基因工程复习资料U版.doc

阿忧专利 拒绝盗版名词解释10*2 是非10*2 选择10*2 简答5*5 论述 1*15 18日14:00-16:00 教2101基因工程：是指核酸分子经体外加工，将不同来源的基因按照设计组成新的基因组，再把它引入宿主细胞中，使之表达的技术。简单地可以归结为：通过体外基因操作，引起生物遗传性状改变的技术。基因工程应用在植物方面的就称为植物基因工程。载体：把一个有用的目的基因DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具叫载体。目前使用的载体主要有四大类：质粒，噬菌体、单链噬菌体和粘粒。质粒的拷贝数：指质粒在复制时与宿主的繁殖相结合，致使每个细胞中只有一个或几个质粒，质粒在细胞中的拷贝数为10200个。转化：是指将外源DNA引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。感受态细胞：是指具有吸收裸DNA分子能力的细胞，通常经一系列的处理方式 可使得细胞膜的通透性发生改变，而使细胞成为感受态细胞。受体细胞：是指转化的对象，接受重组DNA的细胞，通常要求有高转化率，能保持质粒稳定，属某营养缺陷型，具其他选择标记等条件。基因组文库：是指把某种细胞的整个基因组DNA，按一定长短要求，酶解成若干片段，在与合适的载体分子重组，引入相应细胞，形成一大批含重组DNA分子的细胞克隆群体，该克隆群体即为基因组文库。cDNA文库：是指以生物体的RNA(通常是mRNA)为模板，经反转录形成cDNA分子，予以克隆形成的一种基因文库。S-D序列：细菌mRNA翻译起点上游与16SrRNA相结合的序列。退火：是指PCR等核酸分子重组过程中，即DNA加热变性后逐渐冷却的过程，在分子遗传中，应用于不同来源的核酸分子形成杂合体的研究中。转化外源基因的稳定表达:是指外源基因整合到核基因组DNA分子上，并能稳定遗传的外源基因的表达。分子标记:可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白。包括蛋白质标记和DNA标记。转座子基因工程的研究内容1特定目的基因的分离或合成2构建重组DNA分子3转化宿主细胞4筛选重组DNA菌落5目的基因的有效表达基因工程的基本操作程序主要包括五个方面的内容：1、 带有目的基因的DNA片段的制备2、 DNA片段与载体DNA体外重组3、 DNA重组体转入受体细胞4、 重组体克隆的筛选与鉴定5、 外源基因的表达制备外源DNA片段可以有以下5个途径：第一， 从生物基因组群体中分离目的基因（鸟枪法即限制性内切酶法、反转录法）第二， 人工合成第三， PCR反应合成DNA第四， mRNA差异显示法获得目的基因第五， 机械的方法如超声波把基因组打成片段。工具酶：基因工程中进行基因的剪切、拼接、组合所需的酶统称为工具酶 工具酶按功能分为剪切酶、修饰酶、连接酶限制性内切酶的特点：只降解双链DNA分子，而不切单链DNA，反应时需金属Mg2+离子等。影响限制性内切酶活性的主要因素：阿忧专利 拒绝盗版1. 酶的纯度2. DNA样品的纯度3. DNA的甲基化程度4. 酶切反应的温度与时间5. DNA分子的构型6. 反应缓冲液常用的聚合酶有三种：即依赖DNA的DNA聚合酶；依赖RNA的DNA聚合酶；依赖DNA的RNA聚合酶。理想的基因工程载体的要求：1能在受体细胞中独立繁殖2容易导入受体细胞3有限制性内切酶位点4分子量小，多拷贝易于分离、纯化、导入5有容易识别的筛选标记，载体的种类：质粒、噬菌体、病毒、粘粒质粒的三种构型：共价闭合环状DNA（cccDNA)、开环DNA（ocDNA)、线形DNA（LDNA)质粒空间构型与电泳速率：同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同电泳顺序(快到慢)1 SC 2L 3 OC为什么要质粒质粒载体的构建？1、天然质粒的局限性（1）分子量大，拷贝数低（2）筛选标志不理想质粒载体必须具备的基本条件（1）具有复制起点（ORI）（2）具有抗菌素抗性基因（3）若干限制性内切酶的单一位点（4）具有较小的分子质量和较高的拷贝数质粒载体是以PBR322为基础进行构建的pBR322的优点1）双抗菌素抗性选择标记没有获得载体的寄主细胞，在Amp或Tet中都死亡获得载体的寄主细胞，在Amp或Tet其中之一中死亡2）分子小，克隆能力大载体越小越好，大于10kb的DNA在纯化过程中容易断裂3）高拷贝数4）安全粘粒载体的特点：1.