微生物分类及微生物基本研究技术课件

第二章 微生物的分类鉴定及微生物的 基本研究技术,研究微生物的基本技术手段 微生物的分类鉴定,contents,第一节 微生物的基本研究技术,一、无菌技术 在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其它微生物污染的技术。 微生物培养的常用器具的灭菌 1. 试管、三角瓶、平皿、玻璃烧瓶等高温干热灭菌：160-180 2h 2. 培养基的灭菌湿热灭菌 ：121 15-30min 3. 接种工具 火焰灼烧 无菌操作微生物学研究中最常用的基本操作。 培养基经灭菌后，用经过灭菌的接种工具，在无菌的条件下接种含菌材料于培养基上，这一操作过程称做无菌操作。 接种的微生物不能释放到环境中，防止环境污染。,培养皿,高压蒸汽自动灭菌锅,手提式高压蒸汽灭菌锅,无菌操作箱,根据电离后所带电荷的性质，染料分为： 1、酸性染料：带负电，与碱性物质成盐。如伊红、刚果红、苯胺黑、酸性复红等 2、碱性染料：带正电，如美蓝、结晶紫、孔雀绿、番红等 3、中性染料：酸性染料和碱性染料的结合，如吉姆萨染料 4、单纯染料：这类物质亲和力低，不能和被染物成盐，染色能力取决于能否溶于被染物。,简单染色法 正染色 革兰氏染色法 鉴别染色法 抗酸性染色法 芽孢染色法 死菌 姬姆萨染色法 细菌染色法 负染色： 荚膜染色法等 活菌：用美蓝或TTC（氧化三苯基四氮唑）等作活菌染色,染色方法：简单染色法、鉴别染色法（复染色法）、负染色法,染色的基本程序,制片染色水洗干燥镜检。,涂片制备过程,显微镜是微生物研究中的不可缺少的工具。 显微技术是微生物学研究的重要技术和基础。,三、显微技术,显微镜的种类： 普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜、扫描电镜、透射电镜。,1.放大倍数=接物镜放大倍数接目镜放大倍数 2. 显微镜的分辨率 是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为： D=/2nsin(/2 ) 式中D：物镜分辨出物体两点间的最短距离。 ：可见光的波长（平均0.55m) n: 物镜和被检标本间介质的折射率。 ：镜口角（即入射角）。,（一）油镜的使用原理： 油镜的透镜很小，光线通过玻片与油镜头之间的空气时，因介质密度不同，发生折射或全反射，使射入透镜的光线减少，物象显现不清。 1. 香柏油的折射率与玻璃接近（n=1.52） ，提高了视野的照明度。 2 . 提高了显微镜的分辨率 D=/2nsin(/2 ),光学显微镜油镜的使用,（二）油镜头的识别： 各接物镜的放大率可由其外形辨认，镜头长度越大，镜片直径越小，放大倍数大；反之，放大倍数小。油镜头长度大于低、高倍镜，镜头下缘一般刻有一圈黑线或白线，并刻有100、1.25或oil等字样。 （三）油镜的使用法： 1、使用显微镜油镜时，必须将显微镜端正直立桌上，不得将镜臂弯曲，使载物台倾斜，以免香柏油流溢，影响观察，污染台面。 2、对光： 首先打开光圈，使光线集中于集光器。 一般用低倍镜或高倍镜观察物象或用油镜检查不染色标本时，需下降集光器并适当地缩小光圈，使光度减弱；若用油镜检查染色标本时，光度宜强。应将显微镜亮度开关调至最亮，光圈完全打开，集光器上升至与载物台相平。,3、调焦距： A、将标本片放载物台上，用标本推进器固定，将欲检部分移至接物镜下。先用低倍镜找出标本的位置，然后提高镜筒，在标本的待检部位滴镜油一滴，再换油镜观察。 B、转动粗调节器使载物台徐徐上升（或使镜筒渐渐下降），直至油镜头浸没至油中。此时眼睛应从侧面观察，以免压碎标本片和损坏镜头。 C、然后双眼移至接目镜，一面从接目镜观察，一面反方向缓慢地转动粗调节器（下降载物台，或上升镜筒），当出现模糊物象时，换用细调节器，转动至物象清晰为止。,D、观察完毕，应先提高镜筒，并将油镜头扭向一侧，再取下标本片。 油镜头使用后，应立即用擦镜纸擦净镜头上的油，再用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头，并随即用干的镜纸擦去残存的二甲苯，以免二甲苯渗入，溶解用以粘固透镜的胶质物，造成镜片移位或脱落,四、接种技术,接种技术是微生物学实验及研究中的一项最基本的操作技术。 接种是将纯种微生物在无菌操作条件下移植到已灭菌并适宜该菌生长繁殖所需要的培养基中。 