实验二酶活力测定方法的研究.docx

实验二 酶活力测定方法以及水溶性蛋白含量的测定一 研究背景及目的酶是催化生物体内生化反应的重要成分，它可以在常温常压下非常高效的催化化学反应。对于酶，我们最关注的的就是它的活性。在实验中，当我们做酶实验时，只有知道自己在做的酶是有活性的，我们后续的工作才有可能继续。在实验室购买特定的酶时，我们关注的不是购买的重量，而是购买到的酶活性有多少，能催化多少摩尔的化学反应。掌握酶催化的活性也有利于我们估计反应需要进行的时间。甚至在我们改造酶结构的时候，也许要一个标准证明我们的改造是有效的。这一切，都需要我们能够测定酶的活性。本实验的目的就是设计实验，合理的测定酶活力。体会在不同的酶中，具体的实验设计步骤是否相同；学会根据不同酶的特点，设计其酶活力的测定方法；探究酶活力测定的基本原则。二 原理淀粉酶是水解淀粉的糖苷键的一类酶的总称。禾谷类种子的萌发时可快速将淀粉转变成葡萄糖，由此我们推断禾谷类种子中存在不止一种淀粉酶，一种是我们熟知的-淀粉酶，它可从淀粉还原性末端切掉葡萄糖。另一种-淀粉酶它既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地随机切断糖链内部的-1，4-链。休眠的种子中就只有-淀粉酶的存在，-淀粉酶是在和粽子萌发的过程中形成的。-淀粉酶和-淀粉酶各有其一定的特性。-淀粉酶不耐热，在高温下容易发生钝化，而-淀粉酶不耐酸，在pH 3.6以下时发生钝化。在萌发的种子中，这两种淀粉酶同时存在。想要测定其中一种酶的活性，就要设法钝化另一种酶。 该实验的总体思路为精确控制酶促反应的条件，保持其处于最适条件，测定酶促反应的初速度来表示酶的活力。通过3,5二硝基水杨酸比色法确定催化产麦芽糖的含量。三 仪器与试剂1.仪器：低速离心机（飞鸽牌，TDL-40B，上海安亭科学仪器厂）722分光光度计（上海分析仪器总厂）；40水浴锅（DK-S24，上海精宏实验设备有限公司）；70水浴锅（电热恒温水浴锅，天津市中环实验电炉有限公司）；药物天平（HCTP12B1，北京宣武天平厂制）；微量可调手动移液器(大龙牌)；具塞试管（15ml）;研钵；50ml容量瓶；100ml容量瓶。2.试剂：pH 5.6的柠檬酸缓冲液；3,5-二硝基水杨酸溶液;麦芽糖标准液（1mg/ml）；0.4M NaOH；试剂甲；试剂乙；牛血清蛋白标准液（250g/ml）3.材料：萌发的小麦种子（苗长约1cm）四 实验步骤（1）.酶液的制备（蒸馏水浸提）：称取2克萌发的小麦种子（芽长一厘米左右），置于研钵中加少量石英砂，蒸馏水作为匀浆液，研磨成匀浆，转移到50ml容量瓶中至40ml左右，浸提15-20分钟，用蒸馏水定容到刻度，混匀后3500转/分离心20分钟，取出上清液备用（初始酶液）。（2）淀粉酶活性的测定： 按下表进行操作：试剂 试管编号1234测定管对照管酶提取液各1ml，在70水浴中准确加热15min（使-淀粉酶钝化），取出后立即在冰浴中冷却pH 5.6的柠檬酸缓冲液各1ml，然后再40恒温水浴中准确保温15min0.4M NaOH溶液各4ml 将试管至于40恒温箱水浴15min淀粉溶液各2ml，混匀，立即置于40水浴中准确计时5min0.4M NaOH溶液加入4ml 各取1ml反应以后的溶液，放入15ml具塞刻度试管中3,5-二硝基水杨酸各1ml，摇匀，在沸水浴中准确保温5min，取出冷却蒸馏水将每支试管中的溶液稀释到15ml，混匀（3）-淀粉酶及-淀粉酶总活性的测定：取酶液5ml，放入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度。按下表进行操作：试剂 试管编号1234测定管对照管酶提取液、pH 5.6的柠檬酸缓冲液每个试管，两种液体各1ml，在40恒温水浴中准确保温15min0.4M NaOH溶液各4ml淀粉溶液各2ml，混匀，立即置于40水浴中准确计时5min0.4M NaOH溶液加入4ml 各取1ml反应以后的溶液，放入15ml具塞刻度试管中3,5-二硝基水杨酸各1ml，摇匀，在沸水浴中准确保温5min，取出冷却蒸馏水将每支试管中的溶液稀释到15ml，混匀（4）麦芽糖的测定：a.标准曲线的制作：管号1234567麦芽糖标准液（ml）00.10.30.50.70.91.0蒸馏水（ml）1.00.90.70.50.30.103,5-二硝基水杨酸各1ml,摇匀，沸水浴中保持5min 取出冷却后，蒸馏水稀释到15ml。用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录消光值，根据标准曲线，进行结果计算。b.