基因治疗（6）ppt课件

危敏 副教授,南方医科大学 基因工程研究所,基 因 治 疗,药物治疗 手术治疗 放射治疗 理疗,传统治疗方法,新的生物治疗： 基因治疗 (gene therapy),基 因 治 疗,一、概念 二、策略 三、基本流程 四、应用与展望,一、基因治疗的概念,Gene therapy is a medical intervention based on modification of genetic materials in living cells. 基因治疗是指改变细胞遗传物质为基础的生物医学治疗。,概念的发展,经典概念：将具有正常功能的基因置换或增补患者体内的缺陷基因，从而达到治疗疾病的目的。 广义概念：将某种遗传物质转移至患者细胞内，使其在体内有效表达，最终达到治疗疾病目的的方法，均称之为基因治疗。,二、基因治疗的策略,(一) 直接策略： 针对致病基因 (二) 间接策略： 导入与致病基因无直接联系的治疗基因,(一)直接策略,基因矫正（gene correction） 基因置换（gene replacement） 基因增补（gene augmentation） 又称为补偿性基因治疗 4. 基因干预（gene interference） 又称为反义基因治疗,基因矫正（gene correction） 指将致病基因的突变碱基加以纠正，而保留正常部分。 基因置换（gene replacement） 指通过同源重组（基因打靶）技术，将正常基因定点整合到靶细胞基因组内，以原位替换致病基因。 不涉及基因组整体改变的情况下对缺陷基因进行精确的原位修复，是最理想的治疗方式。,基因打靶技术,指目的基因导入靶细胞后，通过目的基因与靶细胞内染色体上同源DNA序列间的交换，将目的基因定点整合到靶细胞基因组上某一确定位点的技术。,3. 基因增补（gene augmentation） 成熟的策略 是指不去除异常基因，将有功能的正常基因导入病变细胞或其它细胞后发生非定点整合，表达正常产物以补偿缺陷基因的功能，或使原有的功能得以加强。,4. 基因干预（gene interference） 是采用特定的方法，导入外源基因选择性地阻断、干扰、抑制和封闭有害基因在DNA、RNA和蛋白质水平的表达及其生物合成。 导入抑癌基因 反义核酸技术 (antisense technology)： 反义RNA；反基因技术；核酶 RNA干扰（RNA interference),抑癌基因疗法,抑癌基因：是正常细胞内正常存在的，能抑制细胞转化和肿瘤发生的一类基因群。 Rb基因，p53基因，MTS基因，nm23基因 p53基因治疗研究： （1）野生型p53基因的替代疗法 （2）突变型p53基因的阻断疗法 （3）与p53基因有关的新型肿瘤疫苗,反义核酸,反义RNA（antisense RNA）：与mRNA互补的RNA，抑制mRNA的加工与翻译。 核酶（ribozyme）：具有催化功能的RNA，其与相应mRNA结合后能发挥酶活性，将mRNA降解。 反义脱氧寡核苷酸，ODN,反义RNA技术,体外合成反义RNA，直接导入； 将特异的反义基因通过特定的表达载体（质粒、病毒）导入细胞，转录出反义RNA发挥作用，避免了在给药途径中易被RNase降解的缺点。,关键性问题,1. 专一性转移 如何专一的作用于病变细胞，而不影响其他正常细胞。 2. 反义RNA进入靶细胞前的降解问题 解决： 特定受体介导的反义RNA转移,受体介导的反义RNA转移,脱唾液酸糖蛋白（ASGP）受体介导的转移，通过化学物质作为中间连接物，将ASGP与多聚赖氨酸（PL）共价结合，得到ASGP-PL复合物，这种复合物可以携带RNA，再专一性地被肝细胞表面的ASGP受体所识别，并被吞噬到肝细胞内发挥作用。,反义RNA应用前景,1. 安全性高 不改变基因结构，最终在细胞内被降解。 2. 设计和制备方便 体外转录获得。 3. 具有剂量调节效应 4. 能直接作用于一些RNA病毒,反基因技术,脱氧寡核苷酸（oligodeoxyribonucleotide, ODN），也被称为TFO (triple helix-forming oligo) 通过TFO在DNA结合蛋白的识别位点处，与靶基因结合形成三螺旋，从而位点专一性地干扰DNA与反式作用因子的结合，抑制转录起始或转录延伸，达到“反基因”的目的。 DNA水平阻止基因转录 肽核酸（peptide nucleic acids， PNA，一种以多肽骨架取代糖-磷酸骨架的DNA类似物）,核 酶,催化RNA切割和RNA剪接,“hammerhead” ribozymes,1981年，Cetch和Alfman首次发现了一类具有特异性剪切RNA活性的RNA分子。