微生物教程yyd第七章微生物的生长及其控制.ppt

第七章 微生物的生长及其控制,对微生物个体而言，体积的增大叫生长，数量的增多叫繁殖； 对微生物群体而言，生长、繁殖为个体生长、繁殖的总和。霉菌细胞数目的增加不伴随着个体数目的增加，只能叫生长不叫繁殖。,第一节 测定生长繁殖的方法 第二节 微生物的生长规律 第三节 影响微生物生长的主要因素 第四节 有害微生物的控制,第一节 测定生长繁殖的方法,一、测生长量。（适合于大规模的工业生产） （一）直接法: 测体积：离心沉降，得“菌泥”，即可 称干重：离心后将“菌泥”烘干即可 （二）间接法： 比浊法： 生理指标法： 含氮量测定：“凯氏定氮” 含碳量测定：方法类似氮的测定 其它：磷、DNA、RNA、产气、耗O2,二、计繁殖数,（一）直接法： 比例计数法（不常用） 血球计数板法：适合于单细胞的真核微生物，即酵母菌（细菌不可）细胞个体大，类似人体细胞（400显微镜）即可。 电子自动计数器计数法（电阻原理）,（二）、间接法： 液体稀释法（培养2448小时，多个试管，大于95，不常用） 平板菌落计数法（很常用）-计算活菌数（死菌不长菌落） 取一定量的菌悬液放入平皿中，冷凝前加入琼脂，混合，凝固。注意操作要求。,返回目录,第二节 微生物的生长规律,一、细菌个体生长和同步生长 同步培养：设法使某一群体中的所有个体细胞尽可能处于同样细胞生长和分裂周期中，然后通过分析此群体在各阶段的生物化学特性变化，来间接了解单个细胞的相应变化规律。,获得同步生长的方法： （1）环境条件诱导： 此法可改变微生物的代谢，使其同步生长，但由于代谢周期改变，研究意义不大。 （2）物理学方法： 在随机的群体中，选择出同步生长的个体。 具体有： 过滤法：孔径大小不同的微孔滤器以达到分开的目的。 离心法：不同细胞培养物，悬浮在不被这种菌利用的糖或葡聚糖的不同梯度溶液里，密度梯度离心，不同细胞分布成不同的细胞带。 硝酸纤维素滤膜法： 无论哪种方法，同步生长仅可维持少量的几代（4代左右），再往后又变为非同步的。故获得同步生长的微生物应该马上研究，以免代数过多。,二、典型生长曲线（对数生长曲线或细菌生长曲线）,是描述单细胞微生物生长规律的一条曲线 概念：将少量纯种单细胞微生物接种到一定体积的液体培养基中，于适宜的条件（温度、PH、O2、N、C源，营养成份比）培养，定时取样，测定菌数，以取样时间为横坐标，以所对应的细胞数目的对数值为纵坐标，即可得到平面直角坐标系内很多点，将各点连成一条曲线，即典型生长曲线。,菌数的对数,对数期,迟缓期,衰退期,总菌数,活菌数,生长曲线,小时,分为四期：迟缓期 、 对数期、稳定期、衰退期,（一）延滞期（停滞期、调整期、适应期、延迟期）,1、 定义：指少量微生物接种到新培养液中后，在开始培养的一段时间内细胞数目不增加的时期。 2、 特点： 生长速率为零； 细胞形态变大或增长； 细胞内RNA尤其是r RNA含量增高，原生质呈嗜碱性； 合成代谢活跃，易产诱导酶 容易受外环境影响。,3、 影响因素：延滞期越短，越利于生产 1)、 菌种差别：不同菌种的延滞期长短不同。 2)、接种龄影响：以对数期接种龄的种子接种，则子代培养物的延滞期就短，反之，如以延滞期或衰亡期的种子接种，子代培养物的延滞期就长 3)、接种量影响：同种微生物在一定范围内，接种量和延滞期的长短显负。（成反比） 4)、培养基的成分： 5)、产生原因：从一个环境到另一个环境的适应，是微生物生理合成的调整，产生以前没有的某种酶，暂时缺乏足够能量和必须的生长因子，种子老化或未活化，接种时造成的损伤。,（二）、对（指）数期,1、定义：微生物细胞以几何级数迅速增加的一段时期。 2、特 点: 1)、生长速率最大，代时（细菌数量增加一倍所需时间）最短。 2)、细胞均衡生长，体内成分均匀。 3)、酶系活跃，代谢旺盛。,3、影响对数期增代时间的因素,1)、菌种：不同菌种代时差别大 2)、营养成分，越全面，越丰富，则代时越短。 3)、营养物质含量：指某一种营养物的浓度，区别于总量。 