《微透析应用和进展》PPT课件.ppt

微透析技术应用进展,中医药学院中药新药实验室,微透析技术的基本原理 微透析技术的发展沿革及优缺点 微透析系统的组成 微透析探针的设计及种类 微透析技术的定量研究 微透析技术在生物学中的应用,主要内容,微透析技术（microdialysis，简称MD）是从神经化学领域发展起来的可以对内源性神经递质及其代谢物进行实时取样的新技术。,微透析技术的基本原理,透析针插入生物组织或生物母体,灌流液由体外微量灌流泵推入膜内套管,透析膜孔径允许小分子自由扩散通过而阻止蛋白质等大分子通过，透过膜的小分子物质被透析管内连续流动的灌流液不断带出。,活体微透析技术原理示意图,微透析技术的发展沿革,由早期神经化学实验室中灌流取样技术发展和延伸而来。 1961年 Gaddum 推拉式灌流取样技术 1972年 Delgado 组织透析取样技术 1974年 Ungestedt 进一步发展，申请适用于人和动物的专利,微透析技术的发展沿革,早期研究多用于大脑的神经生物学的研究 扩展到许多领域：血液、心、肝、肾脏、皮下脂肪组织、眼部组织、肌肉 应用到临床,中文全文期刊网：2006年45篇，2007年37篇,活体(In vivo)、实时（In time）、在线（On line） 时间分辨性 空间分辨性 提供游离态小分子化合物,对药物研究有重要意义 样品因不含蛋白质、酶等大分子物质，可不经预处理直接用于测定,微透析技术(MD)的优缺点,不足： 回收率低 ,通常在 15%左右 探针的植入会造成局部轻微的损伤。 回收率的测定虽然种类繁多,但每种方法都不够完善,影响了实际浓度的计算 要求探头必须准确插在同一取样部位 很难进行以秒为单位的动态观察,微透析技术(MD)的优缺点,微量灌流泵 探针 灌流液 收集器 分离检测装置,微透析系统的组成,A 灌注液(在透析针内); B灌流泵; C连接管; D样品收集; E微透析探针,微透析系统的组成,微透析探针,核心部分是微透析探针： 探针的长度一般在0.5-10mm，膜材料常用纤维素膜、聚丙烯腈膜等组成。 管状半透膜（微透析膜） 进液管 出液管 针柄部分,微透析探针的种类,微透析探针 分流式（血液和胆汁） 根据材料不同,并联,串联,同心圆式,套管式,线性,环形,柔性（静脉物质）,刚性（脑内）,（皮肤、肌肉、肿瘤）,微透析探针的种类,线性,同心圆式,柔性,分流式,串联（水平）式探头主要运用“横穿脑”技术植入脑或组织内。 透析管除了透析部分外，表面用一种不通透如环氧树脂封闭。 此法优点在于简便易行，探头一旦植入即可随动物移动。 其缺点在于植入过程中要在出入口各打一洞，引起所经过脑区，颅骨及肌肉产生过多的损伤。,并联（垂直）式探头通过立体定向仪能准确定位到所需测定的区域。 同心圆式探头目前最流行，这种探头采用管内套管的设计，可以制作直径小，适合于通过预先埋置引导管插入组织，为慢性实验提供方便。,灌流液,进行微透析实验时，使用的灌流液中各离子组份的浓度应与脑内（组织）细胞外液保持一致。 以脑微透析为例：Ca2+的浓度对实验结果成败极为关键，目前认为细胞外Ca2+浓度估计值1.2mM。实验室常用的灌流液浓度为，NaCL 140mM、KCl 2.4mM、MgCL2 1.0mM、CaCL2 1.2mM 、NaHCO3 5.0mM、Ascorbic acid 0.6mM （pH7.4）。,样品收集,微透析实验使用的灌流速度一般不超过510l/min。 高流速并不能进一步增加物质跨膜流量（绝对回收率），而且灌流液在压力下流出探头可能会引起组织损伤。 灌流开始时，回收率较高，一般认为，这是探头插入所引起的伤害性组织反应。一般经过3060 min后，回收率基本趋于稳定。,样品检测,透析样品可直接用HPLC/电化学/荧光/紫外/质谱等检测技术或其他高灵敏度微量化学分析法测定。 对于某些含量极低的物质，可增加回收率的方法来弥补灵敏度的不足。如可加长透析膜的有效长度、改变灌流速度，也可使用药物方法（如在灌流液中添加摄取阻断剂）以提高待测物质含量。