具有l噬菌体的特性，在寄主细胞内形成环化DNA2.具有质粒载体的特性，能象质粒一样复制。3.方便的选择4.高容量的克隆能力大分子DNA克隆载体：一、酵母人工染色体YACYAC载体的基因结构（1） 着丝粒区（CEN）主管染色体在细胞分裂过程中正确地分配到子细胞中（2） 端粒（TEL）对于染色体的稳定及端粒复制具有重要意义（3） 复制起点（ORI）YAC可容纳更长的DNA片段，用较少的克隆就可以包含特定的基因组全部序列并由此保持基因特定的完整性，有利于制作物理图谱。构建时在细菌中操作。细菌人工染色体（BAC）是以细菌F因子为基础构建的细菌克隆载体。F质粒的特点：1）单拷贝复制2）克隆容量可达300kb3）比较稳定4）便于提纯核酸的提取与纯化的三大步骤:1. 细胞破碎2. 去除与核酸结合的蛋白质及多糖脂等杂质,3. 除去其他杂质核酸CTAB法是种去污剂,可溶解细胞膜,与核酸结合形成复合物,在高盐溶液中可溶,低盐浓度时可沉淀,通过离心将CTAB与核酸的复合物同蛋白质多糖类物质分开,然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液,再加入乙醇使核酸沉淀,CTAB溶于乙醇.SDS法的基本原理：利用高浓度SDS在较高温度（55-65）条件下裂解细胞，使染色体离析、蛋白质变性，释放出核酸，然后用提高盐浓度及降低温度的做法使蛋白质及多糖沉淀（通常是加入5M的乙酸钾于冰上保温，在低温条件下乙酸钾与蛋白质及多糖结合成不溶物）。离心除去沉淀后，对上清液中的核酸进行反复抽提去除蛋白质，用乙醇沉淀水相中的核酸。方法：CTAB法、异硫氢酸胍、Trizol法RNA提取的关键因素是尽量减少的污染。并设法抑制RNA酶的活性。污染来源：所有的器皿、所用的溶液、实验人员的手及飞沫。核酸的凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳与聚丙烯酰胺凝胶电泳的区别：1.聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高2.聚丙烯酰胺凝胶比琼脂糖凝胶的载样量大，3.聚丙烯酰胺凝胶回收的DNA样品纯度极高可用于要求非常严格的试验4在聚丙烯酰胺凝胶分子的交联网状结构中，带有酰胺侧链的C-C聚合物不带或少带离子侧链基团5聚丙烯酰胺凝胶无色透明，比琼脂糖凝胶的紫外线吸收率低，抗腐蚀性强，机械强度高，韧性好影响凝胶电泳的因素：1酶切效果即DNA分子大小：分子量大的，DNA迁移率小2DNA分子构象：线性分子与环状DNA分子的迁移率不同3DNA分子所带的电荷数：所带电荷数多，迁移快4缓冲液的极性5所采用电压的大小6染色剂的添加量7凝胶的浓度和厚度Southern 印迹杂交：DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。Northern 印迹杂交：检测RNA（主要是mRNA）的方法与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性Western 杂交印迹法：检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法。探针：指经放射性或非放射性等物质标记的已知或特定的DNA或RNA序列。根据探针的来源及核酸性质不同：DNA探针、RNA探针、cDNA 探针，及寡核苷酸探针探针的标记方法：（1）DNA缺口平移法 （2）DNA随机引物法 （3）聚合酶链反应标记法构建基因文库所使用的载体主要有：噬菌体、粘粒(菌落)、质粒、酵母人工染色体 基因组文库与cDNA文库的区别：从定义上看，基因组文库指某种细胞内的某个基因组按一定长短要求被酶切成若干片段，与合适的载体分子重组，引入相应的细胞，形成的一大批含DNA重组体的细胞克隆群体，这样的细胞克隆群体称为基因组文库cDNA文库指以生物体RNA通常是mRNA为模板，经逆转录酶作用形成cDNA再予以克隆而形成的一种基因文库。