基因与基因工程

基 因 工 程 原 理,主要参考资料,静国忠等. 基因工程及其分子生物学基础 吴乃虎等. 基因工程原理 龙敏南等. 基因工程(第二版),基 因 工 程 原 理 第一章 基因与基因工程 第二章 基因操作的工具酶 第三章 cDNA文库和基因组文库 第四章 基因克隆的载体 第五章 重组DNA分子的构建、导入及筛选 第六章 分子杂交技术,第七章 聚合酶链式反应及其应用 第八章 DNA序列分析 第九章 基因突变 第十章 基因分离的策略 第十一章 基因的表达调控分析 第十二章 克隆基因的表达,第一章 基因与基因工程,第一节 基因研究的发展 第二节 基因的现代概念 第三节 基因工程的诞生及其主要的研究内容,Mendel G.J. (1822-1884). 1857-1864豌豆杂交实验。,Mendel 和遗传规律的研究,1900年Mendel遗传规律被重新发现遗传学的元年1866年发表论文，提出分离规律和独立分配规律,孟德尔分离律,孟德尔自由组合律,生物的每一种性状都是由遗传因子控制的，这些因子从亲代到子代，代代相传； 在体细胞内成对存在； 在形成配子时彼此分开，在性细胞中成单存在； 由杂种形成的不同类型的配子数相等； 雌雄配子的结合是随机的，有同等的结合机会。,1909年Johannsen W.L. (1859-1927) 发表了“纯系学说”首先提出了“基因”的概念，代替了Mendel “遗传因子” 的 概念。,基因概念的提出,基 因 gene 希腊文“给 予 生 命” 只是一种遗传符号， 是一种与细胞的任何可见形态结构毫无关系的抽象单位,1910年以后，Morgan T.H.等提出了基因的连锁遗传规律，染色体遗传理论发展为细胞遗传学,连锁遗传规律的提出,第一次将代表某一特定性状的基因，同某一特定的染色体联系了起来，证实了遗传的染色体理论 随后遗传学家们又应用当时发展的基因作图技术，构建了基因的连锁图，进一步揭示了在染色体载体上基因是按线性顺序排列的 但是人们对于基因的理解仍然缺乏准确的物质内容,back,1944年，Avery O.T. 肺炎双球菌转化实验,DNA是遗传物质被证实,40年代，证实DNA是遗传物质 早在上世纪20年代，已经知道染色体由DNA和组蛋白构成，但组成蛋白的氨基酸有20种，而组成DNA的核苷酸只有4种，什么是遗传物质？ 1928年，英国微生物学家F. Griffith著名的肺炎双球菌感染小白鼠实验。 （1）S型：注射小白鼠，死亡。 （2）S型，65 加热：注射小白鼠，活。 （3）R型：注射小白鼠，活。 （4） 65 加热S型+R型：注射小白鼠，死亡。死鼠体内得到了S型菌。,1944年，美国洛克菲勒研究所的Oswald Avery等公开发表了改进的肺炎双球菌实验结果 （1） S型菌无细胞提取物及其纯化的DNA都可使R型菌转变成S型菌； （2）经DNase 处理的S型菌无细胞提取物失去了转化作用。 （3）经胰蛋白酶处理的S型菌无细胞提取物仍有转化作用。,1944年，Avery等的细菌转化实验 首次证明基因的化学本质就是DNA分子 当时许多研究者都认为只有像蛋白质这样的 大分子才能决定细胞的特性和遗传。 Avery 等的工作打破了这种信条，在遗传学理论上 树立了全新的观点，即DNA分子是遗传信息 的载体。,35S 标记蛋白质,32P 标记 DNA,分别用放射性同位素标记噬菌体,35S 标记外壳蛋白质,感染后放射标记不进入大肠杆菌细胞,32P 标记 DNA ,感染后放射标记进入大肠杆菌细胞,1952年，Hershey-Chase的噬菌体感染实验进 一步说明：在噬菌体中的遗传物质也是DNA 分子，而不是蛋白质。,Watson 和Crick,DNA双螺旋模型的提出,50年代，DNA的双螺旋模型的提出 和DNA复制机理的阐明,DNA是遗传物质已被证实，但是DNA是怎样携带并传递遗传信息的？在细胞增殖过程中，DNA是怎样复制的？因此，对于DNA结构的研究成为了当时生物学家研究的热点。 1953年，Francis Crick和James Watson搜集了力所能及的资料，提出了DNA的双螺旋模型。随后，DNA的半保留复制和半不连续复制机理也被阐明，为基因工程的诞生奠定了坚实的理论基础。,DNA双螺旋模型,半保留复制,细菌培养在含15N 的培养基 中,细菌培养在含14N 的培养基中,一代,两代,证实半保留复制的实验,1958年，Meselson和Stahl用实验证明了DNA 半保留复制， 解决了基因自我复制和传递问题 双螺旋模型的建立使人们开始从分子的层次 上研究基因的遗传现象，从此进入了基因的 分子生物学的新时代。,back,每一段DNA都是基因？ 基因是功能单位，同时也是交换单位和突变单位？ 1955年，Benzer正式使用“顺反子”（cistron）这个术语 T4突变体r突变型 rA和 rB两个 亚区各产生一种特殊物质 最小交换单位和突变单位-单核苷酸,back,1941年，Beadle G.W.