在一定范围内，营养物质含量，影响微生物的群体代时； 在一定范围外，其只影响最终的菌浓度总量和产物量,不影响代时； 生长代谢因子：凡是在较低浓度即可影响微生物生长速度和菌体产量的物质称生长代谢因子。 4)、培养温度：对微生物的生长速率有明显的影响，对发酵实践、食品保藏和夏天防范食物变质和食物中毒等都有重要参考价值。,4、对数期的实践意义：,1)、是进行基础研究的好材料 2)、是增殖噬菌体的最适宿主菌龄 3)、也是发酵生产中用作“种子”的最佳种龄,（三）、稳定期,定义：即对数期之后，细胞数量达到最高峰的一段时期。新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长的动态平衡之中。 特点： 1)、生长速率为0（生产和死亡的细胞数相等，正负生长持平） 2)、这一时期，菌体内开始积累储藏物 3)、具有产生芽孢能力的细菌开始产生芽孢 4)、开始合成次生代谢产物（抗生素、毒素等）,稳定期到来的原因： 1)、养份消耗（特别是生长限制因子的消耗），有害代谢产物的积累 2)、营养物质比例失调（特别是C/N比值）及PH值的改变 实践意义 1)、是生产量上获得菌体及其代谢产物的最佳时期。（秋季） 2)、是研究中，确定生长因子维生素和氨基酸生物测定的关键时期。 3)、是设计和确定连续培养技术的前提。（区别于分批培养）,(四)、衰亡期（群体呈负增长）,定义：稳定期后，群体中细胞死亡数量增多，繁殖数量减少的一段时间。 表现： 1)、细胞形态不规则，大小差异较大，（严重的发生菌体自溶） 2)、可产生芽胞的细菌，芽胞与菌体分离 3)、可产生次级代谢产物的，此期产物量很高 导致因素： 由于微生物大量繁殖而导致环境条件恶化，分解代谢超过了合成代谢，而导致大量菌体死亡。,三、微生物连续培养（发酵罐内进行）,1、定义：即在微生物生长到对数期之后，以一定的流速加入新鲜培养基，同时排出过多的培养物，这样就可以维持较高的代谢产量，此法称微生物连续培养。,2、根据控制方式和使用目的分两类： （1）、恒浊培养：使用设备恒浊器 此法是通过光电管接受培养器内的细菌浓度变化所引起的光亮度变化而调整加入反应器内培养基的速度，使培养过程维持在较高的生长水平。 恒浊培养在实践中可获得大量的菌体以及与菌体生长平行的代谢产物。若产物与菌体生长不平行，则此方法不适用。 （2）、恒化连续培养：（适用于科研和理论研究） 此法是通过改变培养液内某种关键成分（限制性生长因子）来实现控制微生物的生长速率，使细菌处于较最高生长率略低的水平。 上述两种连续培养法均为一级连续培养。在生产上，有时代谢产物量和菌体量未必成正相关，故又设计出多级连续培养。,连续培养的优缺点： 优点：1、高效、简化了装料、灭菌、出料、清洗发酵罐等操作 2、自动化控制，便于电脑操作； 3、产品质量较稳定； 4、节约动力、人力、水、蒸汽。 缺点：（1） 菌种变异退化（必然的）， 故 连续培养时有时间限制。 （2） 易被杂菌污染。,返回目录,第三节 影响微生物生长的主要因素,营养条件（第五章） 物理条件 （温度，氧气，PH值）,一、温度,原因： 影响酶的活性，最适酶促反应温度。 影响细胞质膜的流动性，温度越高流动性越大。 影响物质的溶解度。 所有细菌均有其温度三基点： 最适生长温度、最高生长温度、 最低生长温度（常利用其保持食品、菌种） 最适生长温度：某菌分裂代时最短或生长速率最高的培养温度。对细菌而言，其适宜的温度跨度很大，故从温度角度分为三大类群：,适温菌 ：大多数 宽温菌/窄温菌 嗜热菌：火山口 嗜冷菌：北极，冰川,二、氧气,1.专性好氧菌：需在有氧环境生长繁殖，靠有氧呼吸产生能量。 体内有超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、在半固体培养基中培养，集中在表面上生长形成菌膜。 多数真菌和很多细菌均属此类。 2.兼性厌养菌：有无氧气均可生长，有氧气时生长的更好，靠呼吸产能；无氧气时靠发酵或无氧呼吸产能。体内有SOD和过氧化氢酶。许多酵母和细菌属此类。 