为了获得微生物的纯种培养（指一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代），要求接种过程中必须严格进行无菌操作，一般是在无菌室内，超净工作台火焰旁或实验室火焰旁进行。,根据不同的实验目的及培养方式可以采用不同的接种工具和接种方法。 常用的工具有接种环、接种针、接种铲、玻璃涂棒，移液管及滴管等。 常用的方法有斜面接种，液体接种，穿刺接种和平板接种。,斜面接种,穿刺接种操作过程示意图,接种菌名及接种划线方式、接种工具： 细菌：如枯草杆菌，大肠杆菌，巨大芽孢杆菌 接种方式：“之”字划线，接种工具：接种环 酵母菌：如酿酒酵母菌，假丝酵母菌 接种方式：划直线，接种工具：接种环 霉菌：如黑曲霉，黄曲霉，根霉 接种方式：点植或划直线，接种工具：接种钩或接种环,各种无菌操作接种技术示意图,微生物的分离纯化技术是指从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。 分离纯化技术其实是进行平板接种，即用接种环将菌种接至平板培养基上，或用移液管、滴管将一定体积的菌液移至平板培养基上，然后培养达到。 平板接种的目的是观察菌落形态，分离纯化菌种，活菌计数及在平板上进行各种实验时采用的一种接种方法。,五、分离纯化技术,平板（培养平板）：指熔化的固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后形成培养平板。 培养物：在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物。 纯培养物：只有一种微生物的培养物。 纯培养技术：把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的培养技术。 以无菌操作方法获得纯培养是微生物学独有的技术，对微生物学的发展有非常重要的意义。,一、几个概念,二、微生物的分离纯化方法： （1）平板划线法 （2）稀释倒平板法 （3）稀释涂布法 （4）选择培养分离法 （5）单细胞挑取法 （6）利用环境条件控制法,平板划线分离操作法示意图,平板划线分离法：,平板划线菌落分离效果图,稀释倒平板法,稀释涂布法,选择培养分离法-选择培养基 利用选择培养基进行直接分离 比如：分离产蛋白酶菌株在培养基中添加牛奶或酪素，观察是否产生蛋白水解圈。,单细胞挑取法,利用环境条件控制法 温度嗜热菌、嗜冷菌 pH耐酸、耐碱微生物 渗透压耐盐、糖,二元培养： 以某种微生物的纯培养为食物（或寄主）来进行另外一种微生物的纯培养、称二元培养。,什么是微生物分类学(microbialtaxonomy):,按照微生物的亲缘关系将其安排成条理清楚的各种分类单元和分类群的科学,微生物分类的目的,把各种微生物按照它们的亲缘关系分群归类，排成系统，以便于人们对微生物进行鉴定和交流,第二节 微生物的分类鉴定,微生物分类学的主要任务,分类(classification) 即根据相似性或亲缘关系,将一个有机体放在一个单元中,命名 (nomenclature),鉴定(identification) 确定一个新的分类物是否归属于已经命名的分类单元的过程,一、微生物的分类单位,界Kingdom 门Phylum 纲Class 目Order 科Family 属Genus 种Species,种以上的系统分类单元自上而下可依次分为7个等级：,种是最基本的分类单位, 它是一大群表型特征高度相似，亲缘关系极其相近，与同属内其它种有着明显差异的菌株的总称。 现代分类学上规定种内菌株的DNA同源性70%,常用的几种分类概念,新种（species nova，sp.nov或nov sp.）是指权威性的分类、鉴定手册中从未记载过的一种新分离并鉴定过的微生物。 按国际命名法规对它命名并在规定的学术刊物上发表时，应在其学名后附上“sp. nov”符号。在新种发表前，其模式菌株的培养物就应存放在一个永久性的可靠的菌种保藏机构中，并允许研究人员取得该菌种。 新记录种,亚种(变种) 当某一个种内的不同菌株存在少数明显而稳定的变异特征或遗传性状而又不足以区分成新种时，可以将这些菌株细分成两个或更多的小的分类单元-亚种。,型(form或type) 常指亚种以下的细分。当同种或同亚种不同菌株之间的性状差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。例如抗原特征的差异分为不同的血清型。