样品的测定：取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中的溶液各1毫升，分别放入15毫升具塞刻度管中，在加入1毫升，3,5-二硝基水杨酸试剂混匀，置于沸水浴中准确煮沸5分钟，取出冷却，用蒸馏水稀释至15毫升，混匀，用分光光度计在520nm波长下进行比色，记录消光值，根据标准曲线，进行结果计算。注意：标准曲线的制作和样品的测定应同时进行，即各管应同时放入和取出沸水浴。（5） 水溶性蛋白的测定a.标准曲线的测定：按下表配置溶液并操作。管号1234567标准BSA/ml00.40.81.21.62.02.4蒸馏水/ml2.52.11.71.30.90.50.1加入试剂甲5ml，室温下放置10min(创造碱性条件)加入试剂乙0.5ml后立即混匀，室温下放置30min（显色反应）用分光光度计在650nm波长下进行比色。以OD650为纵坐标，标准BSA浓度为横坐标作图。b.样品的测定：先进行预实验，以确定合适的待测液稀释倍数。可选择两个稀释浓度进行测定，参考下表确定合理的稀释倍数。（表源于实验一） 稀释倍数确定后选择2个稀释浓度进行测量即可。注意：标准曲线的制作和样品的测定应同时进行。五 数据整理与结果计算淀粉酶活力测定（1）麦芽糖标准曲线的制作 标准麦芽糖溶液（ml）00.10.30.50.70.91OD5200.0000.0510.1730.2980.4360.5610.563（2）-淀粉酶活性的测定试管编号1234对照管实验组OD5200.3680.3700.5860.590麦芽糖浓度（mg/ml）408.89411.11651.11655.56平均麦芽糖浓度（mg/ml）410.00653.34（3）-及-淀粉酶总活性的测定试管编号5678对照管实验管OD5200.2040.2040.3540.351麦芽糖浓度（mg/ml）226.67221.11393.33390.00平均麦芽糖浓度（mg/ml）224.81391.67水溶性蛋白质含量的测定（1） 预实验：管号12345待测液/ml00.50.51.01.0蒸馏水/ml2.52.02.01.51.5OD6500.000.8100.8101.3041.244（2）测定待测液蛋白质含量：由于Folin-酚法测蛋白含量，吸光度在0.4左右是最为准确的。所以，确定的待测液稀释范围：预实验2、3管稀释范围的一半。后四个管加入待测液，计算平均值。标准BSA/ml00.40.81.21.62.02.4OD6500.0000.2160.4000.5600.6950.8010.914 测定组待测液0.20.20.30.3稀释倍数404026.6726.67OD6500.393 0.389 0.530 0.529 蛋白质浓度（g/ml）29.77 29.47 40.15 40.08 平均值（g/ml）29.6240.11原浓度（g/ml）1127.27本次试验计算淀粉酶活力以及比活的公式是：-淀粉酶活性（毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1）A-A样品稀释总体积样品重g5（U）（-）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1）B-B样品稀释总体积样品重g5（U）：淀粉酶测定管中的麦芽糖浓度；：淀粉酶对照管中的麦芽糖浓度；：及淀粉酶总活性测定管中的麦芽糖浓度；B ：及淀粉酶总活性对照管中的麦芽糖浓度酶的比活=淀粉酶的活性蛋白质的总含量-淀粉酶活性（毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1）9.7336（-）淀粉酶总活性（毫克麦芽糖克-1鲜重分钟-1）266.976-淀粉酶比活（克-1鲜重分钟-1）0.19467（-）淀粉酶总比活（克-1鲜重分钟-1）5.33952六.思考题及质疑:1.设计总结：设计蛋白质实验时，我才发现设计实验是什么心情。这个简单的不叫设计的设计都让我如此犹豫，可以想象设计更复杂的实验将是什么心情。主要的纠结之处就是一开始的预实验要不要测定标准曲线，虽然在此之前，我自认为充分了解了标准曲线的作用，为什么要每次都测定，为什么要同时测定。但是，当有人提出质疑的时候还是经过了思想斗争决定下来的。说白了，是对自己学的没有信心，原因是只听到老师的解释，老师的结论，没有自己认真想一想，到底是不是这么回事？用自己的逻辑去推导一遍。由此一件小事，就能知道我平时的学习还是知之为何，不知为何的水平。虽然周五的第二次试验还是较为成功的。本次试验过后还是打击不小，看到了自己真实水平，离科研还太远了。