等证明了基因通过酶起作用，提出了“一种基因一种酶”的假说,一种基因一种酶,当时对基因的认识还局限于经典的、抽象的孟德尔遗传单位 1957年，氨基酸序列分析镰性形细胞贫血症 链 基因的突变会直接影响到编码的蛋白质多肽链的成分的改变 同型多体蛋白质/异型多体蛋白质 “一种基因一种多肽链”,back,1958年，Crick提出了“中心法则”,1971年， Crick修订了“中心法则”,50年代末60年代初 遗传密码 61年，解决了3个主要问题：1、密码比 2、是否重叠 3、是否有标点符号 66年，64种密码子全部破译 与基因的DNA共性一样，遗传密码的通用性也是我们赖以开展基因工程最重要的基础理论之一,back,基因是一段具有特定功能和结构的连续的脱氧核苷酸序列 揭示基因内部精细结构 50年代晚期 70年代中期 基因克隆/DNA序列分析 从单碱基水平上分析基因的分子结构 编码区/非编码区 启动子/终止子,一种典型的原核蛋白质编码基因的结构示意图,一种典型的真核蛋白质编码基因的结构示意图,back,原核生物的基因调控操纵子模型,1961年，Jacques Monod和 Fancois Jacob提出了原核基因调控的 操纵子模型 （operon model）。,基因不仅 在结构上是可分的 而且 在功能上也是可分的 乳糖操纵子模型,back,1969年，Beckwith等应用DNA-DNA分子杂交技术，分离-半乳糖苷酶基因 70年代 重组DNA技术（寄主菌株/克隆载体） 80年代 DNA测序方法改进和PCR技术的发明,1970年，Khorana等合成酵母苯丙氨酸转移核糖核酸基因 1976年，合成大肠杆菌酪氨酸转移核糖核酸基因 1977年，Boyer等将化学合成的人脑激素连接在乳糖操纵子上并导入大肠杆菌细胞 首次成功将一种高等真核生物的基因移入原核生物的细胞内，并能转录和转译，产生出有生物活性的蛋白质,第二节 基因的现代概念,一、移动基因 movable genes/transposable elements/jumping gene 可以从染色体基因组上的一个位置转移到另一个位 置，甚至在不同的染色体之间跃迁 McCintock 40年代晚期 激活-解离因子 Ac/Ds 60年代末 E. Coli,两侧反向重复序列(IR) 靶位点同向重复 复制/保守 逆转位子(返座元) 转座作用的遗传学效应 转座子示踪技术,next,转位子,Tn3系转位子 TnpA 转位酶基因 TnpR 阻遏物及分解蛋白基因 -lac -内酰氨酶基因,back,IS因子转位作用形成同向重复序列的机理,back,二、断裂基因 split gene 编码序列不连续的基因 间隔序列或间隔子(intron) 编码序列或表达子(exon) RNA splicing/differential (alternative) splicing 应用S核酸酶作图法测定基因中间隔子位置和长度,人 -珠蛋白基因的结构,真核细胞mRNA的5及3剪辑位点的保守序列,应用S核酸酶作图法测定基因中间隔子位置和长度,三、假基因 pseudogene 一种核苷酸序列同其相应的正常功能基因基本相同, 但却不能合成出功能蛋白质的失活基因 重复的假基因 加工的假基因,人-珠蛋白假基因的结构,人金属硫蛋白功能基因Mt-A与 无功能的假基因Mt-B的结构比较,四、重复序列和重复基因 不重复的唯一序列(一个拷贝) 大多数 真核70% 低度重复序列(10个拷贝) 中度重复序列(10到几百个拷贝) 成簇 组蛋白/rRNA/tRNA 分散 高度重复序列(几百个到几百万个拷贝) 卫星 散在序列 SINE 500bp/LINE 5-7Kb,五、重叠基因 一个基因的核苷酸序列完全包含在另一个基因的核苷酸序列中 末端密码子重叠,一个基因的编码区序列完全寓居于另一个基因的间隔子序列中 以基因相反链编码,第三节 基因工程的诞生及其主要研究内容,一、基因工程的诞生 60年代末，基因分子生物学研究主要取得以下3方面 的成就： 1、物质基础 40年代 2、自我复制和传递 50年代 3、流向和表达 50年代末和60年代 应用工程技术手段改造生物的遗传特性,技术问题 分离单基因 哺乳动物/病毒 切割和连接 70年代中期，两项关键技术： DNA分子的体外切割和连接技术 核苷酸序列分析技术,Smith等分离并纯化了限制性核酸内切酶Hind II， 1972年，Boyer等相继发现了coR I 一类重要的限制性内切酶。,限制性内切酶和DNA连接酶,自我复制 载体 1972年左右 病毒、噬菌体、质粒 转化受体 E. Coli 其它技术： 琼脂糖凝胶电泳/Southern转移杂交技术,1972年，Berg 等首次成功地实现了DNA的体外重组 SV40/噬菌体 EcoR/T4 DNA连接酶,1973年，Cohen等成功地利用体外重组实现了 细菌间性状的转移 E. Coli R6-5（Km+）/pSC101（Ter+）,Cohen等的重组实验示意图,Tcr,Ner,基因工程发展史上首次实现了重组DNA的细菌转化,非洲爪蟾核糖体DNA/pSC101重要意义： 质粒分子可以作为载体 真核动物的基因可以在原核细胞中表达 质粒-E. Coli细胞是一种成功的基因克隆体系,二、基因工程的定义及其主要的研究内容 1、基因工程的概念 在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子，构成遗传物质的新组合，并使之参入到原先没有这类分子的寄主细胞内，而能持续稳定地繁殖。 外源 繁殖 gene engineering/ gene