,菌株(品系)(strain): 表示任何由一个独立分离的单细胞繁殖成的纯遗传型群体及其一切后代。 菌株名称常用数字编号、字母、人名、地名等表示。如 枯草杆菌AS1.398(Bacillus subtilis AS1.398)和枯草杆菌BF7658(Bacillus subtilis BF7 658)，分别代表枯草杆菌的两个菌株(ASI.398和BF7658分别为菌株的编号)，这两个菌株， 前者可用于生产蛋白酶，后者则可用于生产-淀粉酶。,菌株与型的区别： 菌株之间不存在鉴别性特征的差异，命名不同的菌株无需分类学依据； 不同型的细菌之间存在鉴别性特征的差异，命名或鉴定不同的型必需有分类学依据。,大肠杆菌的分类地位,每一种微生物都有一个自己的专门名称。学名是国际上统一使用的名称。 以细菌为例： 物种的学名是用拉丁词或拉丁化的词组成的。在一般出版物中，学名应排斜体字，在书写或打字材料中，应在学名之下划一横线，以表示它应是斜体字母。 1.双名法（binominal nomenclature） 命名按照国际细菌命名法规, 采用林奈氏双名法。 属名 + 种名 +命名人 Escherichia coli Castellani et Chalmers 1919,二、微生物的命名,2. 三名法（trinominal nomenclature） 当某种微生物是一个亚种（subspecies，简称“subsp”）或变种(variety，简称“var”，亚种的同义词)时，学名就应按三名法拼写,该亚种名可译为：反硝化产碱杆菌氧化木糖亚种,三、微生物的分类鉴定方法,1. 经典鉴定分类法(特征分类法）,2.数值分类法（统计分类法）,3.遗传分类法,（一） 特征分类法（经典分类法） 随机地和不系统地根据一些特征进行分类。主要是形态、生理生化特征。,1、形态特征（个体和群体） 形态学特征可作为微生物分类和鉴定的重要依据之一。包括培养特征、细胞形态及其染色特性、特殊的细胞结构、运动性等等,形态学特征分 （1）细菌形态：形状、大小、排列 （2）培养特征：固体 菌落，半固体 穿刺，液体特征 （3）特殊结构：鞭毛、芽孢、荚膜、孢子 （4）染色反应：革兰、抗酸 （5）内含物：异染颗粒、伴孢晶体 （6）运动性：滑行、鞭毛泳动,2、生理生化反应 生理生化特征也是最常用的细菌分类、鉴定指标。 营养要求：碳源、氮源、营养类型 代谢产物：种类、产量、显色反应 酶：产酶种类、反应特性,3、生态学特征 相互关系、宿主种类、与氧关系等。 4、生活史，有性生殖 5、血清学反应 6、近年又发展了红外光谱，GC含量，DNA杂交等。,2. 分子与遗传方法 （1）DNA碱基组成：GC% 相同不能说明是同种，但不同则肯定不是同种。 差别10%不是同种，10%可能是同种。 （2）核酸分子杂交 亲缘关系越近，杂交百分率越高。 （3）16s rRNA寡核苷酸编目分析 水解rRNA产生一系列寡核苷酸片段，顺序分析。 近年来，采用红外、核磁、电镜等新技术越来越广泛。,3. 数值分类法（统计分类法） 根据较多特征分类，每一特征地位相同。 1、每一菌株为一操作单位，确定很多特征（5060 个） 2、比较菌株间的最大相似性 阳性和阴性符合的总和 - 100% 总的测定数-无效测定数 85%为同种，65%为同属 3、据数值绘出矩阵图并转换成树状谱。,用数理统计的方法处理细菌的各种特征，求出相似值，根据相似值大小决定细菌在分类学中的关系，并进行类群的划分。,四、微生物的快速分类鉴定方法,1、 API 细菌数值鉴定系统,Analytica Products INC的简称。法国生物- 梅里埃公司生产的细菌数值分类分析鉴定系统。约有1 000 种生化反应,可鉴定的细菌大于550 种。目前中国各级疾病预防控制机构在细菌学检验中比较多地应用了此项技术,2、Enterotube 系统,不同培养基分装不同小槽中，同步接种，培养后检测、查表、鉴定。,3、Biolog全自动或手动细菌鉴定系统,在96孔的细菌培养板上检测微生物对不同发酵性碳源利用情况进行的分类鉴定。,自动化、快速,可鉴定细菌有1140多种、酵母菌267种、目前已经可用于丝状真菌。,每个孔中含有不同的底物,菌悬液或无菌水,五、菌种鉴定手册,菌种鉴定工作三部曲 1、获得该微生物的纯培养 2、测定一系列必要的鉴定指标 3、查找权威性鉴定手册,原核生物： 伯杰氏细菌鉴定手册第8版，1973 伯杰氏系统细菌学手册第9版，1994 真菌：Ainsworth (1973)系统 酵母：Lodder分类系统,1923年以