2. 从酶活测定的相关实验结果判断本次实验设计的酶活测定样品稀释倍数是否合理？为什么？ 合理的，因为在合适的时间，酶催化产生的麦芽糖含量通过稀释，正好能够在朗伯比尔定律要求的范围只内。稀释过高过低都不利于我们的数据准确性。但是，-淀粉酶催化产生的麦芽糖已经非常逼近标准曲线边缘。3.众多测定淀粉酶活力的实验设计中一般均是采取钝化b-淀粉酶的活力而测a-淀粉酶和测总酶活力的策略，为何不采取钝化a-淀粉酶活力去测b-淀粉酶活力呢？这种设计思路说明什麽？ 首先，溶液的pH与体积有关，当需要对溶液进行稀释时，不易控制。其次，控制pH的方法较为复杂（用pH剂），不符合步骤最简，最少原则。4a-淀粉酶活性测定时70水浴为何要严格保温15分钟？保温后为什么要立即于冰浴中骤冷？而经如此处理，为什么在随后的40温浴和酶促反应中就能保证b-淀粉酶不会再参与催化反应？-淀粉酶不耐高温，严格保温15分钟是为了使-淀粉酶钝化，而保持-淀粉酶的活性正常。若时间过短，则可能导致-淀粉酶钝化不彻底，若时间过长则可能影响-淀粉酶的活性。骤冷的目的在于使得-淀粉酶的不能在短时间内复性，给酶促反应提供较长的时间。5酶的最适反应温度（一般都是生理温度）和最适保存温度（一般0以下）为什么不一样？而这两个状态都是需要维护酶的空间结构。 最适反应温度是酶活性最强的温度，也就是说，此时酶的构型最灵活，某种程度讲，也是最不稳定的。这并不适于保存酶，为了保持酶活性不减，即保持酶结构稳定，一般的处理方式就是低温（实验室中比较贵重的酶都是在冰箱中保存），使其钝化而不至于结构改变，从而能够保持活性。6为什么3，5-二硝基水杨酸与还原糖的反应要先沸水浴然后再稀释测定？化学反应的完全程度一般是与浓度相关的。浓度越大，反应越完全。因为此时需要发生反应的分子之间距离较小，接触机会大，反应更彻底。而比色法要求的溶液颜色深度不能太大，所以就采取先在高浓度下使反应发生，然后再稀释至比色法所允许的浓度范围来测定麦芽糖的含量，使得结果更为准确。7. 在设计酶活测定的实验时，要求酶促反应初速度对底物浓度的小量变化不敏感，具体要求为：在底物浓度有10%的变化幅度范围内，而所测初速度的变化幅度小于1%。则【S】/KM应该大于多少才能保证这一点？（设定为米氏酶） 8.转氨酶在细胞内的作用及生理意义？细胞内有众多的转氨酶，但相关研究及医学临床应用中却几乎都是只检测谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）的活力，而极少测定其它转氨酶活力，你推测可能的原因会是什么？为什么？谷氨酸：生物机体内氮代谢的基本氨基酸之一，在代谢上具有重要意义。L谷氨酸是蛋白质的主要构成成分，谷氨酸盐在自然界普遍存在的。转氨酶:催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶,参与氨基酸的分解和合成。谷丙转氨酶（GPT）和谷草转氨酶（GOT）是最重要的两种。GPT催化谷氨酸与丙酮酸之间的转氨作用，丙酮酸是糖酵解的最终产物，可转化成多种物质继续供能；GOT是催化谷氨酸与草酰乙酸之间的转氨作用，草酰乙酸是TCA循环中重要的一环，还是糖异生的中间产物。它们在能量代谢中起重要作用，也是人体最活跃的转氨酶。9、转氨酶催化的是双底物可逆反应，根据酶活力测定的总体思路，要保证测定反应的初速度，根据实验指导所提供的资料，你认为是否保证了这一点？是如何保证的？ 保证了初速度。因为实验设计的时候是使氨基酸的浓度大于-酮酸的浓度，这就保证了反应会向转氨基方向进行。另外，试验中也保证了底物浓度远远大于酶的浓度，这样也就保证了反应的方向是沿着酶促反应生成底物的方向进行的。10、指导所提供的两个转氨酶活力测定实验方案，设计的酶促反应时间是多少？终止酶促反应用的什么试剂？与淀粉酶活力测定规定的酶促反应时间相比是否有差异？差异可能的原因你分析认为会是因为什么？反应时间设计的是10min，终止酶促反应所用的试剂是0.4M NaOH溶液。相比淀粉酶的测定反应时间较长，可能是因为两种转氨酶的催化活性相比淀粉酶较低，所以需要更长的反应时间，使得生成足够多的产物来进行测定。还有一种可能就是，我们使用的材料中转氨酶的绝对含量要少于淀粉酶的绝对含量。这一点是好理解的，毕竟相比于氮代谢，生命的碳代谢进行的更为活跃，总量更大。六 实验小结这次试验做了两回。第一次酶活测定了两次，头一次是因为预习报告上的一句话：测定总酶活之前要先稀释。没有看到，所以失败了。但是，当时还有一个错误我们并没有仔细检查数据，单纯的以为只有这一个地方出错了。实际上麦芽糖的标准溶液的曲线也过于低，原因是我的同伴把标准曲线的配置表抄错了，