,样品检测,根据分离检测手段的不同，微透析实验又可以分为基于非分离和基于分离的微透析方法。,基于非分离的微透析方法(non一separation based approaches) 基于非分离的方法主要有生物传感器法、免疫法和质谱法。 生物传感器主要部分是酶电极，可以特异地与透析液中的待测物反应，并被检测器检测。,基于分离的微透析方法(separation based approaches)： 主要有高效液相色谱法(HPLC)和毛细管电泳法(CE)。微透析样品属于亲水性物质的离子性溶液 与非分离的微透析方法相比，基于分离的微透析方法一般可以同时测定多个化合物。 一般来说，根据检测物质的不同，紫外、荧光、电化学检测和质谱法是HPLC常用的检测方法。而CE常用电化学检测器和激光诱导荧光法检测。,微透析取样和多级质谱装置流程图,在线微透析液相色谱电喷雾质谱偶联装置示意图,毛细管电泳-多级质谱与微透析采样联用示意图,等电电点聚焦-微透析-质谱联用,高效液相离子色谱在线微透析质谱联用示意图,微透析的回收率： 探针的回收率是指灌流液中流出的待测组分与标准浓度之比(Ces/Cos)的百分数。 微透析技术用于定量分析首先应该解决的问题就是如何对取出的样品进行准确可靠的校正。而探针的回收率是计算待测物浓度的前提条件。,微透析技术的定量研究,探针的回收率是影响微透析结果正确性的主要因素,其值取决于： 取样部位的生物特性 透析膜的物理及化学性质(材料、孔径、长度及几何形状等) 待测物的分子质量 在生物介质中扩散速度和灌流速度、压力、温度等。,微透析回收率的测定方法：,1 体外校正(体外回收率) 当不需测定样品的绝对含量,只需计算被测药物相对浓度的变化时,可采用体外回收率测定方法。 测定宜在取样前后立即进行,将探针放入已知浓度 的标准溶液中,用与体内实验相同的流速灌流探针, 达到稳定状态后收集灌流液并进行测定。测定浓度 与标准溶液浓度之比就是体外回收率。实验前后回 收率的误差小于5%,2 体内校正 需测定样品的绝对含量 内标法 零净流量法 低灌注流速法,内标法: 将已知浓度的内标加至灌流液中，假设透析液中待测物与内标的回收率一致，通过内标法定量求得待测物的绝对量。灌流液中内标物的已知浓度(Cic)，透析液中内标物的浓度(Cec)，体内回收率(Rin，viv)可用下式计算: Rin，viv=(1-Cec/Cic)100%,内标必须与待测物化学结构相近 两者在血液及组织中的扩散及消除速度一致 内标不影响所研究药物在组织中的药理活性,零净流量法: 当透析液中被分析物浓度与体内浓度一致时，没有物质交换，达到稳态,在该状态下，可将一系列已知浓度的待测物加至灌流液中以测定透析液中待测物的浓度。以透析液中待测物的浓度为纵坐标，已知浓度的待测物的浓度为横坐标，作直线，其斜率即为回收率。,优缺点： 方法比较准确，但费时，准确性有赖于灌流液中待测物浓度的准确性及已知浓度点的数目。,低灌注流速法： 在低流速(小于0.05l/min)条件下,对活体组织进行灌流,即为低灌注流速法。此时,分子质量小于500的化合物回收率可达95%以上。在极慢灌流速度下,回收率可达100%,所引入的误差可忽略,影响微透析回收率的因素：,温度 灌注速度 透析膜的物理及化学性质 探针的形状 被分析对象的性质 被分析对象在生物介质中的扩散速度。,应用微透析技术检测的相关物质,能量代谢物 主要包括葡萄糖、乳酸盐、丙酮酸盐、腺苷、黄嘌呤等 氨基酸类神经递质 兴奋性氨基酸(EAA)包括谷氨酸和天冬氨酸在脑细胞缺血损伤中的作用已得到广泛认同 自由基相关的物质 如尿囊素、尿酸等 组织损坏标志物 如甘油等 各种药物,乳酸/丙酮酸比（lactate/pyruvateratio, LPR） 反映由缺血等引起细胞氧化还原状态改变的明显标志。 组织缺血时，氧供减少，糖酵解增加，丙酮酸向乳酸转化增加，LPR随之升高；随着糖含量的降低，丙酮酸生成减少，LPR进一步增高，缺血恶化。