活细胞分析检测技术.ppt

活细胞分析检测技术,常规染色法检测 FCM技术检测 MTT法检测 MTT法的应用,活细胞的检测,某些染料当细胞死亡时能透过变性的胞膜与解体的细胞核DNA结合，而令其着色。因而能鉴别细胞死活。,一、台盼蓝排除法,1试剂： 4台盼蓝母液：称取4g盼蓝，加少量双蒸水研磨，加水（双蒸）至100ml，离心后取上清液。 1.8氯化钠溶液。 步骤： 用前两液以1:1混合，制成2%台盼蓝液。再取1滴细胞悬液和1滴2%台盼蓝液混合，放盖片，置3分钟，镜下观察200细胞。活细胞不着色，死细胞核呈蓝色。计算百分比。,二、中性红排除法,步骤： （1）配1%中性红水溶液（双蒸水）。 （2）染前用Hanks液作10倍稀释，离心（1500转/分）7分钟，取上清为染液。 （3）将细胞悬液与染液4:1混合，混匀后加盖片静置1520分钟。镜下观察。死细胞不着色，活细胞吸收中性红液，呈红色求百分率。,三、吖啶橙（AO）荧光染色法,（1）取少量血细胞、培养细胞或其它悬液细胞，数量在110级。 （2）滴加0.01吖啶橙（Acricline Orange, AO）生理盐水液12滴，加盖片后染色5分钟。（用0.1%吖啶橙水溶液与0.1M PBS以1:9混合）。 （3）荧光显微镜下观察，采取激发滤片BG-12（或BV），阻断滤片波长515nm士者。 结果：活细胞的胞核呈黄绿色荧光，胞质呈绿色荧光，死细胞的胞核呈红色荧光。嗜中性颗粒为桔红。嗜酸和嗜碱性颗粒为鲜红色。,四、苯胺黑排除试验,苯胺黑染色液毒性小，较长时间染色也不致伤害细胞，使死细胞增多。死细胞着染苯胺黑较台盼蓝和中性红略慢，可用于鉴定细胞死活和微量细胞毒。 试剂：1%苯胺黑水溶液（过滤后用），含2.5%小牛血清的生理盐水。 操作步骤： （1）取细胞，制成15细胞/ml悬液。 （2）染前将1%苯胺黑水溶液与含血清的生理盐水作1:9混合稀释，使其成为0.1%苯胺黑盐水溶液。 （3）取0.1ml细胞悬液和0.1ml苯胺黑盐水溶液混合，置室温10分钟。 （4）取1滴染色的细胞悬液滴于载片，覆以盖片，高倍镜下观察，着染蓝黑色者为死细胞。数200细胞分别计数死、活者，计数活细胞百分比。,五、伊红丫排除试验：,试剂：生理盐水配制0.2%伊红丫溶液 操作步骤： （1）取细胞，制成15细胞/ml悬液。 （2）取0.1ml细胞悬液和0.1ml伊红丫染液混合。 （3）取1滴混合液滴于载片，加盖片后置1分钟，在高倍镜下观察，着红染色者为死细胞。数200个细胞，分别计数活、死细胞，求活细胞百分比。,六、溴化乙啶（EB）和碘化丙啶（PI）排除法,碘化丙啶（Propidium Iodine, PI）和溴化乙啶（Ethidium bromide , EB）均属啡啶类，为核酸嵌入型染料。可嵌入多核苷酸结构，与DUA双链特异性结合。活细胞胞膜可排斥这两种试剂穿透进入。而死细胞胞膜易被穿透，致使胞核着色，PI等对死活细胞的鉴别染色非常敏感，常用于FACS测定。,七、双醋酸荧光素（FDA）染色,试剂：将双醋酸荧光素（FDA）以mlg/mc溶于丙酮，分装作为保存液。可于-20下长久保存。 操作步骤； （1）用前，将保存液PBS稀释成1:400,000。 （2）将细胞滴加FDA稀释液染色 （3）将细胞标本立即置荧光显微镜下，用激发滤片蓝紫、紫外、阴隔滤片515nm观察，活细胞应呈绿色荧光。,单击显示 FCM在活细胞检测中的应用,八、测定细胞存活和增殖的MTT方法,用MTT法测定活细胞及细胞增殖，是基于黄色的MTT能被活细胞线粒体脱氢酶（如琥珀酸脱氢酶和心肌黄酶）还原成蓝色的 Formazan，从而可用比色法推测细胞浓度。死细胞或红细胞没有这种能力。甲脯产生的量与细胞数成正比，活化的细胞比静止的细胞产生更多甲脯，其最大优点是不需要任何洗涤步骤可以在酶标仪上快速分析和测定大量样品。,线粒体中的脱氢酶(如琥珀酸脱氢酶、心肌黄酶)可将四甲基偶氮唑盐(MTT)的唑环打开，生成蓝色的产物formazan。根据这个原理，Mosmann于1983年创立了MTT检测法，此法在测定细胞的存活和增殖方面非常有效，因为这种颜色的变化仅仅发生在活的细胞中，并且甲 的形成量与活细胞数和功能状态是成比例的。目前MTT测定法已经广泛地应用于多种生长因子如表皮生长因子、肿瘤坏死因子、白细胞介素-2等的检测工作中。,MTT测定法方法,对数生长期细胞按一定浓度接种100 l到96孔培养板(Costar)，设5个重复孔，空白为不含细胞的完全培养基，阴性对照为空白培养基及细胞。加入一定数量的MTT于孔中，置37、5% CO2 培养箱中继续培养一定时间。然后每孔加入formazan 溶解液，其中短时溶解液以加样器混合，放置一定时间。肉眼观察蛋白质絮状沉淀情况，倒置显微镜下观察针状染料结晶的情况并判断其溶解程度。用全自动酶标仪(BIO-RAD Model 450)测定其D值，测定波长为570 nm，参考波长为655 nm。,MTT测定已有效地应用于生物学和医学的许多研究之中，如淋巴毒素，