有氧呼吸：底物脱氢，H由外来受氢体接受（如O2） 无氧呼吸：底物脱氢，H由除氧外的受氢体接受（如NO3-盐、SO42-盐、CO2、Fe3+或有机物） 发酵：无外源受体（自身内部进行） 故兼性厌养菌在半固体培养基中各处均有，以上部居多。,3.微好氧菌：在氧含量较底的条件下，0.010.03巴，正常的氧分压是0.2巴才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终受体而产能的一类菌。 4.耐氧菌： 可在有氧条件下进行发酵性厌养生活，氧对其无害，体内无呼吸链，有SOD，有过氧化物酶，缺少过氧化氢酶。在没有氧的条件下生长。如乳酸菌。 5.厌氧菌：（专性厌氧菌或绝对厌氧菌） 在有氧条件下不生长，体内无SOD，有过氧化物酶，缺少过氧化氢酶。能量只能通过发酵或无氧呼吸获得，氧气对其有毒害作用，在有氧条件下或休眠或死亡。 例如：梭状芽孢杆菌、韦氏梭菌、产甲硫细菌（沼气）、双歧杆菌、在半固体培养基中（加入吸附氧气的试剂），在底部生长。 产生：在生物进化的过程中，好氧的菌体内产生的三种酶能够把有氧环境产生的超氧负离子、过氧化氢、过氧化物消除。（O2比H2O2强）,三、PH,原因：酶促反应的最适PH值 适宜的PH在（211） 对于某种具体菌而言，亦有其PH三基点：（最适PH 、最高PH、最低PH ） 群体按照所适宜的PH分为： 嗜碱菌：包括嗜碱菌/耐碱菌 嗜酸菌：包括嗜酸菌/耐酸菌 多数菌的适宜PH为中性左右（59） 细菌一般喜欢中性环境PH（7.0 7.2），真菌喜中性偏酸环境PH（4 6），放线菌喜中性偏碱环境PH（7.6 8）。,嗜酸菌、嗜碱菌、中性菌原生质内的PH均几乎为中性，关键在于“周质空间”（壁膜空间）的调节。但菌经代谢会改变外界环境。 培养基内中性成分：分为两大类（有机物、无机物）,有机物：,糖类,脂类,有机酸,蛋白质,胺类,脱羧,无机物：,（NH4）2SO4,NaNO3,氨根离子选择吸收,硝酸根离子选择吸收,H2SO4,NaOH,变酸,变碱,PH调节措施： 治标：过酸：加NaOH、NaCO3 过碱：加H2SO4、HCL 治本：过酸：加适当N源：尿素、NaNO3、NH4OH、或蛋白质 ；提高透气性。 过碱：加适当C源：糖、乳酸、油脂；降低透气性。,四辐射和超声波,辐射是通过空气或外层空间以波动的方式从一个地方传播或传递到另一个地方的能源。包括离子和电磁波。电磁辐射包括可见光、红外线、紫外线、x射线、射线。波长越长含能量越低，反之则高。无线电波最长，生物学效应最弱。有些可见光是蓝细菌和藻类进行光合作用的主要能源。紫外射线的波长136400纳米有杀菌作用，波长较短（x 、）往往可以引起水与其他物质的电离。对微生物易起有害作用。故作为一种灭菌措施。,一：紫外射线：使被照射物的分子或原子中的内层电子提高能级。波长265266纳米的杀菌力最强。紫外辐射对微生物有明显的致死作用，是强杀菌剂。紫外穿透能力差。不易透过不透明的物质。只适用于空气和物体表面消毒。紫外辐射对细胞有害。细胞很多物质可以吸收紫外线。例如，细胞质中的核酸及其碱基对对紫外线的吸收能力特强。吸收峰260纳米蛋白质的吸收峰为280纳米辐射作用引起细胞代谢机能的改变而发生变异。总之，紫外线的杀菌作用是复杂的主要是对DNA的作用。最明显的是形成胸腺嘧啶二聚体。影响：干细胞比湿细胞抗性强，孢子比营养细胞强，带色的细胞能更好的抵抗紫外辐射。光复活现象。,二：电离辐射：（x 、）有足够的能量从分子中逐出电子而使之电离。电离辐射的杀菌作用不是靠辐射对细胞直接作用，而是间接的通过射线引起环境中水分子和细胞中水分子在吸收能量后导致电离所产生的自由基起作用这些游离基团能与细胞中的敏感大分子反应并使之失活。一般用于大体积的物品消毒。某些化合物如碘化钾对电离辐射有保护作用。超声波使细胞破裂。,返回目录,第四节、有害微生物的控制,一、概念： 1 灭菌：用强烈的理化因素使物体内外一切菌永远丧失生长繁殖能力的方法。 杀菌：菌体虽死，形态尚存 溶菌：菌体杀死后细胞发生溶化、消失。 2 消毒：采用较温和的理化因素，杀死物体表面或内部部分对人体有害的病源菌，被消毒的物体基本保证无害的措施。 