就真核生物的基因而言，mRNA前体经加工，去除内含子，且加尾polyA成为成熟mRNA，故cDNA文库与基因组文库对照可用于研究内含子在基因中的位置及功能。PCR的原理 ：PCR是指聚合酶链式反应，又称体外的基因扩增。其原理是在一种高温DNA聚合酶的作用下通过引物的模板DNA的作用来扩增DNA。模板可以是基因组DNA，单链DNA，克隆的DNA序列或RNA(通过反转录成cDNA)。PCR的三个基本反应步骤：变性-退火-延伸模板的变性：加热变性，使DNA双链解离为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； 模板与引物的退火（复性）：温度降至温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合 引物的延伸： DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板 PCR反应的五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ PCR的污染原因:1标本间交叉污染2PCR试剂的污染3PCR扩增产物污染4实验室中克隆质粒的污染PCR的种类：1) 反向PCR（Inverse PCR），反向PCR的目的在于扩增一段已知序列旁侧的DNA，也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA（见下图22-2）。反向PCR可用于研究与已知DNA区段相连接的未知染色体序列，因此又可称为染色体缓移或染色体步移。2) 跳跃PCR（Jumping PCR），跳跃PCR在扩增极度退化的DNA时，特别有用。它有可能跳出DNA断裂处，合成完整的所需片段。3) 复合PCR（Multiplex PCR）用多对引物同时扩增几条DNA片段的方法称为复合PCR。4) 锚式PCR（Anchored PCR），只有当要扩增的序列（作为第一个起始位点）是已知的条件下，才可应用锚式PCR。需要将已知的目标序列连接到另一个已知序列的一端，以后者作为第二个合成起始位点。5) RTPCR(反转录PCR)，RTPCR（Reverse transcribed PCR）是以RNA为模板，通过反转录酶把RNA反转录成cDNA，然后在TaqDNA聚合酶的作用下进行DNA扩增。6) RAPDPCR，也被叫做Ap-PCR(Arbitrarily Primed-PCR)，是一种利用随机序列寡核苷酸为引物的PCR操作技术。一般选用随机合成的10核苷酸引物，内含5080%（GC）并防止回文结构。7) PCRSouthern杂交，将PCR产物琼脂糖胶电泳后，转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再进行常规的Southern杂交反应。8) 不对称PCR（Asymmetric PCR），不对称PCR的基本原理是采用不等量的一对引物产生大量的单链DNA（ss-DNA）9) 定量PCRPCR在基础研究方面的应用：1. 特定片段的获得及其克隆2. 引入定点突变，微小缺失或插入3. 从少量mRNA制备cDNA文库4. 染色体步查(基因组测序)5. 基因功能和表达调控研究6. 特定片段的获得及其克隆PCR在医学方面的应用：1.遗传病的基因诊断a.限制性片段长度多态性（RFLP）连续分析b.根据特异性的扩增带判断遗传病c.PCR结合特异性寡核苷酸探针进行诊断 2.在肿瘤研究中的应用3.检测病原体4.在基因分型中的应用5.法医物证检测 理想的分子标记： 1.高多态性 2.共显性遗传 3.能明确辨别等位基因 4.遍布整个基因组 5.无基因多效性 6.检测手段简单快速 7.成本低廉 8.重复性好分子标记的类型：(1)以分子杂交为核心的分子标记：限制性片段长度多态性RFLP、可变数目串联重复位点VNTR(2)以PCR为基础的分子标记：随机扩增多态DNA 即RAPD、扩增片段长度多态性（AFLP）、简单重复序列多态性（SSR）、单链构型多态性（SSCP）(3)以DNA序列为核心的分子标记：转录间隔区（ITS）、单核苷酸多态性（SNP）植物外源基因转化的方法：载体介导法(1) 农杆菌介导法 、(2) 病毒介导法直接基因转化法(1) 化学诱导法、(2) 物理诱导法种质系统转化法农杆菌介导的基因转化方法的基本原理及其应用：农杆菌转化植物细胞是通过将其体内的一段DNA(T-DNA)转移到被侵染的植物细胞而实现的。