,核酶具有稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。 核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合并切割其他的mRNA，效率高于反义RNA。,核酶的特点,RNA干扰技术,概念：短的双链RNA (dsRNA) 导入细胞，可以使同源mRNA发生特异性的降解，从而阻断相应基因的表达。,高度的序列专一性 高效性 易操作性,miRNA,MicroRNA（miRNA）是内源性的，是一种非编码的RNA；由miRNA基因表达出最初的pri-miRNA分子。 靶标mRNA通常发生不完全结合，并且结合的位点是mRNA的非编码区的3端；它不会降解靶标mRNA，而只是阻止mRNA的翻译。 miRNA能够调节与生长发育有关的基因。 在生物体中的表达具有时序性、保守性和组织特异性,(二) 间接策略 导入与致病基因无直接联系的治疗基因,免疫基因治疗 分子化疗 特异性细胞杀伤,1.免疫基因治疗,(1) 细胞因子基因治疗 IL-2、IL-4、IL-1、IL-6、IL-7、IL-12、 INF-、TNF-、G-CSF、GM-CSF (2) 免疫增强基因疗法 MHC I类抗原、共刺激分子 (3) 肿瘤DNA疫苗疗法 癌胚抗原（CEA）制备的肿瘤DNA疫苗,Tumour Necrosis Factor,2.分子化疗,(1) 自杀基因疗法： TK基因、CD基因 (2) 化疗保护性基因治疗： MDR基因 (3) 药物增敏基因治疗： 钙调素基因,(1) 自杀基因疗法,自杀基因（suicide gene)，前体药物酶转化基因 该基因表达产生的酶可催化无毒性的药物前体转变为细胞毒性物质，从而杀死肿瘤细胞； 同时通过“旁观者效应”（bystander effect）杀死邻近未导入该基因的分裂细胞而显著扩大杀伤效应。 由于携带该基因的受体细胞本身也被杀死，所以这类基因被称为“自杀基因”。,自杀基因,单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因 编码胸苷激酶（TK）催化丙氧鸟苷（ganciclovir, GCV）成为磷酸化的核苷酸类似物，阻断DNA的合成而使细胞死亡。 大肠杆菌胞嘧啶脱氨酶（CD）基因 将5-氟胞嘧啶（5-FC）转化为5-氟尿嘧啶（5-FU）而发挥细胞毒性作用。,viral vector （HSV）,Targeted Killing - Genetic Pro-drug Activation Therapy,Ganciclovir phosphate inhibits DNA polymerase,Cell death Including bystander cells,(2) 化疗保护性基因治疗,指将编码抗细胞毒性药物蛋白的基因导入人体细胞，以提高机体耐受肿瘤化疗药物的能力。 如将多药抗性（multiple drug resistance, MDR）基因MDR-1导入骨髓造血干细胞，减少骨髓受抑制的程度，以加大化疗剂量，提高化疗效果。,(3) 药物增敏基因治疗,将外源基因插入肿瘤细胞后，改变肿瘤细胞对药物的敏感性。 如将钙调素基因转入癌细胞，其表达产物作为细胞内信号转导系统的重要物质，明显增强肿瘤细胞对化疗药物的吸收量而相应减少了排出量，使癌细胞对化疗药物的敏感性明显提高。,3.特异性细胞杀伤,指利用重组DNA技术将生物来源的细胞毒素基因与一些特异受体的配体基因融合，构建融合基因，导入高度表达该受体的肿瘤细胞，以特异性杀伤该肿瘤细胞。,特异性细胞杀伤,如将绿脓杆菌外毒素（PE）或白喉毒素（DT）基因与TGF基因组成融合基因TGF-PE，或TGF- DT。 由于TGF与表皮生长因子EGF结构类似，也能与表皮生长因子受体（EGFR）结合； 故该融合基因可特异性进入并杀死高度表达EGFR的膀胱癌、肾癌、肺癌、乳腺癌等肿瘤细胞。,三、基因治疗的基本流程,（一）外源基因的选择与制备 （二）载体的选择与构建 （三）靶细胞的选择 （四）基因转移 （五）基因转染细胞的筛选与鉴定 （六）回输体内,基因治疗的方式,根据基因导入的方式分为两种： 1. 直接体内疗法（in vivo） 是指将目的基因直接导入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。 2. 间接体内疗法（ex vivo） 是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。,基因治疗的种类,生殖细胞基因治疗 可遗传性 伦理学问题 禁止应用人体 体细胞基因治疗： 研究重点,体细胞治疗的概念,指应用人的自体、同种异体或异种（非人体）的体细胞； 经体外操作后。 