例如：常用消毒药剂及物理消毒措施（巴氏消毒法） 3 防腐：利用某种理化因素完全抑制霉腐菌的生长繁殖，防止食品发生霉腐的措施。,防腐的措施： （1）低温：休眠状态下保存菌种；保存食物、药品、菌种。 （2）缺氧：抽真空、充氮或二氧化碳、多用化学除氧剂；密闭容器中加入除氧剂有效的防止食品和粮食的霉腐变质。 （3）干燥：晒干，红外线、吸湿剂；在密封的条件下， 用生石灰，无水氯化钙，五氧化二磷，氢氧化钾或硅胶作吸湿剂保藏食品、药品、器材。,（4）高渗：提高细胞外的渗透压；盐腌和糖渍，例如果脯、咸菜等。糖的浓度为5070，盐的浓度为1015，由于盐的分子小并能离解，百分浓度相当时盐的保存效果好于糖。 （5）高酸度：泡菜，利用乳酸菌的厌氧发酵使新鲜的蔬菜产生大量的乳酸，抑制杂菌和霉菌的目的。乳酸菌、醋酸菌。 （6）防腐剂：食品、调味品、饮料、化妆品。,4 化疗：利用具有高度选择性的化学物质抑制宿主体内病源菌的生长繁殖，借以达到治疗该传染病的一种措施。 常见的化学治疗剂： 抗生素、磺胺类药物、中草药等。例如：黄连、双黄连；,二、物理杀菌的代表：高温,（一）温度杀菌作用的种类：干热灭菌、湿热灭菌 蛋白质的含水量与其凝固的温度成反比。湿热灭菌主要通过热蒸气杀死微生物，由于蒸气的穿透力比热空气强而且更易破坏保持蛋白质稳定性的氢键的结构，因此在同一温度下湿热要比干热效果好。,1.干热灭菌法：,（1）火焰灼烧法：此法灭菌彻底，迅捷简便。但使用范围有限。常用于接种工具，污染物品及实验动物尸体等的废弃物的处理。 （2）干热灭菌器：电热鼓风干燥箱以温度达到160算起2小时； 此法只适用于玻璃器皿，金属器具等耐热物品的灭菌。不可以有介质，灭培养基中的菌不可用。,2. 湿热灭菌法：,一般菌的营养体在60时5-10分钟可杀死，酵母真菌的孢子耐热在80以上才能杀死；细菌的芽孢最耐热，一般120处置20分钟才能杀死。主要有以下几种方法:,(1)常压法: A . 巴氏消毒法：用于牛奶、啤酒、果酒、酱油等不能进行高温灭菌的液体的一种消毒方法，主要是杀死其中无芽孢的病原菌（如牛奶中的结核杆菌或沙门氏菌），是一种低温消毒法，具体的处理温度和时间各不相同，一般在6085下处理15秒至30分钟。具体方法有两类，第一类称为低温维持法，另一类称为高温瞬时法，用于牛奶消毒只要在72下保持15秒钟即可。 B .煮沸消毒法：一般用于饮用水、注射器的消毒。（100，15分钟以上，并在水中加入1碳酸钠或25石炭酸，效果好。） C . 间歇灭菌法：又称丁达尔灭菌法或分段灭菌法。适用不耐热又需彻底灭菌的材料。方法是将待灭菌的培养基在80100下蒸煮1560分钟，以杀死其中所有微生物的营养细胞，然后置室温或37下保温过夜，诱导残留的芽孢发芽，第二天再以同法蒸煮和保温过夜，如此连续3天，即可在较低的温度下达到彻底灭菌的效果。例如，含糖培养基。,（2）加压法 （一）常用方法： A. 常规加压灭菌法（加压蒸气灭菌锅）：在压力为1/2或15磅/英寸2条件下达到沸点121.3，维持1520分钟，或压力0.7/2或10磅/英寸2时达到115维持35分钟。 B. 连续加压灭菌法（连消法）：适用于大规模的发酵工厂中做培养基灭菌。 方法：培养基在发酵罐外连续不断的处理515秒（135140），再冷却，重复循环，最终进入发酵罐。 概念： 热死时间：指在某一温度下，杀死某些微生物的水悬浮群体所需的最短时间。 热死温度：热死点，指在一定的时间内（一般为十分钟）杀死某些微生物的水浮群体所需的最低温度。,(二)影响加压蒸气灭菌效果的因素：,影响加压蒸气灭菌效果的因素： 灭菌物体的含菌量 高压锅内冷空气排除的程度 注：做实验时待喷出的气体是蒸气时，才把手动阀关掉 细菌生长PH值 灭菌对象的体积；（影响热的传导速率） 加热与散热的速度,（三）高温对培养基成分的有害影响及防止,有害影响： 形成沉淀，分有机物（如多肽类沉淀）和无机物（如磷酸盐、碳酸盐沉淀） 破坏营养，色泽改变（褐变：产生氨基糖、焦糖或黑色素或毒变） 改变培养基的PH值（一般降低PH值） 降低培养基的浓度（气温低时会增加冷凝水） 消除措施： 采用特殊的加热灭菌法：对易破坏的含