SOD、POD、CAT、MDA和可溶性蛋白的测定.doc

SOD、POD、MDA、可溶性蛋白、脯氨酸、电导率、可溶性糖的测定一、磷酸缓冲液的配制：A液：0.2M的KH2PO4溶液 称取分析纯KH2PO427.216克，用蒸馏水定容至1000毫升。B液：0.2M的K2HPO4溶液 称取分析纯K2HPO43H2O45.644克，用蒸馏水定容至1000毫升。或（A液：0.2M的NaH2PO4溶液 称取分析纯NaH2PO42H2O 31.21克，用蒸馏水定容至1000毫升。B液：0.2M的Na2HPO4溶液 称取分析纯Na2HPO412H2O 71.64克，用蒸馏水定容至1000毫升。）二、 酶液的制备：称取0.5g样品放入研钵中，加2毫升 0.05M PH=7.8的磷酸缓冲液及少量石英砂，冰浴研磨，匀浆倒入10毫升离心管中，再加3毫升磷酸缓冲液冲洗研钵，4冷冻离心20分钟（若做可溶性蛋白，转速为4000转/分钟，若不做，则10000转/分钟），上清液（酶液）倒入试管中，置于040C下保存待用。三、 SOD的测定：1.SOD反应液的配制： 母液的配制：（1）0. 05M 磷酸缓冲液（PH=7.8）：A液21.25ml+B液228.25ml定容至1000ml; (2) 130mM Met(甲硫氨酸)：取1.9399克Met 用磷酸缓冲液定容至100ml；棕色瓶避光4保存。 （3）750M四氮唑蓝（NBT）：取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100ml；棕色瓶避光4保存。 (4) 100M EDTA-Na2: 取0.0372g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml，棕色瓶避光保存； (5) 20M FD (核黄素): 0.00753gFD用蒸馏水定容至1000ml。随用随配。棕色瓶避光保存；SOD反应混液：磷酸缓冲液：Met：NBT：EDTA-Na2：H2O的比例为15：3：3：3：2.5，按母液顺序配制，然后依次加入核黄素和酶液。2.SOD的测定：取型号相同的试管，吸取20微升的酶液，加入3毫升，4000Lux照光30分钟，同时取两支试管，一支做对照，一支做空白（对照、空白不加酶液，以缓冲液代替）；空白置暗处，对照（CK）与酶液同置于4000Lux条件下照光30分钟，反应后遮光保存，以空白调零，560nm比色。每个试验重复三次（3试验+3空白+3对照）3.结果计算 SOD总活性（吸光度/gFW）=（ACKAE）V（W0.5 VtACK）单位：NBT光还原50%为单位 SOD 比活性（酶单位/mg蛋白）= SOD总活性/蛋白质浓度SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g FW）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积；Vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。注意：1.要10ml离心管，不要大试管，否则枪头够不着，不好吸； 2提取液预冷； 3. 测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量 4.照光时间和强度严格控制，试管要透明，质地均一。四、POD的测定：1. 0.1M PH6.0磷酸缓冲液的配制：A液219.25+B液30.75，定容至1000毫升；2. POD反应液的配制：0.1M PH 6.0的磷酸缓冲液50毫升于烧杯中，加入愈创木酚28微升，磁力搅拌器加热搅拌使之完全溶解，冷却后加入30%H2O219微升混合，保存于冰箱中。3. POD的测定：20微升酶液+3毫升反应液于比色皿中，以PBS为对照调零，在470nm下每隔1分钟读数一次，共读三次，以每分钟吸光度变化值（A470/minmg pr或A470/ mgFW）表示酶活力的大小。结果计算：POD活性POD=（A470Vt）/（WVs0.01t） (u/g min) A470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；Vt为提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时取用酶液体积（ml）五、MDA的测定： 1.MDA反应液的配置：0.6克TBA（硫代巴比妥酸），先用少量1MNaOH溶解，用10%TCA（三氯乙酸）定容至100毫升。1. MDA的测定：1毫升酶液+2毫升0.6%的TBA，封口沸水浴15分钟，迅速冷却后1500转10min离心，取上清液，在600、532、450nm 三个波长下比色。2.结果计算：MDA浓度C (umol/L)=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450MDA含量(umol/g FW)=CV/W V为提取液体积(ml)，W为样品鲜重(g)六、可溶性蛋白的测定反应液配制：0.1克G-250溶于50毫升90%乙醇中，加入100毫升85%磷酸，定容至1000毫升，在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。100g/ml牛血清蛋白（BSA）标准溶液: 10mg BSA,0.9氯化钠溶解，定容至100ml测定：20微升酶液+80l，0.05M，pH7.8磷酸缓冲液+2.9毫升G-250放置2分钟，595纳米比色，同时做空白（100微升缓冲液+3毫升G-250为对照调零）。结果计算：可溶性蛋白可溶性蛋白质含量（mg/g）=(CVT)/(WVS1000)C为标准曲线查得的蛋白质含量（g）；VT为提取液总体积（稀释后的体积ml）；VS为测定时所用提取液体积（ml，20l）；W为样品鲜重（g） 七、脯氨酸含量的测定试剂配制：0.3%磺基水杨酸：3克磺基水杨酸，定容至100毫升：2.5%酸性茚三酮（现配）：60 ml冰醋酸、16.4 ml磷酸加蒸馏水定容至100 ml，再加入2.5 g茚三酮，溶解后避光保存标准脯氨酸液：25mg脯氨酸定容至100nl。测定：0.3克叶片，加入5毫升磺基水杨酸研磨提取，倒入离心管，沸水浴10分钟，冷却3000转离心10min，吸取滤液2毫升（同时作空白，吸取2毫升蒸馏水）、2毫升冰醋酸和3毫升酸性茚三酮，沸水浴40分钟，冷却，加入5毫升甲苯，充分振荡，静止分层，取上层甲苯溶液于比色皿中，以甲苯为空白对照，520纳米下比色。结果计算：脯氨酸含量（g/g鲜重）=CV/Va/W八、植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）（1）取新鲜叶片或根系（不能萎蔫）0.3g，用自来水冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几遍后用吸水纸吸干水分；（2）样品剪碎（也可打孔取样）放入试管（或15ml大离心管）中，加10ml去离子水，在室温下放置3h，期间多次摇动，使叶片充分吸水后测定溶液电导率(R1)；（3）再放入恒温水浴锅中在100沸水浴中煮20min以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温后测定溶液电导率(R2)；（4）用公式计算质膜相对透性（用相对电导率表示）：相对电导率（%）=R1/R2100%还可以计算植株伤害程度： 伤害率=（处理电导率对照电导率）/（煮沸电导率对照电导率）100%九、可溶性糖105杀青30 min，85烘干至恒重用于可溶性糖的测定 将处理后的叶片称取0.02 g于刻度试管中，加