回输（或植入）人体的治疗方法。,（一）外源基因的选择与制备,外源基因 目的基因： 与致病基因相对应的有功能的正常基因 与致病基因无关、有治疗作用的基因 标记基因: 新霉素磷酸转移酶（Neo）基因 外源基因的获得 基因克隆 人工合成 PCR扩增,外源基因的选择原则,体内少量表达就可显著改善症状； 过高表达不会对机体造成危害； 在抗病毒和病原体的基因治疗中，所选择的靶基因应在病毒和病原体的生活史中起重要的作用，并且该序列是特异的； 肿瘤病人多有免疫缺陷，可选用免疫因子基因转入人体；可采用反义技术封闭细胞内活化的癌基因或向细胞内转入野生型抑癌基因，抑制肿瘤生长，所针对的癌基因或抑癌基因应与该肿瘤的发生和发展有明确的相关性。,（二）载体的选择与构建,病毒载体： 逆转录病毒（RV) 腺病毒（AV) 腺相关病毒（AAV) 单纯疱疹病毒（HSV) 痘苗病毒（VV),非病毒载体： 脂质体法 直接注射法 受体介导基因转移 DNA-磷酸钙共沉淀 电穿孔,逆转录病毒结构,逆转录病毒的基因组结构,3LTR,结构基因 gag (group antigen) ：编码核心蛋白和属特异性抗原 pol (polymerase) ：编码逆转录酶 env (envelop) ：编码病毒外壳蛋白和包膜蛋白 LTR（long terminal repeat ）序列 含增强子、启动子、转录所需起始和终止信号,逆转录病毒的生活史,病毒载体构建,（1）去除病毒致病性结构的基因序列如逆转录病毒的gag、pol、env基因，从结构上保证病毒的安全性。同时产生的空白区以目的基因取而代之； （2）保留其基因的调控序列及包装序列等； （3）插入标记基因如Neo基因以对基因转染细胞的抗性筛选等。,包装细胞,指将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒（辅助病毒）导入哺乳细胞内而制备成的一种特殊的细胞系. 这种细胞因携带有完整的病毒结构基因序列能够大量产生病毒包装蛋白，而辅助病毒自身缺乏包装信号（序列）而不能包装,不产生有复制能力的野生型病毒颗粒。,假病毒颗粒,当逆转录病毒载体转染进包装细胞后，转录出标记基因和目的基因的RNA，含有两端的LTR和包装信号，被包装细胞产生的病毒蛋白包装成病毒颗粒。 因包装的RNA中不含病毒蛋白的编码序列，导致这种病毒只有一次感染能力，即在感染细胞后，不能产生新的病毒颗粒，称为假病毒颗粒。 假病毒颗粒释放到包装细胞的培养液中，用于感染靶细胞，从而将其携带的治疗基因送入靶细胞。,Vector DNA,Helper DNA,Engineering a Virus into a Vector,wildtype virus,structural proteins,Packaging,Therapeutic gene,essential viral genes,Packaging cell,Y,vector,Vector uncoating,Therapeutic mRNA and protein,Episomal vector,Integrated expression,Target cell,Gene Transfer,Based on Kay et al 2001,逆转录病毒载体的特点,1. env编码的糖蛋白结合细胞膜上的特异性受体，基因转移效率更高； 2. 结构基因gag、env、pol的缺失不影响其他部分的活性； 3. 整合到靶细胞基因组，可长期表达； 4. 包装好的假病毒颗粒分泌至包装细胞的培养上清中，易于分离制备。,问题,1.只能感染分裂期细胞, 靶细胞DNA合成很活跃，因为病毒感染和整合作用均依赖靶细胞DNA的复制； 2. 安全性问题 随机整合：诱发插入突变，激活癌基因 缺陷型逆转录病毒通过重组获得复制能力,腺病毒载体,1. 基因组：双链无包膜DNA病毒，36kb 2. 通过受体介导内吞作用进入细胞，基因导入效率高。 3. 不整合宿主基因组，安全。 4. 宿主细胞范围广泛。 5. 可口服、喷雾吸入或气管内滴注。 6. 载体容量大。 7. 体外容易培养制备，病毒滴度较高。,常用的病毒载体及其基因转移的特点,逆转录病毒 腺病毒 腺相关病毒 单纯疱疹病毒 基因组 正链RNA 线性dsDNA 线性ssDNA dsDNA 811 kb 36 kb 4.7 kb 152 kb 外源基因容量 7 kb 7.5 kb 3.5 kb 30 kb 重组病毒滴度 中 高 较低 高 靶细胞状态 分裂细胞，表面 分裂细胞或 分裂细胞或 分裂细胞或 须有特殊受体 非分裂细胞 非分裂细胞 非分裂细胞 基因转移效率 高 高 高 高 基因整合 随机整合 不整合 定点整合于 不整合 染色体19q 外源基因表达状况 短暂/稳定表达 短暂表达 稳定表达 短暂/稳定表达 安全性及其它 相对较安全 可能引起炎症 无病原性 可能出现毒性反应 宿主范围广 和免疫反应 神经细胞嗜向性,(三) 靶细胞的选择,生殖细胞: 禁止 体细胞： 淋巴细胞、造血细胞、 内皮细胞、肌肉细胞、 肝细胞、成纤维细胞 肿瘤细胞等,靶细胞的选择,可根据疾病的特点、目的基因及其转移的方式等因素来确定。 