参与该过程的遗传物质基础主要有三个方面：(1)被转移的T-DNA。 (2)位于同一质粒(Ti或Ri)上，用于编码T-DNA加工、转移及整合等功能蛋白的致毒区(Vir区)。 (3)位于细菌染色体上的与农杆菌吸附植物细胞壁有关的基因(chv)。转化的特点：农杆菌介导的转化属于一种纯生物学的方法，其精巧的转基因系统使其与其它理化方法聚乙二醇(PEG)、电激、基因枪等相比，具有明显的优点：(1) 转化频率高。T-DNA链在转移过程中受蛋白质(VirE2、VirD2)的保护及定向作用，使得T-DNA免受核酸酶的降解，而完整、准确地进入细胞核，转化效率较高。其它理化方法由于DNA以裸露的方式进入植物细胞，易受细胞内核酸酶的破坏，以致转化频率低。 (2) 导入植物细胞的片段确切，且能导入大片段的DNA。Ti质粒上位于两个边界序列间的外源基因片段均会转移到植物细胞，可避免其它理化方法那样将非目的基因片段(用于在细菌体内复制的DNA骨架)导入植物细胞而造成潜在的遗传物质扩散的危险。(3) 导入基因拷贝数低，表达效果好。农杆菌介导的转化向植物细胞导入的外源基因拷贝数大多只有13个，而其它方法往往几十个拷贝，大量拷贝数会导致转基因的沉默。(4) 农杆菌转化方法使用的技术、仪器简单。这种方法可避免进行原生质体培养等难度高、周期长的弊端，也不象基因枪法需要昂贵的费用。转化方法的适用范围及局限性：与其它方法相比，前人认为农杆菌介导的转化的不足之处是宿主范围较小。这一点以前主要是根据农杆菌能否在某种植物上诱瘤决定的。现有研究表明，由于植物的种类不同，构成其细胞的生理状态和诱瘤的条件也不一样，所以能否诱瘤及诱瘤的大小并不能说明农杆菌的寄主特性。事实上，农杆菌能侵染许多包括重要禾本科植物在内的单子叶植物，水稻的高频率转化更使人们认识到农杆菌的寄主范围不只局限于双子叶植物。另一方面，由于农杆菌是一个生物有机体，其功能受环境及其作用对象的影响比其它理化方法复杂得多，以致目前能得到转化株的往往只是某一科的一种或几种植物。农杆菌介导转化的这种现状使得我们有必要进一步探讨影响其转化的因素。从已有转化研究看，农杆菌的菌种、vir基因的诱导、外植体的选择及植株再生频率、转化体的筛选方式均会影响到转化效率。基因枪法(particle gun)又称微弹轰击法(microprojecctile bombarbment, particle bombardment及biolistics)。最早由美国Cornell大学的Sandford等(1987)研制火药引爆的基因枪。基因枪的基本原理是将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下微粒被调整射入受体细胞或组织。微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上，得到表达，从而实现基因的转化。与其它遗传转化方法相比较，有以下优点：A、 无宿主限制：根癌农杆菌只对某些双子叶植物敏感，而对多数单子叶植物尤其是重要的禾谷类作物不敏感，从而大大限制了它的应用范围。基因枪技术没有物种限制，对双子叶和单子叶植物都可适用，对动物、微生物也同样适用。B、 靶受体类型广泛：PEG法、脂质体法、电击法等介导基因转化需要以原生质体作为受体细胞。由于原生质体不易培养和再生，或再生周期长，基因型依赖性强，使这些方法的应用受到限制。基因枪技术可以选用易于再生的受体，绕过原生质体再生的困难。它不仅以原生质体、叶圆基为靶受体，而且悬浮培养细胞、茎或根切段以及种子胚、分生组织、幼穗、幼胚、愈伤组织、花粉细胞、子房等几乎所有具有潜在分生能力的中组织或细胞都可以用基因枪进行轰击转化。C、 可控度高：近代的高压放电或高压气体基因枪已可根据实验需要无级调控微弹的速度和射入浓度，可以较高的命中率把DNA微粒载体射入特定层次的细胞，即厂家态细胞和分生区细胞，从而为基因转化提供可靠的技术措施D、 操作简便快速，甚至可克服无菌的困难基因枪转化技术的应用前景由于基因枪技术具有许多优点，因此可应用于现代分子生物学的许多领域，概括起来有以下几个方面：1) 植物基因转化，目前已有十几种植物采用此技术获得了转基因植株。