度冰箱以便日后使用5.去污剂：CTAB：可将细胞膜裂解，使DNA释放到提取液中，同时也使组织匀浆中的蛋白质变性.EDTA：能与DNase的辅助因子Mg2+结合，使DNase失去活性，不能降解从细胞中释放的DNA.6.还原剂巯基乙醇：它抑制从细胞中释放的多酚氧仿.防止植物组织发黄变褐.7.氯仿异戊醇：它可把组织匀浆中变性的蛋白质除去，将DNA与细胞中的蛋白质、碳水化合物等分开除去.8.RNase：它可去除核酸中的RNA，只留下DNA.9.硅珠悬浮液的配制（1） 称取1.2g硅珠粉，溶解于10ml无菌水中.（2） 放入4冰箱备用.（3） 使用时先涡旋使其混合均匀10. 10TE，500ml配制如下：将100mM Tris-Hcl（PH=8.0）6.057g与10mM EDTA（PH=8.0）1.8612g溶于400ddH2O中，调PH=8.0，定容到500ml。11. 1TE Buffer组成浓度：10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0配制量：500ml配制方法：量取下列溶液于500ml烧杯中 1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml 0.5M EDTA PH=8.0 1ml 向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.12. 聚丙烯酰胺凝胶电泳PAGEPAGE操作流程及注意事项：1、涂胶1）将有耳玻片（耳朝下）泡于反硅化剂中，新液25分钟，旧液30分钟.2）涂无耳正面玻片硅化剂.均匀点四滴，轻而匀的沿一个方向涂三次，静10分钟.3）到时间取出.打开通风橱风干30分钟.2、封胶1）将两玻片对贴于橡胶框中，放平，用力拧死，夹住橡胶管.2） 溶废琼脂胶，分两次：第一次50秒，第二次10-20秒，防止沸出.3） 用小细长枪头通透加胶枪头，便于加样通畅，少起气泡.4） 吸2500-3000ul液胶加速沿玻片边缘快速顺下滴，将两面玻片充分封死，防止漏胶.以水平底线面水平高于底为佳，静止凝胶15分钟.（有时可先在封口加一点TBE以润滑玻片，利于胶流下）3、灌胶1) 用长细枪头透开加胶枪头2) 从中间加入，每次不要全部打完，留一点在枪头内.防止断流而导致胶中含有气泡.3) 插梳子时两端平整，梳子紧贴玻板，梳齿头部不可有气泡.4) 拔梳子时先加一倍TBE液将梳子泡透，然后平行用力拔出.5) 在插梳子15分钟内跟踪观察，适当下按，保证孔的深度.6) 等待2小时，以便胶充分凝固.4、吹孔1） 向中间槽加入1倍粗制TBE，要淹没过内玻片约1厘米.2） 拔梳子，小心平稳，均匀平衡.3）调1000p枪到300-600ul，进行吹孔，将小孔内沉淀物吹打干净，加样中再视时吹5、加样1） 用细长专用枪加入DNA 0.5ul.2） 一手托另一臂的肘，以保证加样手不抖.3） 一定垂直加到孔中去，不脱尾，不吸水，不靠壁，干净利落.4） 加完一次.在放于桌旁的吸纸上，将细枪头上余液吸干.5） 首、中、尾各留1到2个孔，两面胶孔的Marker不完全一样，以便区分.6） 加Marker 0.15ul 一般取0.3ul每孔注如一半，可用两个孔.6、跑胶1) 向两侧槽中加入粗制TBE，至U管线处.2) 打开电源，稳压到120V3) 电泳2h左右4) 当样品跑到底部2cm处，关闭电源.7、撬玻片1）刀片不伸入过深.刀片平行于玻片，稍用力.2）将没有硅化剂的无耳玻片放于水盘中，还有梳子.3）清理琼脂胶，放于烧杯中.4）胶玻片放于盘中，银染.13. 2、TBE电泳母液（10）的配制1） 分别称取54克Tris碱，27.5克硼酸，20ml 0.5mol/EDTA（PH=8.0）2） 将各组分别加入1升烧杯中，用ddH2O定容到1升.3） 在电泳时使用1倍工作液，按1：4与水混合.4） 1倍液是为了增加电泳工作液的电流的电流量.5） 盛于玻璃瓶，在室温保存.14. AgNO3的配制量取AgNO3原液2500ul；将250ml dd H2O和2500ul AgNO3加入胶玻片上.（AgNO3原液的配制：50ml 中含AgNO3 7.5g 浓度为0.15g/ml）15溴化乙锭（10mg/ml）组分浓度 10mg/ml 溴化乙锭配制量 100ml1称取1.0g溴化乙锭，加入到200ml容器中。2加入去离子水100ml，充分搅拌数小时完全溶解溴化乙锭。3将溶液转入棕色瓶，室温避光保存。4溴化乙锭最终工作浓度为0.5g/ml。15. 20mg/ml蛋白酶K（proteinase K）：将200mg的蛋白酶L加入到9.5ml水中，轻轻摇动，直至蛋白酶K完全溶解。不要涡旋混合。加水定容到10ml，然后分装成小份贮存于-20。17.10mg/mlRnase（无DNase）（DNasefree RNase）：溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中（pH 5.0）。溶解后于水浴中煮沸15min，使DNA酶失活。用1mol/L的TrisHCl调pH至7.5，于-20贮存。（配制过程中要戴手套）16. 5mol/L氯化钠（NaCl）：溶解29.2g氯化钠于足量的水中，定容至100ml。10N氢氧化钠（NaOH）：溶解400g氢氧化钠颗粒于约0.9L水的烧杯中（磁力搅拌器搅拌），氢氧化钠完全溶解后用水定容至1L。10SDS（十二烷基硫酸钠）：称取100gSDS慢慢转移到约含0.9L的水的烧杯中，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。用水定容至1L。2mol/L山梨（糖）醇（Sorbitol）：溶解36.4g山梨（糖）醇于足量水中使终体积为100ml。100三氯乙酸（TCA）:在装有500gTCA的试剂瓶中加入100ml水，用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解。（稀释液应在临用前配制）2.5 Xgal（5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷）：溶解25mg的Xgal于1ml的二甲基甲酰胺（DMF）,用铝箔包裹装液管，贮存于-2017. DEPC（焦碳酸二乙酯）处理水加100ul DEPC 于 100ml 水中，使DEPC的体积分数为0.1。在37温浴至少12h，然后在15 psi 条件下高压灭菌20min，以使残余的DEPC失活。DEPC会与胺起反应，不可用DEPC处理Tris缓冲液。18. TE（用于悬浮和贮存DNA）成分及终浓度 配制100ml溶液各成分的用量 10mmol/L TrisHCl1mmol/L EDTA水1ml 1mol/L Tris-HCl（pH7.4-8.0，25）200ul 0.5 mol/L EDTA（pH 8.0）98.8ml19. 5Tris-硼酸（TBE）缓冲液成分及终浓度 配