选择的原则： (1) 便于从体内取出和回输； (2) 便于在体外培养与增殖； (3) 便于基因的高效转移； (4) 能够持续表达目的基因。,(四) 基因转移,病毒法： 主要通过携带有外源基因的病毒载体感染靶细胞来实现基因的转移。 非病毒法： 物理方法DNA直接注射、显微注射、电穿孔、微粒轰击及基因枪技术等； 化学方法脂质体融合法、磷酸钙沉淀法、DEAE-葡聚糖法等。 受体介导的内吞作用,脂质体 liposomes,其基本原理是利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起温育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA转移到细胞内。,优势：使用方便、成本低廉。 缺陷：转染效率较低和转染基因表达时间短暂。,(五) 基因转染细胞的筛选与鉴定,抗性筛选方法： 重组载体上插入有标记基因Neo，导入受体细胞后可使其产生对G418（Geneticin）药物的抗性。在加入G418的培养基中进行选择性培养时，转染NeoR基因的细胞能够存活，而未转染的细胞则死亡； 应用标记基因作为探针进行分子杂交法筛选。,(五) 基因转染细胞的筛选与鉴定,外源基因表达的鉴定： 采用Northern印迹杂交：检测mRNA的表达 测定其表达产物即蛋白质的含量等方法。 动物实验,(六) 回输体内,方式： 静脉注射、肌注、皮下注射、滴鼻等 基因修饰的淋巴细胞以静脉注射的方式回输到血液中； 将皮肤成纤维细胞以细胞胶原悬液注射至患者皮下组织； 采用自体骨髓移植的方法输入造血细胞； 或以导管技术将血管内皮细胞定位输入血管等。,第一军医大学分子生物学研究所,四、基因治疗的应用 与展望,基因治疗的应用,遗传病 替补法，导入正常基因 病毒性疾病 阻断病毒基因在体内的转录和翻译 肿瘤 基因的补充和修复，免疫疗法，细胞毒基因疗法,遗传病的基因治疗,1）在DNA水平明确其发病原因及机制； 2）隐性遗传的单基因遗传病； 3）该基因的表达不需要精确调控； 4) 该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中表达并发挥生理作用； 5）该遗传病不经治疗将有严重后果。,遗传病基因治疗的临床研究,1. 腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症 2. 家族性高胆固醇血症（FH） 3. 囊性纤维变性（CF） 4. 粘多糖沉积症 5. 血友病B（凝血因子IX缺乏）,“先天性重症联合免疫缺陷综合征”(SCID),Ashanti De Silva was the first patient to be treated with gene therapy in 1990. She received infusions of T cells that had been transduced with a gene for ADA (an enzyme that she lacks),ADA缺陷病的分子机制,腺苷脱氨酶（ADA）催化腺嘌呤核苷（A）和脱氧腺嘌呤核苷（dA）脱氨，生成次黄嘌呤核苷和脱氧次黄嘌呤核苷。 ADA缺陷 脱氧腺嘌呤核苷酸代谢受阻 dATP 抑制核糖核苷还原酶活性 阻止DNA复制和修复 导致细胞死亡，对淋巴细胞毒性最强。,1）单个核细胞的分离：使用淋巴细胞分层液分离患儿血中单个核细胞； 2）单个核细胞培养：以“CD3抗体 + IL2” 体外培养以刺激T细胞增殖，分化； 3）逆转录病毒载体介导外源基因（治疗基因 + 标志基因）转染T细胞； 4）将转染细胞回输给患儿体内。,ADA基因治疗方案,肿瘤的基因治疗策略,一、 抑制和杀伤肿瘤细胞 1. 自杀基因疗法（tk、CD基因） 2. 抑制癌基因的表达 （反义RNA、核酶、细胞内抗体） 3. 恢复抑癌基因的功能（p53、Rb基因） 4. 抗肿瘤血管形成,肿瘤的基因治疗策略,二、 肿瘤细胞的基因“修饰” 1. 导入细胞因子基因 2. 导入MHC基因和共刺激分子基因,三、调节和增强机体的免疫功能 1. 细胞因子基因导入免疫细胞 2. 基因修饰的树突状细胞 3. 分泌免疫毒素的T淋巴细胞 4. 肿瘤DNA疫苗,肿瘤的基因治疗策略,肿瘤基因治疗临床试