2) 外源基因导入植物细胞的细胞器，即细胞核、线粒体、叶绿体，现已证明基因枪法可将外源基因导入细胞器，并能得到稳定表达。3)基因枪在种质转化中的应用植物种质系统包括茎尖分生组织、配子体及胚胎细胞，它们均有可能作为外植体而被转化。如大豆茎尖分生组织用基因枪转化成功一例，分生组织中的某些细胞将决定花粉、子房及配子体的形成，这些细胞被转化后， 即可在雌雄性器官中携带有外源基因，从面获得转基因植株。模拟自然界的有性过程，用转化的花粉授粉，以获得转化的种子，是一条最为简捷和理想的转化途径，若能成功，则可克服基因型的依赖性，克服植株再生的困难，且容易得到大量的种子以供选择。4) 植物基因表达调控研究利用基因枪技术为外源基因导入特定组织提供了可能，因此可以利用研究植物的发育及调控。如果把外源基因导入不同的细胞或不同发育时期，则可以研究其基因表达的特点。通过培养条件的改变可以研究基因表达的环境因素。此外，基因枪技术还可以应用于微生物和动物细胞的基因导入。特别引起人们重视的是，其它的基因转化技术对动物细胞转化一直较困难，而现在运用基因枪技术已成功地在动物的培养细胞、器官、卵细胞、胚胎细胞等实现了基因转化。揭开了动物基因转化的新篇章。由于深入分析动物基因转化的成功，使基因枪作为基因治疗的工具成为可能。如果对特定的器官导入特异性表达的基因，可对病变部位进行直接治疗，或通过遗传免疫产生抗体治疗疾病。基因工程的发展历史：A、基因工程的诞生基因工程是一项新兴的工程技术，它的诞生需要理论和技术上的支持： 1. 理论上的三大发现： （1）证明了生物的遗传物质是DNA（基因工程的先导）（2）DNA的双螺旋结构和半保留复制机理（3）遗传信息的传递方式（中心法则）和三联体密码子系统的建立 2. 技术上的三大发现： （1）基因工程的工具酶 （2）基因工程的载体（3）基因的体外重组B、基因工程的发展：(1) 艰难阶段：诞生初期受到很多争论，科学界对其发展采取了一定得阻扰(2) 逐渐成熟阶段：许多基因工程产品的诞生，促进了基因工程的发展(3) 迅速发展阶段：20世纪80年代以后基因工程迅速发展，转基因小鼠、烟草等相继诞生，1991年全球范围内的人类基因组计划实施等。限制性内切酶的命名 （选择题） 第一个字母： 细菌属名的第一个字母第二、三母： 细菌种名的前二个字母，接下是细菌株的第一个字母 ，同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字、来代表；已发现的限制性内切酶有三种类型：分别为I型，II型和III型。影响连接反应的因素1. DNA末端的浓度2. 反应温度3.ATP浓度修饰酶包括聚合酶、磷酸酶、甲基化酶核酸分子杂交:具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。TaqDNA聚合酶的特性：热稳定性强 、高特异性 、合成率高 、延伸能力强防止污染的方法1) 合理分隔实验室2) 吸样枪3) 预混和分装PCR试剂4) 防止操作人员污染5) 设立适当的阳性对照和阴性对照6) 减少PCR循环次数 7) 选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入 基因芯片：采用原位合成或直接点样的方法将大量DNA片段或寡核苷酸片段以预先设计的方式排列在硅片、玻璃等介质上形成微矩阵，待检测样品用荧光分子标记后，于微矩阵杂交，通过荧光扫描及计算机分析即可获得样品中大量的基因序列及表达信息，以达到快速、高效、高通量的分析生物信息的目的。动物基因工程：是应用DNA重组技术，按照人们的意愿，在基因水平上改变生物遗传性，创造新生物物种，通过工程化为人类提供有用产品及服务的技术；或指应用现代化的生物科学和遗传学技术，对动物基因进行操纵或改造的科学工程。1、植物基因工程在植物分子生物学研究中的应用 转座子标签 T-DNA标签法 反义RNA技术 位点特异性重组系统2、改良植物品种抗虫基因工程，抗病基因工程，抗除草剂基因工程，抗逆境基因工程，改良作物营养品质基因工程，改变花色花形基因工程，雄性不育基因工程3、利用植物作为生物反应器 转