,丙三醇 丙三醇是胞膜的一种组分。缺血时，能量衰竭可导致胞膜分解，丙三醇释放入组织间液。丙三醇是组织低氧与细胞破坏的有效监测指标，增高可提示缺血脑组织开始恶化。严重或完全缺血时，丙三醇可以升高48倍。,谷氨酸 兴奋毒性是继发性脑损伤的一个机制，它通过谷氨酸介导的离子通道开放，引起细胞大量钙离子内流而造成细胞损伤。脑透析液中谷氨酸的增加是细胞损伤的直接标志,葡萄糖 缺血：缺血时毛细血管血流降低，转入透析导管中糖减少。 充血：毛细血管血流增加，转入导管中糖增加。 高血糖：血糖增高，透析液中糖浓度也增高 高代谢或低代谢：代谢高低可增加或减少糖的摄取，影响组织中糖的含量，导致分析液中糖浓度的增加或减少,药物 采用体内微透析-毛细管电泳/电化学检测法(CEEC)测尼古丁； Hogan采用微透析-毛细管电泳/激光诱导荧光,用于监测一种抗肿瘤药物在血液中的药代动力学,微透析技术在生物学中的应用,神经药理学研究领域 临床诊治 中医药研究领域,神经药理学研究领域 药效学研究 通过分析透析液中内生的神经递质、神经调质,可直接衡量药物的治疗效果,有助于探讨药物作用的机理。 Hargreaves利用微透析技术监测了接受手术去除受损磨牙的患者,发现预先服用甲基泼尼松龙可使缓激肽释放减少。,神经药理学研究领域 药物代谢研究 微透析技术比传统技术更加清楚、全面地反映了药物在体内的中间代谢过程。 Scott 等应用微透析技术,通过监测扑热息痛和它的葡糖苷酸浓度-时间变化来研究其药动学和药代学,神经药理学研究领域 药动学研究 早期的微透析药动学研究主要是在中枢神经系统,最近也有用于其它各种不同组织研究的报道,而阐明中枢药物的作用机制对于研究药物与血脑屏障的关系很有意义。 Tsai 等从血液、海马区和胆汁 3 个方面同步使用微透析探针进行了黄芩素的药物动力学研究。,临床诊治 临床目前主要涉及颅脑损伤、蛛网膜下腔出血、癫痫、帕金森氏病、脑肿瘤等领域。 国外微透析技术和设备已逐渐标准化,被作为一种常规方法用于神经外科手术和神经病变的监护治疗,并能提供正常参考值来评价患者透析期间的变化,大大降低患者的死亡率。有研究显示,微透析能在患者脑缺血局部脑氧分压和脑血流量出现变化后530 min即发现代谢物浓度的变化,早于临床症状,为临床治疗提供更大的空间。,临床诊治 用来选择具穿透力的抗肿瘤化疗药物 作为抗微生物药物“组织穿透力”的鉴定方法。,中医药研究领域 在脑变性研究方面的应用 陈氏等应用微透析发现黄芪皂苷不能降低缺血/再灌时谷氨酸的释放。 有学者应用脑内微透析技术观察发现,丹参通过降低半胱氨酸、谷胱甘肽、兴奋性氨基酸及 NO 代谢产物水平发挥脑保护作用。,中医药研究领域 在针灸治疗方面的应用 人体经络是一个完整的、动态的系统,只有在线研究能考察针刺部位所产生的一系列生理变化。微透析的在线、多靶点监测特点全面反映了考察针刺反应的起效部位、微环境的变化,有可能成为诠释经络、腧穴功能的有力工具。 郭氏等采用微透析技术研究发现,电针可抑制细胞外兴奋性氨基酸的过量堆积。,经穴处的Ca2浓度高于非经穴处。 经络穴位处存在Ca、P、K、Fe、Zn、Mn等元素的富集现象，Ca元素的浓度与P、K、Fe、Zn、Mn等元素有正相关性。结合经络的功能和针灸临床，借助现代科技手段，如微透析技术、高效液相技术、原子吸收光谱法、计算机在线检测技术等进一步研究其活态下的某些物质的变化规律，待积累一定里的数据后再进行整合、概括，就可部分揭示经络脸穴的物质基础,中医药研究领域 在中药现代化研究中的应用 中药的研究已达到分子、基因水平,微透析所提供的药物浓度-时间动态变化的数据将使中药有效单体研究更加准确,成为分析并揭示中药有效成分及作用机制的重要技术支持,对中药现代化有巨大的推动作用。 利用微透析技术研究表明,3味中药(主要成分为川芎嗪、天麻素、麻黄碱等)能显著增加抑制性氨基酸,为揭示其治疗脑血栓的机理提供帮助。,用HPLC和探针同时检测黄连素在血液、肝脏和